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문제 정의
- 인삼의 주요 활성분자성분인 ginsenoside는 많은 분야에서 연구가 활발히 수행되고 있으며, 본 연구에서는 CNS에 대한 많은 잠재적 효과相)를 배경으로 대식활성 증진효과1°)에 대한 관찰하고자 하였다. 그동안 ginsenoside에 대한 연구는 ginsenoside Rbleanaxadiol)과 Rgl(panaxatriol)에 집중되어 왔으나, 아직 인삼의 약리적 작용기전에 대해 그다지 많은 것이 알려져 있지는 않다.
제안 방법
- 이러한 신비한 효과는 "adaptogenic" 효과°로 설명되고 있으나 이 또한 많은 연구를 통한 입증이 필요하며, 이와 같은 인삼의 잠재적 효과에 대한 다양한 적용 중에 면역조절작용이 ginsenoside의 adaptogenic 효과를 잘 설명해 주고 있다.*'3) 본 연구에서는 흰쥐소교세포의 1차배양에서 Rg3 처리 시 대식 작용을 증진하여 주는 지를 관찰 하였으며, Rg3가 AP 제거를 증진시켜주는 지에 대한 입증을 위해 Ap 섭취 및 MSR 유전자 발현을 관찰하였다. 이와 같은 결과는 fluorescent-labeld protein에 의해 확인하였다.
- Rg3가 소교세포의 대식작용에 영향을 주는지 여부를 관찰하기 위해 일차적으로 Ap peptide에 대한 MSR의 역할을 확인하였다(Fig. 1). Fig.
- RT-PCR 실험에 사용된 primer는 MSR-A(485 bp), sense 5'-tag aca egg gac get tcc ag-3, anti-sense 5'-tcc tgg age acc agg tgg ac-3; MSR- BI(655 bp), sense 5'-agg aca age cca caa gcc tg-3, anti-sense 5'-tcc ttt ggg tea ggg ttc ag-3; P-actin(186 bp), sense, 5'-tga ccg age gtg get aca gc-3 anti-sense, 5-acc get cat tgc ega tag tg-3. cDNA에 대한 PCRe 60℃에서 20초 동안 annealing 하였으며 , 총 30사이클을 수행했다. 단백질 분석을 위해 western blot을 수행하였다.
- 즉, 각 2, 4, 8시간 반응시간 종료 후 각 fluorescent labled peptides를 처리하여 2시간 incubation 후 지침서에 따라 excitation wavelenth 535 nm, emission wavelenth 612nm에서 각 plate well을 즉정하여 상대값을 분석하였다. 이 결과는 western blot및 fluorescent microscope하에서 확인 실험을 하였다. 결과분석은 GraphPed Prizm 4 software를 이용하여 pv0.
- S A)을 사용하였다. 즉, 각 2, 4, 8시간 반응시간 종료 후 각 fluorescent labled peptides를 처리하여 2시간 incubation 후 지침서에 따라 excitation wavelenth 535 nm, emission wavelenth 612nm에서 각 plate well을 즉정하여 상대값을 분석하였다. 이 결과는 western blot및 fluorescent microscope하에서 확인 실험을 하였다.
대상 데이터
- )은 제조사 지침에 따라 제조하였다. MSR ligamd인 Fucoidan(Calbiochem, U.S.A.)은 최종 농도로서 5|igZ m2이 되게 하여 실험에 사용하였다. RT-PCR 실험에 사용된 primer는 MSR-A(485 bp), sense 5'-tag aca egg gac get tcc ag-3, anti-sense 5'-tcc tgg age acc agg tgg ac-3; MSR- BI(655 bp), sense 5'-agg aca age cca caa gcc tg-3, anti-sense 5'-tcc ttt ggg tea ggg ttc ag-3; P-actin(186 bp), sense, 5'-tga ccg age gtg get aca gc-3 anti-sense, 5-acc get cat tgc ega tag tg-3.
