[논문]ICSI에 의한 돼지 수정란의 발달 I. 난자의 활성화와 정자의 수정능력 획득 유기 효과

문승주; 안승주; 강만종; 김광현

ICSI에 의한 돼지 수정란의 발달 I. 난자의 활성화와 정자의 수정능력 획득 유기 효과
Development of Porcine Embryos Following Intracytoplasmic Sperm Injection I. Effect of Activation and Sperm Capacitation 원문보기

韓國受精卵移植學會誌 = Korean journal of embryo transfer, v.20 no.3, 2005년, pp.201 - 206

문승주 (전남대학교 농업생명과학대학 농업과학기술연구소 동물자원학부) , 안승주 (전남대학교 농업생명과학대학 농업과학기술연구소 동물자원학부) , 강만종 (전남대학교 농업생명과학대학 농업과학기술연구소 동물자원학부) , 김광현 (전남대학교 농업생명과학대학 농업과학기술연구소 동물자원학부)

초록
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본 연구는 ICSI후 돼지 난자의 활성화 처리와 ICSI전 주입정자의 수정 능력 획득 유기효과를 구명하기 위하여 실시하였다. ICSI후 ethanol, cycloheximide 그리고 ethanol과 cycloheximide를 병용처리 시 난할율과 배반포배 발달율이 대조구와 처리 구간에 유의적인 차이가 없었다(p<0.05). 그러나 ICSI전 caffeine과 Ca-ionpphre로 주입정자의 수정능력 획득 유기 처리 시 난할율과 배반포배발달율 모두 처리구에서 유의적으로 놓았다(p<0.05). 한편 ICSI후 난자활성화처리 시 전핵형성율과 총 난자 활성화율은 대조구와 처리구간에 유의차가 없었지만(p<0.05) 정자의 수정능력 획득 유기 처리 시 전핵형성율과 총 난자 활성화율은 처리구에서 유의적으로 높게 나타났다(p<0.05).

Abstract ▼ AI-Helper

This study was conducted to investigate the effects of oocyte activation after ICSI and of capacitation of insemination sperm before ICSI in Swine. There was no significant difference on cleavage rate and blastocyst developmental rate treated with ethanol, cycloheximide, or ethanol and cycloheximide jointly between treatment and control groups. However, significantly difference was found on cleavage rate and blastocyst developmental rate treated with caffeine and Ca-ionophore on capacitation of insemination sperm before ICSI (p<0.05). There was no significant difference on pronuclear formation rate and total oocyte activation rate treated with oocyte activation after ICSI between treatment and control groups, but was significant difference on pronuclear formation rate and total oocyte activation rate treated with capacitation treat of sperm (p<0.05).

주제어

AI 본문요약
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문제 정의

따라서 본 연구는 ICSI에 의한체외수정란의 생산효율을 증진시키기 위하여 돼지체외 성숙난자의 세포질 내 정자 주입 후난자의 활성화 효과와 세포질주입 전정자처리 효과를 조사하였다.
본 연구는 ICSI후 돼 지 난자의 활성화 처리와 ICSI전 주 입정자의 수정능력 획득 유기 효과를 구명하기 위하여 실시하였다. ICSI후 ethanol, cycloheximide 그리고 ethanol과 cycloheximide를 병용 처리 시난할율과 배반포 배 발 달율이 대조구와 처리 구간에 유의적인 차이가 없었다3<0.

