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문제 정의
- 따라서 본 연구에서는 식용 또는 약용으로 이용되고 있는 이들 버섯류를 이용하여 7종의 식중독균에 대한 저해 활성과 함께 우리나라 사람들에게 문제가 되고 있는 간암 및 결장암 세포주의 증식에 미치는 영향을 조사하여 이들 버섯의 생리활성의 확인 및 그 효용가치를 높일 수 있는 기초 자료를 얻고자 하였다.
제안 방법
- 45 ㎛)로 제균한 후 처리하였다. 각 식중독균의 경우 log phase 상태에 도달한 균을 CFU/mL의 농도 로 한천배지에 도말한 후 멸균된 paper disc (diameter 8 mm) 를 올려 놓은 다음, 버섯 추출물을 paper disc 에 50 pL씩 첨가하여 37℃의 incubator에서 48시간 배양 후 paper disc 주위에 생성된 clear zone의 유무 확인 및 직경을 측정하여 항균력을 검색하였다.
- 먼저 구입한 버섯을 건조하여 각각 분쇄기를 사용하여 분말로 만든 후, 10배의 80% methanol을 첨가하여 37℃에서 100 ipm에서 10시간 동안 3회 반복 추출하여 상등액을 모으고, 이 액을 rotary evaporator(R-3000, Buchi, Gennany) 로 농축한 후 동결건조하여 버섯 메탄올추출물을 제조하였다. 그리고 버섯 열수 추출물의 경우는 건조된 각각의 버섯 에 io배의 증류수를 첨가하여 100℃에서 4시간씩 3회 열탕 추출한 다음, 여과하여 상등액을 모아 감압농축, 동결건조 한 후 분말화하여 사용하였다.
- 먼저 구입한 버섯을 건조하여 각각 분쇄기를 사용하여 분말로 만든 후, 10배의 80% methanol을 첨가하여 37℃에서 100 ipm에서 10시간 동안 3회 반복 추출하여 상등액을 모으고, 이 액을 rotary evaporator(R-3000, Buchi, Gennany) 로 농축한 후 동결건조하여 버섯 메탄올추출물을 제조하였다. 그리고 버섯 열수 추출물의 경우는 건조된 각각의 버섯 에 io배의 증류수를 첨가하여 100℃에서 4시간씩 3회 열탕 추출한 다음, 여과하여 상등액을 모아 감압농축, 동결건조 한 후 분말화하여 사용하였다.
- 버 섯 추출물의 항균효과는 inhibition zone diameter test로 조사하였다. 이때 12종의 버섯중 항균력이 보고된 동충하 초, 아가리쿠스, 영지버섯, 표고버섯(9, 13)을 제외한 8종의 식용버섯 추출물을 10% 농도로 조제하여 membrane filter(0.
- 암세포주중 인간유래의 간암 세포주인 HepG2와 결장암 세포주인 HT29는 한국 세포주 은행으로부터 분양받아 사용하였다. 암세포주는 각각 RPMI-1640배지에 10% FBS (fetal bovine serum) 와 1% antibiotics(penicillm /streptomycin) 을 첨가하여 37℃의 5% CCh incubator에서 배양하면서, 2- 3일에 한번씩 계대배양 하였다.
- 버 섯 추출물의 항균효과는 inhibition zone diameter test로 조사하였다. 이때 12종의 버섯중 항균력이 보고된 동충하 초, 아가리쿠스, 영지버섯, 표고버섯(9, 13)을 제외한 8종의 식용버섯 추출물을 10% 농도로 조제하여 membrane filter(0.45 ㎛)로 제균한 후 처리하였다. 각 식중독균의 경우 log phase 상태에 도달한 균을 CFU/mL의 농도 로 한천배지에 도말한 후 멸균된 paper disc (diameter 8 mm) 를 올려 놓은 다음, 버섯 추출물을 paper disc 에 50 pL씩 첨가하여 37℃의 incubator에서 48시간 배양 후 paper disc 주위에 생성된 clear zone의 유무 확인 및 직경을 측정하여 항균력을 검색하였다.