데이터처리
- 이 결과는 western blot및 fluorescent microscope하에서 확인 실험을 하였다. 결과분석은 GraphPed Prizm 4 software를 이용하여 pv0.05일때 통계적 유의성이 있음을 인정하였고, PCR및 western blot 결과의 분석은 gel/ membrane band scanning 후 UVIDocMW program 을 통해 band inten도ity의 상대비교 분석을 실시하였다.
이론/모형
- 즉, fluorescent A|J는 Ap(l mgg)에 Cy3(Amersharm, USA)를 conjugate하여 준비하였고, 소교세포의 uptake 실험을 위해 pre-aggregated 를 만들어 (37℃, 24시간) 사용하였다. Positive control 로서 Dil-labeled acetyl-LDL(Biomedical Technologies, U.S.A.)은 제조사 지침에 따라 제조하였다. MSR ligamd인 Fucoidan(Calbiochem, U.
- cDNA에 대한 PCRe 60℃에서 20초 동안 annealing 하였으며 , 총 30사이클을 수행했다. 단백질 분석을 위해 western blot을 수행하였다. 즉, cell lysate으로부터 추출된 단백질 30)ig 을 10% SDS-PAGE로 분리 후 PVDF membrane에 transfer 하였다.
- ) 2차 항체를 붙여 ECL(enhanced chemiluminescence luminogram) reagent (Amer사lam)로 반응시켜 필름에 노출하였다. 또한 시간별 phagocytosis assay 에는 Phagocytosis Assay Kit(l物如㎛ Molecular Probs, U.S A)을 사용하였다. 즉, 각 2, 4, 8시간 반응시간 종료 후 각 fluorescent labled peptides를 처리하여 2시간 incubation 후 지침서에 따라 excitation wavelenth 535 nm, emission wavelenth 612nm에서 각 plate well을 즉정하여 상대값을 분석하였다.
성능/효과
- ° 소교세포는 다양한 면역 관련 인자들을 분비하여 여러 사이토카인을 통해 염증반응 및 타 아교세포(glial cell)와의 신호전달 과정에 관여하며, 세포 손상을 유발하는 자유기 (free radicals) 생성과 아울러, 베타아밀로이드 펩타이드(A0 peptide)로부터 유래하는 아밀로이드침착 (amyloid deposit)을 사전에 제거하는 주요한 역할을 하기도 한다. 2)더욱이, reactive microglial products는 성상세포(astrocyte) 의 활성 및 신경세포 손상을 유도한다. In vivo 상에서 뇌 내의 어느 한부분에서 소교세포의 밀도가 높아질 때 염증성 반응이 일어나고 있음을 예측할 수 있으며, 이러한 것은 퇴행성 뇌질환, 특히 알츠하이머질환(AlzheimeFs disease, AD)의 지표인 노인반 (senile plaque)이 고 밀도로 축적이 진행 중 임을 반영하는 것이다.
- 3에서 MSRA의 발현이 상대적으로 많이 나타남을 형광현미경을 통해 확인할 수 있었으며, 이때 Rg3 에 의한 대식작용은 PCR 결과에서와 같이 증가된 MSRA 발현에 의한 결과임을 추정할 수 있다. Rg3 비처리 상태에서 소교세포에 Cy3-labeled AB aggregates# 처리하였을 때 같은 MSRA 수용체를 공유하는 대조군(i.e. Ac-LDL)과 유사한 uptake 패턴을 보였으며, 이와 같은 결과는 시간 비 의존적으로 나타났다 (Fig. 2). 반면에, Fig.
- 1A). 또한 이와 같은 결과는 Fig. 3에서 MSRA의 발현이 상대적으로 많이 나타남을 형광현미경을 통해 확인할 수 있었으며, 이때 Rg3 에 의한 대식작용은 PCR 결과에서와 같이 증가된 MSRA 발현에 의한 결과임을 추정할 수 있다. Rg3 비처리 상태에서 소교세포에 Cy3-labeled AB aggregates# 처리하였을 때 같은 MSRA 수용체를 공유하는 대조군(i.