제안 방법

44시간 체외성숙된 난자는 0.1% hyaluronidase 가 첨가된 D-PBS 배양액으로 vortexing후 제1극 체가 선명하고 세포질이 균일한 성숙난자만을 선별 사용하였다. 세포질 내 정자 주입은 micromani- pulator(Narishige Co, Japan)를 이용하였으며 injection pipettee 내경 6~7 μm, 외경 8~9 μm, holding pipettee 내경 10~15μm, 외경 100~120μm로 제작 사용하였다.
ICSI 후에 10% ethanoK 포함하는 15% FBS가 함유된 TCM-199 배양액에서 10분간 처리와 5μg/mL cycloheximide을 포함하는 배양액에서 6시간 단독 또는 병용처리하였다.
ICSI후 0.4% BSA가 함유된 Whitten's 배양액 에 옮겨 CO2 배양기(39℃, 5% CO2)에 배양 체외배발 달 성적을 조사하였다.
맨손 채취법으로 채취한 정액은 동량의 BSA- saline과 혼합 200g에서 3분간 원심분리 후 상층액은 동량의 BSA-saline과 혼합 1200g에서 3분간 2~3회 원심분리 하에 세정하였다. 세정 후 10mM caffbine과 100//m Ca-ionophore가 첨가된 TCM-199 배양액과 혼합 CO 배양기(39℃, 5% CO2)에서 각각 2시간과 15분 동안 배양수정능획득을 유기하였다.
세포질 내 정자 주입은 micromani- pulator(Narishige Co, Japan)를 이용하였으며 injection pipettee 내경 6~7 μm, 외경 8~9 μm, holding pipettee 내경 10~15μm, 외경 100~120μm로 제작 사용하였다. 정자주입 시 정자운동성을 저하시키기 위하여 10% PVP가 첨가된 D-PBS drop에서 정자꼬리를 먼저 injection pipette으로 흡인하여 0.4% BSA가 첨가된 난자용 D-PBS drop으로 이동시킨 후 성숙난자의 제1극체가 6시 또는 12시 방향으로 향하도록 holding pipette으로 고정시킨 후 난자의 적도 부근 약간 아래(4시 방향)에서 난 자세 포질 내에 injection pipette을 진입 세포질 내용물을 약 간 흡인 후 정자를 세포질 내로 진입시켰다.

대상 데이터

난포란의 체외성숙은 15%의 fetal bovine serum (FBS, Hyclon, USA)가 함유된 Whitten's 배양액을 사용하였다. 선별된 난포란을 PMSG 10IU/μL의 호르몬이 첨가된 배양액을 pH 7.
본 실험에 공시된 난소는 도축장에서도살된 돼지 중 정상 생식기를 가진 암퇘지로부터 난소를 적출, 35℃, 0.9%의 생리식염수에 보존하여 실험실로 운반한 후 18-guage주사기를 이용직경 3~6mm 난포로부터 난포액을 흡입하여 난포란을 채취하였다. 채취된 난포란은 실체현미경(Nikon, Japan)하 에서 난구세포의 치밀도에 따라 다음과 같이 판정하였다.

데이터처리

본 연구 결과 얻어진 자료는 SAS package를 이용 분산 분석을 실시하였으며 처리간 유의성검정 은 LSD방법으로 검정하였다.

