[국내논문]$\\alpha_1$(I)및 $\\alpha_2$(I)사슬 콜라겐의 질량분석법 개발 연구 Development of mass spectrometric analysis of $\\alpha_1$(I) and $\\alpha_2$(I) chain Collagen원문보기
포유동물에서 중요한 구조단백질인 콜라겐은 다양한 조직내 단백질 조성과 사슬간 복잡한 가교결합의 존재로 인해 그 구조가 복잡하고 다양하여, 직접적으로 분석할 적당한 방법이 없었다. 본 연구에서는 간단한 전처리만으로 다수의 생체분자 시료에 대해 정확한 분자량 측정이 가능한 매트릭스 보조 레이저 탈착/이온화 비행시간 질량분석법(MALDI-TOF MS)을 이용하여 콜라겐과 조각화된 콜라겐을 분석하고 이의 아미노산 서열을 사중극자-비행시간 직렬 질량분석법(Q-TOF MS/MS)으로 확인하여, 시료 중의 콜라겐의 종류에 대한 정보를 확인하여, MALDI-TOF 질량분석을 이용한 콜라겐 분석에서 콜라겐의 종류를 쉽게 예측할 수 있는 방법을 제시하고자 하였다. 쥐의 꼬리에서 분리한 콜라겐을 SDS-PAGE로 분리한 결과 10개의 band를 얻을 수 있었는데, 같은 시료를 MALDI-TOF MS로 확인하여 각 band의 정확한 분자량을 결정할 수 있었다. SDS-PACE상의 10개의 분리된 band에 대해 각각 tryptic digestion후 MALDI-TOF 질량분석을 수행한 결과 4개의 band에서 type I 콜라겐의 $\alpha_1$-chain내의 fragment인 Gly1056-Arg1073을 확인할 수 있었고, 5개의 band에서 type I 콜라겐의 $\alpha_2$-chain내의 fragment인 Gly985-Arg1002을 확인하였다. 잔재한 콜라겐의 가교결합으로 인해 예상되는 fragment중 둘만이 확인되었지만, 확인된 fragment를 통해 적어도 7개의 band에서는 type I콜라겐이 존재함을 확인할 수 있었다. 확인된 두 콜라겐 flagment의 아미노산 서열을 Q-TOF MS/MS로 분석한 결과 MALDI-TOF MS에서의 예측과 일치함을 확인할 수 있었으며, 이를 통해 확인된 두 fragment에 의한 peak을 지문으로 하여 MALDI-TOF MS측정시에 시료내의 type I 콜라겐의 존재를 쉽게 확인할 수 있음을 볼 수 있었다.
포유동물에서 중요한 구조단백질인 콜라겐은 다양한 조직내 단백질 조성과 사슬간 복잡한 가교결합의 존재로 인해 그 구조가 복잡하고 다양하여, 직접적으로 분석할 적당한 방법이 없었다. 본 연구에서는 간단한 전처리만으로 다수의 생체분자 시료에 대해 정확한 분자량 측정이 가능한 매트릭스 보조 레이저 탈착/이온화 비행시간 질량분석법(MALDI-TOF MS)을 이용하여 콜라겐과 조각화된 콜라겐을 분석하고 이의 아미노산 서열을 사중극자-비행시간 직렬 질량분석법(Q-TOF MS/MS)으로 확인하여, 시료 중의 콜라겐의 종류에 대한 정보를 확인하여, MALDI-TOF 질량분석을 이용한 콜라겐 분석에서 콜라겐의 종류를 쉽게 예측할 수 있는 방법을 제시하고자 하였다. 쥐의 꼬리에서 분리한 콜라겐을 SDS-PAGE로 분리한 결과 10개의 band를 얻을 수 있었는데, 같은 시료를 MALDI-TOF MS로 확인하여 각 band의 정확한 분자량을 결정할 수 있었다. SDS-PACE상의 10개의 분리된 band에 대해 각각 tryptic digestion후 MALDI-TOF 질량분석을 수행한 결과 4개의 band에서 type I 콜라겐의 $\alpha_1$-chain내의 fragment인 Gly1056-Arg1073을 확인할 수 있었고, 5개의 band에서 type I 콜라겐의 $\alpha_2$-chain내의 fragment인 Gly985-Arg1002을 확인하였다. 잔재한 콜라겐의 가교결합으로 인해 예상되는 fragment중 둘만이 확인되었지만, 확인된 fragment를 통해 적어도 7개의 band에서는 type I콜라겐이 존재함을 확인할 수 있었다. 확인된 두 콜라겐 flagment의 아미노산 서열을 Q-TOF MS/MS로 분석한 결과 MALDI-TOF MS에서의 예측과 일치함을 확인할 수 있었으며, 이를 통해 확인된 두 fragment에 의한 peak을 지문으로 하여 MALDI-TOF MS측정시에 시료내의 type I 콜라겐의 존재를 쉽게 확인할 수 있음을 볼 수 있었다.