- 인간 유래의 간암세포인 HepG2와 결장암세포인 HT-29 를 사용하여 버섯 메탄올추출물의 이들 세포주에 대한 세포 증식 억제효과를 살펴보았다.
- 일반 식용버섯의 항균활성은 그람양성균 4종과 그람음 성균 3종에 대해 실험하였으며, 시중에서 주로 유통되고 있는 8종의 버섯 추출물의 항균 활성을 조사하였다.
- 일상생활에서 식용 및 약용으로 유통되는 12종의 버섯류 의 추출물을 제조하여 7종의 식중독균에 대한 항균 활성과 함께 인간유래의 간암 및 결장암 세포주의 증식에 미치는 영향을 조사하였다. 먼저 버섯 메탄올추출물은 7종의 식중 독균에 대해 항균활성을 보였으나, 버섯 열수추출물은 이들 균에 대해 생육 억제활성이 없거나 약한 억제 활성을 보였다.
대상 데이터
- 본 실험에 사용된 균주는 KCTC 및 ATCC로부터 분양 받았으며, 그람양성균인 Bacillus cereus ATCC 27348, Bacillus subtilis KCTC 1219, Listeria monocytogenes ATCC 15313, Staphylococcus aureus KCTC 1927와 그람음성균인 Escherichia coli O157:H7 ATCC 43888, Pseudomonas aeruginosa KCTC 1930, Salmonella typhi KCTC 2424 등 총 7균주를 사용하였다. 성장 배지는 tryptic soy broth(TSB; Difco, USA) 및 agar(TSA; Difco, USA)를 사용하였으며 37C에서 24시간 3회 계대 배양하여 사용하였다.
- 본 실험에 사용된 버섯은 양송이버섯(Agaricus bisporus), 아가리 쿠스 (Agaricus blazei), 목이 버섯 (Auricularia auricula-judae), 그물버섯(BoZe* edulis), 번데기동충하초 (Cordyceps militaris), 영지버섯(Gcmodesa lucidum), 표고 버섯 (Lentinus edodes), 만가닥버섯 m ulmarium), 새송이버섯 (Pleurotus eryngii), 애느타리버섯 (PZesrofMS ostreatus1), 느타리 버섯(Pleurotus ostreatus2) 그리고 향버 섯(Sarcodoa aspratus) 등 12종으로 강원도 홍천, 경북 김천, 대구의 약령시장 및 백화점에서 구입하여 사용하였다.
- ATCC 43888, Pseudomonas aeruginosa KCTC 1930, Salmonella typhi KCTC 2424 등 총 7균주를 사용하였다. 성장 배지는 tryptic soy broth(TSB; Difco, USA) 및 agar(TSA; Difco, USA)를 사용하였으며 37C에서 24시간 3회 계대 배양하여 사용하였다.
- 암세포주중 인간유래의 간암 세포주인 HepG2와 결장암 세포주인 HT29는 한국 세포주 은행으로부터 분양받아 사용하였다. 암세포주는 각각 RPMI-1640배지에 10% FBS (fetal bovine serum) 와 1% antibiotics(penicillm /streptomycin) 을 첨가하여 37℃의 5% CCh incubator에서 배양하면서, 2- 3일에 한번씩 계대배양 하였다.
이론/모형
- 암세포주에 대한 세포증식 억제효과는 MTT assay(16)로 조사하였다. 배양된 cell에 RPMI-1640 배지를 첨가하고 잘 혼합하여 cell 수를 lx Iff cells/mL 로 조정한 다음, 96-well microtiter plate 에 준비 된 cell 을 100 pL씩 첨가하고, 각 농도 의 버섯 메탄올추출물을 10 pL씩 well에 첨가한 후 37℃의 5% COz하에서 48시간 배양하였으며, 이때 대조군은 시료 대신 DMSO를 동량 첨가하여 동일한 조건으로 배양하였다 배양후 5 mg/mL의 MTT[3-(4, 5-dimethylthiazol-2-yl)-2, 5 -diphenyltetra-zolium-bromide] 시 약 10 pL를 각 well 에 첨 가 한 후 다시 4시간 더 배 양하였다.