성능/효과

돼지 체외 성숙 난자에 정자 주입 후 ethanol과 cycloheximide 단독 처리오+ ethanol과 cycloheximi- de를 병용 처리, 그리고 정자 주입 없이 활성화 처리한 후난할율과 체외 배양 7일째의 체외배발 달 성적은 Table 1과 같다. ICSI 후 활성화 처리하지 않은 경우 난할율은 573%를 보였고 ethanol, cycloheximide 단독 및 병용처리 시 58.0%에서 61.8% 그리고 정자 주입 없이 활성화 처리 시 난할율이 56.1%로 통계적인 유의차가 없었다3<0.05). 또한 7일째 조사된 체외배발달 성적은 활성화 처리 시 배반포 발 달율이 22.
난자의 활성화 처리와 세포질 내 주입 전 정자의 전처리가 ICSI후 전핵 형성율에 미치는 효과는 Table 3과 4에 제시하였다. ISCI 후 2개의 전핵 형성과 2개의 극체가 형성되었을 때 정상적인 수정으로 판단하는데, Table 3에 제시한 바와 같이 정자 주입 없이 난자를 활성화 처리했을 때 2PN 형성율이 13.3%인 반면 ICSI 후난자의 활성화 처리구에서 50.0%에서 58.5%의 2PN 형성율을 보여 통계적인 유의차(?<0.05)가 인정되었으나 무처리구에서 50.8%의 형성율을 보여 ICSI후 난자의 활성화처리구와 무처리 구간에는 유의차가 없었으며(p<0.05) 총 활성난 자율 또한 63.3%에서 72.3%로 유의차가 없었다 (p<0.05). 이러한 결과는 정자 주입 없이 난자를 활성화 처리했을 때 배반포배발 달 율이 0%로 ICSI 후 활성화 처리 구보다 무처리구에서 유의적으로 3<0.
05). 그러나 ICSI전 caffeine과 Ca-ionpphre로 주입정자의 수정 능력 획득 유기 처리 시난할율과 배반포배발 달율 모두 처리구에서 유의적으로 놓았다(p<0.05). 한편 ICSI후 난자활성화 처리 시 전핵 형성율과 총 난자 활성화율은 대조구와 처리 구간에 유의차가 없었지만(p<0.
05). 또한 7일째 조사된 체외배발달 성적은 활성화 처리 시 배반포 발 달율이 22.0%, 20.7% 그리고 25.5%로 처리하지 않을 경우의 20.3%와 비교할 때 통계적인 유의차가 없었다(p<0.05). 이러한 결과는 Chung 등(2000)이 ionomycin 단독 처리와 ionomycin과 DMAP 병용 처리시 병용처리구에서 난 할율과 배발달율이 유의적으로 높았다8<0.
05). 또한 배발달율은 caffeine처리 와 Ca- ionophore처리에서 각각 33.3%와 37.3%로 대조구의 21.6%보다 유의적으로 높았다. Galli 등(2003)은 체외성숙된 소난자의 세포질 내 2mM DTT로 전처리된 정자를 주입한 결과 배반포발달율이 배양 7일째 21.
05) 낮게 나타난 Table 1의 결과를 뒷받침하고 있다고 생각된다. 이와는 달리 주입 전 정자의 전처리 결과는 Table 4에서 보는 바와 같이 2PN 형성율이 무처리구에서 52.5%인 반면 caffeine과 Ca-ionophore 처리구에서 각각 62.5 %와 70.0%로 유의차(p<0.05)를 보였으며, 총 난자의 활성화율에서도 유의차를 보였다 (p< 0.05).이러한 본 연구의 결과는 김 등(1998)의 ICSI 정상 수정율이 52-56% 정도였다고 보고한 결과와 유사한 경향을 보였으며 Galli 등(2003)이 ICSI 후 난자 활성화 처리 시 총 난자 활성화율이 처리 간에 차이가 없었다고 한 결과와 일치하는 경향을 보였다.
난자의 세포질 내 주입할 정자를 caffeine과 Ca-ionophore로 수정능력 획득을 유기한 후 ICSI 결과는 Table 2와 같다. 정자 주입 후 48시간째 난할율은 caffeine 처리시 60.0%, Ca-ionophore 처리시 63.8%로 대조구의 46.2%에 비하여유의적으로 높았다0<0.05). 또한 배발달율은 caffeine처리 와 Ca- ionophore처리에서 각각 33.
05). 한편 ICSI후 난자활성화 처리 시 전핵 형성율과 총 난자 활성화율은 대조구와 처리 구간에 유의차가 없었지만(p<0.05) 정자의 수정 능력 획득 유기 처리 시 전핵형성율과 총 난자 활성화율은 처리구에서 유의적으로 높게 나타났다 3<0.05).

후속연구

이상의 결과들.을 종합해 볼 때, ICSI후 체외 배발달 효율을 높이기 위하여 난자의 활성화 처리는 큰 효과를 기대할 수 없으리라 사료되며 주입 전정자의 처리는 정상수정율이 높아지고, 난할율과 배반포 배 발 달율의 향상을 가져올 수 있으리라 생각된다.

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저자의 다른 논문 :

표제어: PCR

동의어: Packet Collision Rate

용어 설명 출처 목록 (6)

용어 설명: PCR은 세균 특이성이 있는 primer를 이용하여 적은 수의 세균이 있을지라도 쉽게 검출할 수 있는 유용한 방법이며, 이를 이용하여 구강 내 치면세균막이나 타액에서 직접 세균을 검출할 수 있게 되었다[8].

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