Collagen is the important structural proteins in mammals with various peptide composition and cross-linkings. The direct analysis of collagen protein was not suitable because of its structural complexity and diversity. In this study, we suggest the simple way of collagen analysis by introducing matr...
Collagen is the important structural proteins in mammals with various peptide composition and cross-linkings. The direct analysis of collagen protein was not suitable because of its structural complexity and diversity. In this study, we suggest the simple way of collagen analysis by introducing matrix-assisted laser desorption/ionization time-of flight mass spectrometry (MALDI-TOF MS) to identify the collagen and its trypsin-digested fragments, and by subsequent time-of-flight tandem mass spectrometry(Q-TOF MS/MS) to analyze the amino acid sequences of identified fragments. Using the collagen samples extracted from the tail of mouse, 10 separated bands were found in SDS-PAGE, and the masses of most bands could be more finely determined by MALDI-TOF MS. When each 10 separated proteins was tryptic digested and introduced to MALDI-TOF, the Gly1056-Arg1073 fragment from $\alpha_1$-chain was identified in four bands, and the Gly1056-Arg1073 fragment from $\alpha_2$-chain was identified in five bands, both in type I collagen. Although few fragments were found because of the cross-linkings left in digested collagen sample, it could be determined that the type I collagen existed at least in 7 separated bands. When the amino acid sequences of two identified fragments were analyzed by Q-TOF MS/MS, both sequences were identical with those determined by MALDI-TOF MS. It suggested that the two peaks in MALDI-TOF MS caused by the fragments identified in this work could be used as the fingerprint to simply identify type I collagen in protein samples.
Collagen is the important structural proteins in mammals with various peptide composition and cross-linkings. The direct analysis of collagen protein was not suitable because of its structural complexity and diversity. In this study, we suggest the simple way of collagen analysis by introducing matrix-assisted laser desorption/ionization time-of flight mass spectrometry (MALDI-TOF MS) to identify the collagen and its trypsin-digested fragments, and by subsequent time-of-flight tandem mass spectrometry(Q-TOF MS/MS) to analyze the amino acid sequences of identified fragments. Using the collagen samples extracted from the tail of mouse, 10 separated bands were found in SDS-PAGE, and the masses of most bands could be more finely determined by MALDI-TOF MS. When each 10 separated proteins was tryptic digested and introduced to MALDI-TOF, the Gly1056-Arg1073 fragment from $\alpha_1$-chain was identified in four bands, and the Gly1056-Arg1073 fragment from $\alpha_2$-chain was identified in five bands, both in type I collagen. Although few fragments were found because of the cross-linkings left in digested collagen sample, it could be determined that the type I collagen existed at least in 7 separated bands. When the amino acid sequences of two identified fragments were analyzed by Q-TOF MS/MS, both sequences were identical with those determined by MALDI-TOF MS. It suggested that the two peaks in MALDI-TOF MS caused by the fragments identified in this work could be used as the fingerprint to simply identify type I collagen in protein samples.
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문제 정의
본 연구에서는 콜라겐의 분석 및 확인에 MALDI-TOF MS를 도입하고자 하였다. 쥐의 꼬리로 부터 얻은콜라겐 섬유에서 콜라겐을 분리한 후 gel 상에서 분자량 별로 분리하였다.
분리된 각각의 띠들을 채취한 후 trypsin을 이용한 digestion을 수행하여 MALDI-TOF MS 스펙트럼 상에서 digested fragment들을 분석하고, 확인된 fragment들에 대해 Q-TOF MS/MS를 사용하여 각각의 아미노산 서열을 분석하였다. 이를 통해 시료 중의 콜라겐의 종류에 대한 정보를 확인하고, 콜라겐분석에서 MALDI-TOF 질량분석을 통해 a-chain의 종류 확인 및 이에 따른 시료 콜라겐의 종류를 쉽게 예측할 수 있는 방법을 제시하고자 하였다.