- 또한 Rg3가 A&의 신속한 세포 내 degradation에 효과적인 것으로 사료되며, 이와 같은 결과는 Fig. 4에서 관찰되는 배지내의 A。량의 변화 추이에서 확인할 수 있었고, 따라서 Rg3 처리는 정상상태의 소교세포에서 보다 우수한 대식 작용의 잠재적 효과를 예측할 수 있다. AD에 있어서 씨3 생성과 degradation의 균형이 주요한 병리학적 의미를 가지므로, Rg3에 의한 소교세포의 대식작용 중진과 효율적인 degradation 은 Ap aggregates의 속도를 늦추어 줄 수 있을 뿐 아니라' 뇌 내에 미aque 형성을 사전에 방지하여 AD의 근본적인 차단하는 후보물질로 가능 할 것이다.
- 본 연구에서 Rg3가 소교세포에 전 처리 되었을 때, 소교세포의 대식작용이 증진됨을 관찰하였고, 이러한 결과는 다량 발현된 MSRA에 의한 receptor mediated phagocytosis가 주된 역할을 하는 것으로 생각된다. 또한 Rg3가 A&의 신속한 세포 내 degradation에 효과적인 것으로 사료되며, 이와 같은 결과는 Fig.
후속연구
- 4에서 관찰되는 배지내의 A。량의 변화 추이에서 확인할 수 있었고, 따라서 Rg3 처리는 정상상태의 소교세포에서 보다 우수한 대식 작용의 잠재적 효과를 예측할 수 있다. AD에 있어서 씨3 생성과 degradation의 균형이 주요한 병리학적 의미를 가지므로, Rg3에 의한 소교세포의 대식작용 중진과 효율적인 degradation 은 Ap aggregates의 속도를 늦추어 줄 수 있을 뿐 아니라' 뇌 내에 미aque 형성을 사전에 방지하여 AD의 근본적인 차단하는 후보물질로 가능 할 것이다. 특히 amyloid plaque내에 존재하는 활성화된 소교세포가 섬유성 amyloid 또는 웅괴상태의 amyloid 를 제거하는 결정적인 역할을 할 수 있으나, AD 뇌에 존재하여 AP 생성, 염증반응, 및 세포독성을 유발하는 부정적인 역할도 예상된다.
- 이러한 목적에서, Rg3는 소교세포의 활성에 따른 MSR-A 발현을 중가시켜 과량의 Ap를 신속히 효과적으로 제거하여 결국 노인반 형성을 차단할 것으로 사료된다. Rg3는 이와 같은 요구사항을 만족시키는 후보물질로 생각되며, 사전연구에서 panaxadiol계 ginsenoside에서 염증유발인자의 억제가 관찰되어(data in press) Rg3의 향후 AD 치료 및 예방에 많은 과학적 접근이 가능할 것이다. 특히 천연물질의 항알츠하이머 효과는 매우 흥미로운 결과이며, Rg3의 이와 같은 효과에 대한 작용기전에 대해보다 깊은 연구가 필요할 것으로 사료된다.
- 하지만 후자의 경우는 소교세포에 의한 A&의 효과적인 제거가 일어나지 않거나 과량의 A。가 생성 시 생산-제거의 균형이 깨어질 때 발생될 위험이 매우 높다. 따라서 소교세포의 활성에 의한 효과적인 AJ3의 제거는 AD의 초기 발병에 직간접적으로 영향을 주어 병인원을 제거해주는 중요한 실마리가 될 것이다. 이러한 목적에서, Rg3는 소교세포의 활성에 따른 MSR-A 발현을 중가시켜 과량의 Ap를 신속히 효과적으로 제거하여 결국 노인반 형성을 차단할 것으로 사료된다.
- Rg3는 이와 같은 요구사항을 만족시키는 후보물질로 생각되며, 사전연구에서 panaxadiol계 ginsenoside에서 염증유발인자의 억제가 관찰되어(data in press) Rg3의 향후 AD 치료 및 예방에 많은 과학적 접근이 가능할 것이다. 특히 천연물질의 항알츠하이머 효과는 매우 흥미로운 결과이며, Rg3의 이와 같은 효과에 대한 작용기전에 대해보다 깊은 연구가 필요할 것으로 사료된다.
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