성능/효과
- 그러나 대부분의 버섯 열수추출물은 이들 4종의 그람 양성균에 대한 저해능을 보이지 않았다. 다만 만가닥버섯 과 새송이버섯 열수추출물에서 Bacillus ceretts와 Bacillus subtilis에 대해 약한 저해 활성을 보였고, 향버섯 열수추출 물은 Bacillus cere"s와 Staphylococcus 에서, 느타리 버섯 열수추출물은 Bacillus subtilis에서 약한 저해 활성을 보였다. 이는 국내 약용식물 추출물의 항균 활성이 열수보 다는 80% 에탄올추출물에서 보다 더 높았다는 결과와 유사한 경향이었다(1, 20).
- 먼저 그람양^균에 대한 버섯 메탄올추출물의 항균 활성 은 Table 1과 같이, 그람양성균중 Bacillus cereus ATCC 27348에 대해 양송이버섯 메탄올 추출물이 가장 강한 항균 활성을 보였고, 새송이버섯, 목이버섯, 그물버섯, 만가닥버 섯, 느타리버섯 메탄올추출물에서도 강한 항균력을 보였 고, 애느타리버섯, 향버섯 메탄올 추출물에서에서도 약한 항균력 을 나타내었다. Bacillus subtilis KCTC 1219에 대해서는 향버섯을 제외한 나머지 버섯주줄물에서 항균활성이 있었고, 특히 양송이버섯, 만가닥버섯 메탄올 추출물에서 뚜렷한 항균력을 나타내었다.
- 또한 버섯 메탄올추출물은 인간유래 결장암세포인 HT-29보다는 간암세포인 HepG2에 대해 더 높은 성장 저해 능을 보였다. HepG2에 대해 번데기동충하초 메탄올추출물 이 67%의 가장 높은 성장 저해율을 나타내었고, HH-29에 대해서는 향버섯 메탄올추출물이 81.1%의 가장 높은 저해 율을 보였다. 그리고 번데기동충하초, 아카리쿠스 영지버 섯, 향버섯 열수추출물에서 HepG2 및 HT-29에 대해 50% 정도의 억제 활성을 볼 수 있었고, 다른 버섯 열수추출물은 억제활성을 볼 수 없었다.
- 그리고 Listeria monocytogenes ATCC 15313는 열 저항성 과 산성 저항성이 있으며 낮은 온도에서도 생육이 가능하여(17) 육가공품을 비롯하여 냉장, 냉동 식품의 소비가 급증하 면서 새로운 식중독 세균으로서 인식되고 있으며, 특히치사율이 가장 높은 식중독균으로 알려져 있다(18, 19). Listeria monocytogenes에서는 양송이버섯, 느타리버섯 메 탄올추출물에서 높은 생육억제를 보였고, 만가닥버섯, 새 송이버섯, 애 느타리버섯, 그물버섯 메탄올추출물에서도 약 한 생육억제를 보였다. 또한 우리나라의 대표적인 식중독 균인 Staphylococcus aureus KCTC 1927에 대해서는 목이버 섯 주줄물을 제외한 나머지 버섯주줄물에서 생육 억제를 보였고, 특히 만가닥버섯과 느타리버섯 메탄올 추출물에서 가장 높은 저해 활성을 보였다.