큰 생체분자에 대해서 정확한 분자량 정보를 제공할 수 있고, 간단한 전처리만으로 다수의 시료분석이 가능한 MALDI-TOF MS를 이용하여 콜라겐 시료의 구조를 쉽게 확인할 수 있는 방법을 제시하고자 하였다. 쥐의 꼬리에서 추출한 콜라겐 시료를 SDS-PAGE로 분리했을 때 10개의 band로 나누어지는 것을 확인할 수 있었는데, 동일한 콜라겐 시료를 MALDI-TOF MS로 분석한 결과 SDS-PAGE에서의 band와 질량이 일치히는 6개의 peak를 얻을 수 있었으며, 이들 단백질 분자들의 정확한 질량을 확인할 수 있었다.
제안 방법
MALDI-TOF MS 상에서 type I collagen 중의 서열로 확인된 두 fragment들에 대해 fragment의 아미노산 서열을 확인 . 검증하기 위하여, Q-TOF MS/MS 분석을 통해 GlylO56-ArglO73으로 확인된 如gment와 Gly985-Argl002 로 확인된 fragment의 서열을 확인하였으며, 그 결과를 그림 8과 그림 9에 나타내었다.
확인 . 검증하기 위하여, Q-TOF MS/MS 분석을 통해 GlylO56-ArglO73으로 확인된 如gment와 Gly985-Argl002 로 확인된 fragment의 서열을 확인하였으며, 그 결과를 그림 8과 그림 9에 나타내었다.
5분간 소독하였다. 꼬리를 150 mm petri dish에 놓고서 연골도를 써서 꼬리 끝에서부터 10 mm 간격으로 피부를 절개하였다. 상방으로 꼬리끝을 끌어 올리면 콜라겐 섬유가 따라 올라온다.
쥐의 꼬리로 부터 얻은콜라겐 섬유에서 콜라겐을 분리한 후 gel 상에서 분자량 별로 분리하였다. 분리된 각각의 띠들을 채취한 후 trypsin을 이용한 digestion을 수행하여 MALDI-TOF MS 스펙트럼 상에서 digested fragment들을 분석하고, 확인된 fragment들에 대해 Q-TOF MS/MS를 사용하여 각각의 아미노산 서열을 분석하였다. 이를 통해 시료 중의 콜라겐의 종류에 대한 정보를 확인하고, 콜라겐분석에서 MALDI-TOF 질량분석을 통해 a-chain의 종류 확인 및 이에 따른 시료 콜라겐의 종류를 쉽게 예측할 수 있는 방법을 제시하고자 하였다.
상방으로 꼬리끝을 끌어 올리면 콜라겐 섬유가 따라 올라온다. 이를 절단하여 다른 petri dish에 들어있는 0.1% acetic acid에 담갔으며, 이 과정을 반복하여 콜라겐 섬유를 모았다. 한 마리에서 나온 콜라겐(50~70 mg)을 100 ml acetic acid이 든 병에 옮긴 다음 4℃에서 magnetic stirrer로 24시간 교반 하였다.
쥐의 꼬리에서 분리한 콜라겐을 SDS sample buffer 에 녹이고 100℃에서 3분간 끓인 후 시료를 loading 하기 위한 5% stacking gel과 sample를 분자량별로 분리하기 위한 6% separating ge로 이루어진 discontineous gel에 standard marker와 4℃에서 저장한 sample collagen 를 각각 15 以씩 loading하였다. Standard marker로는 myosin(206, 676 Da), 0-galactosidase(l 15, 757 Da), Bovine serum albumin(98, 003)Da, Ovalbumin(54, 604 Da), Carbonic anhydrase(37, 390 Da), Soybean trypsin inhibitor(29, 559 Da), Lysozyme(20, 336 Da), Aprotinin (7, 036 Da)를 사용하였다.
대상 데이터
MALDI-TOF MS 장치는 Voyager DE-STR(Pereeptive Biosystems, USA)를 사용하였으며, Q-TOF MS/MS 장치는 JMS-HX110A(Jeol, Japan)을 사용하였다. 광원은 337 nm의 N2 레이저를 사용하였으며, 가속전압은 25 kV, 격자전압은 90%, 유도선 전압은 0.
