[논문]난자의 형태, 번식주기, 배양시간 및 활성화 처리가 개 난자의 체외수정후 발생에 미치는 영향에 관한 연구

이동수; 김상근

난자의 형태, 번식주기, 배양시간 및 활성화 처리가 개 난자의 체외수정후 발생에 미치는 영향에 관한 연구
Effects of Morphology, Reproductive Cycle, Incubation Time and Activation of Oocytes on Developmental Rate of Embryos Fertilized in vitro 원문보기

韓國受精卵移植學會誌 = Korean journal of embryo transfer, v.18 no.1, 2003년, pp.27 - 33

초록
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본 연구는 소형 개의 불임 해결과 체외수정란을 생산하기 위한 방안의 하나로써 난자의 형태, 번식주기, 배양시간 및 활성화 처리가 난포란의 체외성숙 및 체외발생에 미치는 영향을 조사하였다. 1. 신선, salt 및 4$^{\circ}C$에 보존한 난소로부터 채취한 난구세포부착 난자와 나화 난자로 각각 체외수정시켰을 때 16세포기로의 발생율은 14.3%, 5.0% 및 7.5%, 2.8%, 5.7% 및 0.0%로써 난구세포 부착난자군의 체외발생율이 나화 난자군에 비해 높게 나타났다. 2. 발정주기를 inactive, follicular, luteal 단계로 구분하여 채취한 난포란을 각각 체외배양시켰을 때 GV 및 MII로의 발생율은 11.3%와 9.4%, 50.7%와 26.7%, 16.9%와 13.8%였고, 16세포기로의 체외발생율은 0.0%, 10.7%, 1.5%였다. 3 신선한 난구세포 부착 난자를 각각 24, 32, 48시간 성숙배양 후 체외수정시켰을 때 분할율은 8.6%, 15.8%, 23.5%였으며, 16세포기로의 체외발생율은 각각 0.0%, 5.3%, 11.8%로써 48시간 배양군이 가장 높은 발생율을 나타냈다. 4. 활성화 처리 및 비활성화 처리 난자를 각각 체외수정시켰을 때 분할율은 각각 42.5%, 22.2%였고 16세포기로의 체외발생율은 각각 15.0%, 6.7%로써 활성화 처리 난자군이 비활성처리 난자군에 비해 높은 발생율을 나타냈다.

Abstract ▼ AI-Helper

The study was carried out to investigate the effects of morphology, reproductive cycle, incubation time and activation of oocytes in vitro maturation of canine oocytes and development of canine IVM/IVF embryos. The results were summarized as follows: 1. The developmental rates to 16 cells of fresh, salts and 4$^{\circ}C$-stored oocytes with and without cumulus cells were 14.3%, 5.0% and 7.5%, 2.8% and 5.7%, 0.0%, respectively. The rate of oocytes with cumulus cells(5.7%~14.3%) was higher than that of denuded oocytes(0.0%~5.0%). 2. The developmental rate to If cells of in vitro cultured oocytes recovered from ovaries collected at different stages of the reproductive cycle were 0.0%, 10.7%, 1.5%, respectively. 3. The developmental rate to 16 cells of fresh oocytes with cumulus cell cultured for 24, 32 and 48 hrs in $CO_2$ incubator were 0.0%, 5.3%, 11.8%, respectively. The rate of oocytes cultured for 48 hrs was higher than that oocytes cultured for 24 and 32 hrs. 4. The development to If cells treated activation and non-activation oocytes were 15.0%, 6.7%, respectively. The rate of oocytes treated activation was higher than that oocyte treat non-activation.

주제어

AI 본문요약
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문제 정의

본 연구는 소형 개의 불임 해결과 체외수정란을 생산하기 위한 방안의 하나로써 난자의 형태, 번식 주기, 배양시간 및 활성화 처리가 난포란의 체외성 숙 및 체외발생에 미치는 영향을 조사하였다.
이에, 본 연구는 소형 개의 불임 해결을 위한 방 안의 하나로써 난자의 형태, 번식주기, 배양시간 및 활성화 처리가 난포란의 체외성숙 및 체외발생 에 미치는 영향을 조사하였다.

가설 설정

a,b: Values within column with different superscript differ (p<0.05).
a,b: Values within column with different superscript differ (p<0.05).