- 5 mg/mL에서는 아가리쿠스, 번데기동충하초, 표고버섯, 만가닥버섯, 향버섯 메탄올추 줄물이 50~63%의 높은 저해율을 나타내었고, 시료농도 1 mg/mL에서는 목이버섯을 제외한 대부분의 시료에서 30~ 67%의 저해율을 보였다. 그 중에서 아가리쿠스, 표고버섯, 만가닥버섯, 향버섯 메탄올추출물 등도 50% 이상의 높은 저해율을 보였고, 번데기동충하초 메탄올추출물이 67%의 가장 높은 성장 저해율을 나타내었다. 특히 번데기동충하 초의 경우 번데기동충하초 에탄올추출물 1 mg/mL 처리시 에도 간암세포인 Hep3B 세포에 대해 73%의 저해율을 가졌 다는 보고(21)와 유사하게 본 실험에서도 높은 성장 저해율 을 나타내는 우수한 항암 활성소재로 생각되었다.
- 30에 대해서는 양 송이버섯, 만가닥버섯, 새송이버섯, 느타리버섯, 애느타리 버섯 메탄올추출물에서 약한 항균효과를 보였고, 대형 식 중독사고의 대표적 원인세균인 Salmonella typhi KCTC 2424에서는 애느타리버섯, 양송이버섯, 만가닥버섯, 느타 리버섯 메탄올추출물에서만 약한 균 생육억제를 나타내었다. 그러나 버섯 열수추출물의 경우, 그람음성균에 대해서 도 대부분의 버섯추출물에서 균 생육억제효과를 볼 수 없었 으며, Pseudomonas aeruginosa에 대해 만가닥버섯, 새송이, 향버섯에서, Salmonella typhi KCTC2424에 대해 향버섯에서 다소 약한 항균력을 볼 수 있었다.
- 3과 같이, HepG2에서 대부분의 시료에서 저해활성을 볼 수 없었으며, 번데기동 충하초, 아카리쿠스, 영지버섯, 향버섯 열수추출물에서 50% 정도의 억제 활성을 볼 수 있었다. 그리고 HH-29에 대한 저해효과는 Fig. 4와 같이, 대부분의 시료에서 저해 활성을 볼 수 없었으나, 향버섯 및 아가리쿠스 열수추출물 에서 약 40%정도의 낮은 억제활성을 확인하였다. 따라서 번데기동충하초, 아카리쿠스, 만가닥버섯, 영지버섯, 향버 섯 메탄올 및 열수추출물은 이들 암세포주에 대한 증식 억제 활성이 높음을 확인할 수 있었다.
- 1%의 가장 높은 저해 율을 보였다. 그리고 번데기동충하초, 아카리쿠스 영지버 섯, 향버섯 열수추출물에서 HepG2 및 HT-29에 대해 50% 정도의 억제 활성을 볼 수 있었고, 다른 버섯 열수추출물은 억제활성을 볼 수 없었다. 특히 번데기동충하초, 아카리쿠 스 만가닥버섯, 영지버섯, 향버섯 메탄올 및 열수추출물은 이들 암세포주에 대해 높은 증식 억제 활성을 보였다.
- 이는 시료농도 증가로 인해 저해 활성이 더 증가하 였는데, 표고버섯 첨가량이 증가할수록 암세포 저지율이더 증가하였다는 보고(23)와 유사한 경향이었다. 그리고 향버섯 메탄올 추출물이 HT-29에 대해 81.1%의 가장 높은 저해율을 나타내었다. 이와 같이 버섯 메탄올추출물의 HepG와 HT-29에 대한 저해율의 차이는 암세포주의 종류 에 따른 저해율의 차이로 생각되었다.
- 4와 같이, 대부분의 시료에서 저해 활성을 볼 수 없었으나, 향버섯 및 아가리쿠스 열수추출물 에서 약 40%정도의 낮은 억제활성을 확인하였다. 따라서 번데기동충하초, 아카리쿠스, 만가닥버섯, 영지버섯, 향버 섯 메탄올 및 열수추출물은 이들 암세포주에 대한 증식 억제 활성이 높음을 확인할 수 있었다.