A)에서 구입하였다. Trypsin(sequencing grade modified), Standard marker(SDS-PAGE standards, High Range)는 Bio-Rad(USA)사에서 구입하였다. 용매 Methanol, acetic acid glacial, acetonitrile(ACN)은 고순도 용매를 사용하였다.
광원은 337 nm의 N2 레이저를 사용하였으며, 가속전압은 25 kV, 격자전압은 90%, 유도선 전압은 0.3%였다. 질량측정 시 보정은 외부 보정법을 사용하였으며, 108 kDa 분자량 범위에서 약 0.
사용하였다. 본 연구에서 사용한 Acrylamide, N, N'-methylene-bis-acrylamide, Ammonium persulfate, Tris (Trizma base), Sodium dodecyl sulfote(SDS), Dithio-threitol(DTT), TEDED, Tris Buffer, Bromophenol blue, Coomassie Brilliant blue R 250, Ammonium bicarbonate(ABC), Trifluoroacetic acid(TFA), Glycine, Formic acid(FA)는 Sigma(U.S.A)에서, sinapinic acid (SA) 은 Aldrich(U.S.A)에서 구입하였다. Trypsin(sequencing grade modified), Standard marker(SDS-PAGE standards, High Range)는 Bio-Rad(USA)사에서 구입하였다.
본 연구에서는 쥐의 꼬리에서 추출 및 정제한 콜라겐을 사용하였다. 본 연구에서 사용한 Acrylamide, N, N'-methylene-bis-acrylamide, Ammonium persulfate, Tris (Trizma base), Sodium dodecyl sulfote(SDS), Dithio-threitol(DTT), TEDED, Tris Buffer, Bromophenol blue, Coomassie Brilliant blue R 250, Ammonium bicarbonate(ABC), Trifluoroacetic acid(TFA), Glycine, Formic acid(FA)는 Sigma(U.
Trypsin(sequencing grade modified), Standard marker(SDS-PAGE standards, High Range)는 Bio-Rad(USA)사에서 구입하였다. 용매 Methanol, acetic acid glacial, acetonitrile(ACN)은 고순도 용매를 사용하였다.
이론/모형
3%였다. 질량측정 시 보정은 외부 보정법을 사용하였으며, 108 kDa 분자량 범위에서 약 0.05~0.1%의 오차범위 이내에 있었다.
성능/효과
이는 질량 스펙트럼을 분리된 각각의 콜라겐 사슬이 조 각화된 것을 전제로 한 예상되는 fragment와 비교하기 어렵게 만들며, 이로 인해 확인되는 digested fragment 의 수가 감소되는 것으로 예상할 수 있다. 10개의 분리된 barmd에서 확인된 fragment가 전체 예측가능한 fragment 중 1.5%에 해당한다는 것은 아직 분리된 콜라겐 내에 가교결합이 많이 남아있음을 예상할 수 있는데, 그럼에도 불구하고 SDSTAGE상에서 확인된 1, 2, 4, 5, 7, 8, 9의 band들에서 type I collagen의 %-chain과 a2-chain 으로부터 예상되는 fragment들이 확인되었다는 것은, 적어도 이들 7개의 분리된 단백질은 type I 콜라겐으로이루어져 있음을 확인할 수 있으며, type I 콜라겐을 MALDI-TOF MS로 분석할 때에 위의 두 f* ragment 스펙트럼상의 지문(fingerprint)로 사용하여 간편하게 확인할 수 있음을 볼 수 있었다.
5%만이 확인되었지만, 두 확인된 fragment를 통해 SDS-PAGE에서 분리된 단백질 중 적어도 7개에서 type I 콜라겐이존재함을 확인할 수 있었다. MALDI-TOF MS에서 예측값과의 비교로써 확인된 두 fragment의 아미노산 서열을 Q-TOF MS/MS로 확인한 결과 MALDI-TOF MS 분석결과와 동일한 서열분석 결과를 확인할 수 있었으며, 이를 통해 쥐의 꼬리에서 추출한 콜라겐에 type I collagen이 포함되어 있음을 확인함과 동시어〕, 이 두 digested fragment에 의한 MALDI-TOF MS 스펙트럼상에서의 peak가 type I collagen 확인시의 지문으로- 사용될 수 있음을 확인할 수 있었다.