제안 방법

개 난소를 적출하여, 38℃의 생리식염수에 침지 한 후 실험실로 옮겨 난소 난포로부터 난포란을 회수하였다. 회수한 난포란은 2 IU/ml의 hCG(Sigma, U.
난구세 포를 제거하기 위하여 0.2% hyaluroni- dase(Sigma, U.S.A.)가 첨가된 PBS 배지에서 난구세포를 제거하였으며, 난구세포가 제거된 난자중 제1 극체가 방출된 난자만을 선별하여 7% ethanol 에서 5 분간 처리 후 2.0 mM dimethylamino-purine (Sigma, U.S.A.)에서 1시간 활성화 처리후 시험에 이용하였다.
난자를 0.2%의 hyaluronidase(Sigma, U.S.A.)를 1~5분간 처리에 의하여 난구세포를 제거하고 나화된 난자는 acetic acid : ethanol(l : 3)액에 24시 간 고정하고 1% aceto-orcein 또는 10ju g/ml bis- benzimide(Hoechst 33342, Sigma, U.S.A.) 염색액으로 염색한 다음 세포 및 핵 분열상을 관찰하여 난자의 체외성숙을 판정하거나 배양액 내에서 배양하면서 웅성전핵 형성과 배의 발생상태를 관찰 하여 판정하였다.
) 배양액으로 배양하였다. 난포란의 체외성숙은 배양액 50 “1의 소적을 mineral oil(Squibb, U.S.A.)로 피복된 소적내 에 5개의 난포란을 주입하여 CO₂ 배양기내(5% C₆, 95% air, 38.5℃)에서 48시간 성숙배양을 실시하였다.
신선한 난소와, salt 및 4'C에 보존한 난소로부 터 각각 회수한 난구세포부착 난자와 나화난자를 각각 48시간 배양하면서 체외발생율을 조사하였고, 또한 발정주기를 휴지기(inactive), 발정기(fblli- cular), 황체기(luteal)로 구분하여 각각 채취한 난 포란을 배양하였을 때 GVBD 및 Mil 또는 16 세 포기 및 상살배로의 체외발생율을 조사하였다.
체외성숙 배양한 난포란과 동결 융해한 난포란 을 각각 50 “1의 배양액 소적 내에 5개의 난포란을 주입한 후, 사출 정액 0.01 ml와 BO액 2.0 ml을 잘 혼합하여 배양기에서 30 분간 swim-up시킨 다음 약 0.5 ml의 상층액을 1, 000 rpm으로 원심 분리하 여 침전된 정자 pellets을 20 “1의 heparin(Sigma,U.S.A.)과 혼합하여 C₆ 배양기에서 수정능획득을 유기시킨 정자 부유액을 주입하여 7~10시간 매정 에 의해 수정시켰다.

대상 데이터

개 난소를 적출하여, 38℃의 생리식염수에 침지 한 후 실험실로 옮겨 난소 난포로부터 난포란을 회수하였다. 회수한 난포란은 2 IU/ml의 hCG(Sigma, U.S.A.)와 l“g/ml의 /3 -estradiol (Sigma,U.S.A.)과 10%(v/v)의 FCS(Sigma, U.S.A.)가 첨가 된 TCM-199(Whittaker, U.S.A.) 배양액으로 배양하였다. 난포란의 체외성숙은 배양액 50 “1의 소적을 mineral oil(Squibb, U.

데이터처리

반복실험을 통하여 얻어진 결과는 분산분석에 의해 평균치를 구하였으며, 처리간의 차이를 평가 하기 위하여 Duncan의 다중검증을 실시하였다.