- 따라서 식용버섯중 만가닥버섯과 느타리버섯 추출물은 특히 7종의 식중독균에 대해 항균 활성을 보였고 양송이버섯, 새송이버섯, 애느타리버섯도 6종의 식중독균에 대해 항균 활성을 보였다. 이들 버섯의 경우 항균성이 알려진 표고버 섯과 유사한 항균력(9)을 가지는 것으로 보아, 천연 항균제 로서 식품첨가 재료로의 이용도 가능하리라 생각된다.
- 또한 Pseudomonas aeruginosa KCTC1930에 대해서는 양 송이버섯, 만가닥버섯, 새송이버섯, 느타리버섯, 애느타리 버섯 메탄올추출물에서 약한 항균효과를 보였고, 대형 식 중독사고의 대표적 원인세균인 Salmonella typhi KCTC 2424에서는 애느타리버섯, 양송이버섯, 만가닥버섯, 느타 리버섯 메탄올추출물에서만 약한 균 생육억제를 나타내었다. 그러나 버섯 열수추출물의 경우, 그람음성균에 대해서 도 대부분의 버섯추출물에서 균 생육억제효과를 볼 수 없었 으며, Pseudomonas aeruginosa에 대해 만가닥버섯, 새송이, 향버섯에서, Salmonella typhi KCTC2424에 대해 향버섯에서 다소 약한 항균력을 볼 수 있었다.
- 만가닥버섯과 느타리 버섯 메탄올추출물은 7종의 식중독균에 대해 항균 활성을 보였고, 양송이버섯, 새송이 버섯, 애느타리버섯도 6종의 식중독균에 대해 항균 활성을 보였다. 또한 버섯 메탄올추출물은 인간유래 결장암세포인 HT-29보다는 간암세포인 HepG2에 대해 더 높은 성장 저해 능을 보였다. HepG2에 대해 번데기동충하초 메탄올추출물 이 67%의 가장 높은 성장 저해율을 나타내었고, HH-29에 대해서는 향버섯 메탄올추출물이 81.
- Listeria monocytogenes에서는 양송이버섯, 느타리버섯 메 탄올추출물에서 높은 생육억제를 보였고, 만가닥버섯, 새 송이버섯, 애 느타리버섯, 그물버섯 메탄올추출물에서도 약 한 생육억제를 보였다. 또한 우리나라의 대표적인 식중독 균인 Staphylococcus aureus KCTC 1927에 대해서는 목이버 섯 주줄물을 제외한 나머지 버섯주줄물에서 생육 억제를 보였고, 특히 만가닥버섯과 느타리버섯 메탄올 추출물에서 가장 높은 저해 활성을 보였다.
- 먼저 버섯 메탄올추출물은 7종의 식중 독균에 대해 항균활성을 보였으나, 버섯 열수추출물은 이들 균에 대해 생육 억제활성이 없거나 약한 억제 활성을 보였다. 만가닥버섯과 느타리 버섯 메탄올추출물은 7종의 식중독균에 대해 항균 활성을 보였고, 양송이버섯, 새송이 버섯, 애느타리버섯도 6종의 식중독균에 대해 항균 활성을 보였다. 또한 버섯 메탄올추출물은 인간유래 결장암세포인 HT-29보다는 간암세포인 HepG2에 대해 더 높은 성장 저해 능을 보였다.
- 먼저 12종의 버섯 메탄올추출물의 HepG2에 대한 저해율 은 Fig. 1과 같이, 시료농도 0.5 mg/mL에서는 아가리쿠스, 번데기동충하초, 표고버섯, 만가닥버섯, 향버섯 메탄올추 줄물이 50~63%의 높은 저해율을 나타내었고, 시료농도 1 mg/mL에서는 목이버섯을 제외한 대부분의 시료에서 30~ 67%의 저해율을 보였다. 그 중에서 아가리쿠스, 표고버섯, 만가닥버섯, 향버섯 메탄올추출물 등도 50% 이상의 높은 저해율을 보였고, 번데기동충하초 메탄올추출물이 67%의 가장 높은 성장 저해율을 나타내었다.