쥐의 꼬리에서 추출한 콜라겐 시료를 SDS-PAGE로 분리했을 때 10개의 band로 나누어지는 것을 확인할 수 있었는데, 동일한 콜라겐 시료를 MALDI-TOF MS로 분석한 결과 SDS-PAGE에서의 band와 질량이 일치히는 6개의 peak를 얻을 수 있었으며, 이들 단백질 분자들의 정확한 질량을 확인할 수 있었다. SDS-PAGE로 분리된 10개의 각 band에 대해 tryptic digestion을 수행한 후 MALDI-TOF MS로 확인한 결과, 4개의 band에서 type 1 콜라겐의 %-chaha에 해당하는 GlylO56-ArglO73 fragment를 확인할 수 있었고, 5개의 band에서 a2-chain에 해당하는 Gly985-Argl002 fragment# 확인할 수 있었다. 콜라겐 사슬간에 존재하는 가교결합으로 인해 예측되는 type I 콜라겐의 fragment 중 1.
6484 는 band 10에 해당됨을 볼 수 있다. 그러므로 MALDI-TOF MS 스펙트럼에서는 쥐의 꼬리에서 추출한 콜라겐을 분석한 결과 SDS-PAGE에서 확인된 총 10개의 band 증 60%에 해당하는 6개의 일치되는 많은 단백질을 확인할 수 있었다. 또한 standard marker와의 비교에 의해 대략적 분자량을 산출했던 SDS-PAGE에 비해 MALDI-TOF MS 결과에서는 각 단백질에 대해 매우 정확한 분자량 정보를 확인할 수 있음을 볼 수 있었다.
그러므로 MALDI-TOF MS 스펙트럼에서는 쥐의 꼬리에서 추출한 콜라겐을 분석한 결과 SDS-PAGE에서 확인된 총 10개의 band 증 60%에 해당하는 6개의 일치되는 많은 단백질을 확인할 수 있었다. 또한 standard marker와의 비교에 의해 대략적 분자량을 산출했던 SDS-PAGE에 비해 MALDI-TOF MS 결과에서는 각 단백질에 대해 매우 정확한 분자량 정보를 확인할 수 있음을 볼 수 있었다.
아울러 낮은 질량 영역에서 발견되는 충돌에 의해 각 아미노산의 이모늄이온(immoniiim ion)으로 분리된 단량체들의 확인된 질량을 같이 나타내었다. 이 Q-TOF MS/MS 결과를 볼 때, 그림 8에서의 스펙트럼 및 이의 분석결과는 type I 콜라겐 내 %-chain에 속하는 fragment인 GETGPAGPAGPIGPAGAR의 서열과 일치하는 것을 확인할 수 있었으며, 그림 9에서의 결과에서는 type I 콜라겐 내 CQ-chais에 속하는 fragment인 GEPGPA-GSVGPVGAVGPR의 서열과 일치함을 확인힐, 수 있었는더L 이는 MALDI-TOF MS 분석에서의 peak을 예상된 fragment들과 비교하여 확인되었된 두 서 열의 예측과 일치하고 있다. 이를 통해 쥐의 꼬리에서 추출된콜라겐이 type I 의 구조를 포함하고 있음을 확인할 수 있었고, 따라서 MALDI-TOF MS에서 확인된 a, -chain 내의 Glyl056-Argl073과(/-chain 내의 Gly985-Argl002 의 fragment에 해당하는 peak로서 type I collagen을 쉽게 확인할 수 있음을 검증할 수 있었다.
그리고 band 3, 6, 10에 대한 질량분석 스펙트럼에서는 콜라겐 아미노산의 fragment 서열에 해당되는 peak를 확인할 수 없었다. 이들 각 band에서 얻은 스펙트럼 peak들의 분석을 종합하면 1, 2, 4, 7의 band에서는 콜라겐의 g-chain으로부터 예상되는 fragment인 Glyl056-Argl073 서열(*)이 확인되었고, 1, 4, 5, 8, 9의 band로부터는 콜라겐의 aechain 으로부터 예상되는 Gly985-Argl002 fragment(**)7|-확인되었다.