성능/효과

1. 신선, salt 및 4℃에 보존한 난소로부터 채취한 난구세포부착 난자와 나화 난자로 각각 체외수정시켰을 때 16세포기로의 발생율은14.3%, 5.0% 및 7.5%, 2.8%, 5.7% 및 0.0%로써 난구세포 부착난자군의 체외발생율이 나 화 난자군에 비해 높게 나타났다.
2. 발정주기를 inactive, follicular, luteal 단계로구분하여 채취한 난포란을 각각 체외배양시 켰을 때 GV 및 MII로의 발생율은 11.3%와9.4%, 50.7%와 26.7%, 16.9%와 13.8%였고, 16세포기로의 체외발생율은 0.0%, 10.7%,1.5% 였다.
3. 신선한 난구세포 부착 난자를 각각 24, 32, 48시간 성숙배양 후 체외수정시켰을 때 분할율은 8.6%, 15.8%, 23.5%였으며, 16세포기로의 체외발생율은 각각 0.0%, 5.3%, 11.8%로써48시간 배양군이 가장 높은 발생율을 나타냈 다.
4. 활성화 처리 및 비활성화 처리 난자를 각각 체외수정시켰을 때 분할율은 각각 42.5%, 22.2%였고 16세포기로의 체외발생율은 각각15.0%, 6.7%로써 활성화 처리 난자군이 비활 성처리 난자군에 비해 높은 발생율을 나타냈 다.
Inactive, follicular, luteal 단계로 구분하여 채취한 난포란을 배양하였을 때 GV 및 Mil로의 체외성숙율은 각각 11.3%와 9.4%, 50.7%와 26.7%,16.9%와 13.8%로 나타났으며, 16 세포기로의 체외발생율은 각각 0.0%, 10.7%, 1.5%로 나타났다. 이러한 결과는 개 난자를 이용하여 48시간 SOF + 3% BSA와 SOF + 4% BSA액에서 배양하였을 때 GVBD 및 MII로의 체외성숙율은 각각 20/44 (45.
신선, salt 및 4℃ 에 보존한 난소로부터 회수한 난구세포부착 및 나화 난자를 각각 체외수정시켰을 때 체외발생율은 14.3%, 5.0% 및 7.5%, 2.8% 및 5.7%, 0.0%로써 난구세포 부착 난자가 나화난 자의 체외발생율에 비해 높은 성적이었다. 한편, 배반포로 분할하는 난자도 보였으나 발생이 중지 되거나 퇴행을 나타냈다.
신선한 난구세포 부착 난자를 각각 24, 32, 48시 간 성숙배양 후 체외수정시켰을 때 분할율은8.6%, 15.8%, 23.5%였으며 체외발생율은 각각 0.0%, 5.3%, 11.8%로써 48시간 성숙배 양하였을 때 가장 높은 체외발생율을 나타냈다. 이러한 결과는 소, 돼지 미숙난포란을 20~24시간 및 43~46시간 성숙 배 양하였을 때 MII에 도달한다고 한 Edwards (1965)의 보고와 비교할 때 개 난자의 체외성숙 배 양은 40~48시간이 적합한 것으로 사료되었다.
한편, 배반포로 분할하는 난자도 보였으나 발생이 중지 되거나 퇴행을 나타냈다. 이러한 결과는 가장 활발 한 난포기의 난소로부터 회수한 형태적으로 우수 하며 난구세포가 치밀하게 부착된 난자만을 선별 하여 수정했을 때의 체외발생율이 발정주기 전체 의 난소 난자를 체외수정 한 군에 비해 높은 체외 발생율을 나타냈으며 본 표에서는 우수한 난자만 의 체외 발생 결과만을 제시하였다. 개 난자를 이용 하여 48시간 배양 후 GVBD 및 MII기의 발생율은 각각 33.
활성화 처리 및 비활성화 처리 난자를 각각 체 외수정시켰을 때 분할율은 각각 42.5%, 22.2%였고 16세포기로의 체외발생율은 각각 15.0%, 6.7%로 써 활성화 처리를 한 난자가 높은 체외발생율을 나타냈다. 이러한 결과는 개 난자의 활성화 처리가 IVF에 미치는 보고를 접할 수 없어 정확하게 비교 할 수는 없었다.

후속연구

그러나 불임개체가 많고 자연수정이 어려운 소 형 개의 불임치료를 위해 체외수정과 수정란 생산 에 관한 연구보고는 접할 수 없었다. 또한, 하절기 에 개 난소를 용이하게 구할 수 있는 특수한 환경 은 개 불임문제 해결에 난자를 이용한 다양한 연 구가 시도될 수 있을 것으로 판단된다.

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저자의 다른 논문 :

표제어: PCR

동의어: Packet Collision Rate

용어 설명 출처 목록 (6)

용어 설명: PCR은 세균 특이성이 있는 primer를 이용하여 적은 수의 세균이 있을지라도 쉽게 검출할 수 있는 유용한 방법이며, 이를 이용하여 구강 내 치면세균막이나 타액에서 직접 세균을 검출할 수 있게 되었다[8].

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