- 먼저 그람양^균에 대한 버섯 메탄올추출물의 항균 활성 은 Table 1과 같이, 그람양성균중 Bacillus cereus ATCC 27348에 대해 양송이버섯 메탄올 추출물이 가장 강한 항균 활성을 보였고, 새송이버섯, 목이버섯, 그물버섯, 만가닥버 섯, 느타리버섯 메탄올추출물에서도 강한 항균력을 보였 고, 애느타리버섯, 향버섯 메탄올 추출물에서에서도 약한 항균력 을 나타내었다. Bacillus subtilis KCTC 1219에 대해서는 향버섯을 제외한 나머지 버섯주줄물에서 항균활성이 있었고, 특히 양송이버섯, 만가닥버섯 메탄올 추출물에서 뚜렷한 항균력을 나타내었다.
- 일상생활에서 식용 및 약용으로 유통되는 12종의 버섯류 의 추출물을 제조하여 7종의 식중독균에 대한 항균 활성과 함께 인간유래의 간암 및 결장암 세포주의 증식에 미치는 영향을 조사하였다. 먼저 버섯 메탄올추출물은 7종의 식중 독균에 대해 항균활성을 보였으나, 버섯 열수추출물은 이들 균에 대해 생육 억제활성이 없거나 약한 억제 활성을 보였다. 만가닥버섯과 느타리 버섯 메탄올추출물은 7종의 식중독균에 대해 항균 활성을 보였고, 양송이버섯, 새송이 버섯, 애느타리버섯도 6종의 식중독균에 대해 항균 활성을 보였다.
- 인간 유래의 결장암 세포인 HT-29에 대한 버섯 메탄올추 출물의 저해 활성은 Fig. 2와 같이, 시료농도 0.5 mg/mL 처리시에는 그물버섯, 번데기동충하초, 향버섯, 아가리쿠 스 그리고 만가닥버섯 메탄올 추출물에서 44~72%정도의 높은 저해율을, 시료농도를 1.0 mg/mL 처리시에는 그물버 섯, 번데기동충하초, 향버섯, 아가리쿠스 그리고 만가닥버 섯 메탄올 추출물에서 57-81% 이상의 높은 성장 저해율을 보였다. 이는 시료농도 증가로 인해 저해 활성이 더 증가하 였는데, 표고버섯 첨가량이 증가할수록 암세포 저지율이더 증가하였다는 보고(23)와 유사한 경향이었다.
- 그리고 번데기동충하초, 아카리쿠스 영지버 섯, 향버섯 열수추출물에서 HepG2 및 HT-29에 대해 50% 정도의 억제 활성을 볼 수 있었고, 다른 버섯 열수추출물은 억제활성을 볼 수 없었다. 특히 번데기동충하초, 아카리쿠 스 만가닥버섯, 영지버섯, 향버섯 메탄올 및 열수추출물은 이들 암세포주에 대해 높은 증식 억제 활성을 보였다.
- 한편 버섯 열수추출물의 경우 Fig. 3과 같이, HepG2에서 대부분의 시료에서 저해활성을 볼 수 없었으며, 번데기동 충하초, 아카리쿠스, 영지버섯, 향버섯 열수추출물에서 50% 정도의 억제 활성을 볼 수 있었다. 그리고 HH-29에 대한 저해효과는 Fig.
- 한편 버섯 추출물의 그람음성균에 대한 저해 효과는 먼저 다양한 식품에서 분리되며 저온내성, 내산성이 강하고 일본에서 1만 명이상의 환자를 발생시킨 대표적인 식중독 균주인(17) E. coli O157:H7 ATCC 43888에 대해서 목이버 섯, 새송이버섯, 만가닥버섯, 느타리버섯 메탄올추출물에 서만 약한 항균력을 보였고 그 중 만가닥버섯 메탄올추출물 이 가장 뚜렷한 항균력을 나타내었다.
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