또한 band 10은 매우 희미하게 확인되어 분자량을 결정하기 어려웠다. 이를 볼 때 SDS-PAGE를 이용한 콜라겐 시료의 분석은 시료 내 분자들의 각 분자량에 따른 분리는 비교적 수월하나, 정확한 분자량에 대한 정보를 확인하기 어려움을 확인할 수 있었다. 동일한 콜라겐 시료를 m/z 10, 000-250, 000 범위에서 MALDI-TOF MS로 확인한 스펙트럼을 그림 2에 나타내었다.
이 Q-TOF MS/MS 결과를 볼 때, 그림 8에서의 스펙트럼 및 이의 분석결과는 type I 콜라겐 내 %-chain에 속하는 fragment인 GETGPAGPAGPIGPAGAR의 서열과 일치하는 것을 확인할 수 있었으며, 그림 9에서의 결과에서는 type I 콜라겐 내 CQ-chais에 속하는 fragment인 GEPGPA-GSVGPVGAVGPR의 서열과 일치함을 확인힐, 수 있었는더L 이는 MALDI-TOF MS 분석에서의 peak을 예상된 fragment들과 비교하여 확인되었된 두 서 열의 예측과 일치하고 있다. 이를 통해 쥐의 꼬리에서 추출된콜라겐이 type I 의 구조를 포함하고 있음을 확인할 수 있었고, 따라서 MALDI-TOF MS에서 확인된 a, -chain 내의 Glyl056-Argl073과(/-chain 내의 Gly985-Argl002 의 fragment에 해당하는 peak로서 type I collagen을 쉽게 확인할 수 있음을 검증할 수 있었다.
쥐의 꼬리에서 추출한 콜라겐 시료를 SDS-PAGE로 분리했을 때 10개의 band로 나누어지는 것을 확인할 수 있었는데, 동일한 콜라겐 시료를 MALDI-TOF MS로 분석한 결과 SDS-PAGE에서의 band와 질량이 일치히는 6개의 peak를 얻을 수 있었으며, 이들 단백질 분자들의 정확한 질량을 확인할 수 있었다. SDS-PAGE로 분리된 10개의 각 band에 대해 tryptic digestion을 수행한 후 MALDI-TOF MS로 확인한 결과, 4개의 band에서 type 1 콜라겐의 %-chaha에 해당하는 GlylO56-ArglO73 fragment를 확인할 수 있었고, 5개의 band에서 a2-chain에 해당하는 Gly985-Argl002 fragment# 확인할 수 있었다.
SDS-PAGE로 분리된 10개의 각 band에 대해 tryptic digestion을 수행한 후 MALDI-TOF MS로 확인한 결과, 4개의 band에서 type 1 콜라겐의 %-chaha에 해당하는 GlylO56-ArglO73 fragment를 확인할 수 있었고, 5개의 band에서 a2-chain에 해당하는 Gly985-Argl002 fragment# 확인할 수 있었다. 콜라겐 사슬간에 존재하는 가교결합으로 인해 예측되는 type I 콜라겐의 fragment 중 1.5%만이 확인되었지만, 두 확인된 fragment를 통해 SDS-PAGE에서 분리된 단백질 중 적어도 7개에서 type I 콜라겐이존재함을 확인할 수 있었다. MALDI-TOF MS에서 예측값과의 비교로써 확인된 두 fragment의 아미노산 서열을 Q-TOF MS/MS로 확인한 결과 MALDI-TOF MS 분석결과와 동일한 서열분석 결과를 확인할 수 있었으며, 이를 통해 쥐의 꼬리에서 추출한 콜라겐에 type I collagen이 포함되어 있음을 확인함과 동시어〕, 이 두 digested fragment에 의한 MALDI-TOF MS 스펙트럼상에서의 peak가 type I collagen 확인시의 지문으로- 사용될 수 있음을 확인할 수 있었다.
그림 1에서 Lane Ie standard marker에 의한 띠들이고, lane Ⅱ에 콜라겐시료의 분리된 띠들을 나타내었다. 콜라겐의 분리 결과 총 10개의 띠들을 확인할 수 있었는데, 이들의 분자량을 standard marker와 비교한 결과 각각 약 220 kDa, 95 kDa, 65 kDa, 47 kDa, 33 kDa, 30 kDa, 27 kDa, 25 kDa, 20 kDa, 10 kDa 해당됨을 볼 수 있었다. 그러나
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