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문제 정의
- Hamelin 등(1996)의 연구에서는 nested PCR의 민감도와 관련된 결과가 제시되지 않았으므로 본 실험은 DNA 정량에 따른 검출 한계를 제시하고자 실행되었다. 먼저,PDB 배지에서 25℃로 2주간 배양한 Umseong 1-A 균주로부터 DNA를 분리하여 10 ng~0.
- 연구가 뒷받침되어야 할 필요가 있다. 본 연구에서는 C. destructans 특이적 primer를 활용한 nested PCR기법의 인삼 뿌리썩음병균에의 적용법을 찾고, 나아가 PCR반응 민감도를 개선하고자 시도되었으며 균 배양과정 없이 인삼으로부터 직접 이 병원균을 빠르고 정확하게 검출할 수 있는 기술을 개발하고자 수행하였다.
제안 방법
- 1차 PCRe ITS 1과 ITS 4 primer set을 이용하였고, 2차는 내부의 염기서열로부터 선발된 Dest 1과 Dest 4 primer를 이용하여 재증폭하는 nested PCR 기법을 사용하였다.
- 1차 PCR에 의한 ITS 영역의 증폭은 ITS 1과 ITS 4 primer set을 이용하여 실행하였다. PCR 반응액은 총량을 50 μ/로 하고 주형 DNA 5 ng, 0.
- NestedPCR에 의해 증폭된 증폭산물을 probe로 제작하여 C. destructans 특이적 hybridization0)] 사용하였다.
- PCR 반응액은 총량을 50μl로 하고 주형 DNA는 1차 PCR 반응액 중 1 μl를 취하고, 0.8 μM의 primer를 사용하였으며 이외의 방법은 ITS 영역 증폭때와 동일하게 실시하였다.
- sp. fragariae6^ 대해 nested PCR의 종 특이성을 검정하였다. 각 병원균의 균주들로부터genomic D* NA 추출한 후 약 1 ng을 취하여 1차 PCR및 nested PCR을 수행하였을 때 , 1차 PCR에서는 모든 병원균에서 밴드를 형성하였으나(data not shown) nested PCR 에서는 C.
- 공시 균주들을 SNAY broth [1 g KH2PO4, 1 g KNO3, 0.5 g MgSO4 - 7H2O, 0.5 g KC1, 0.2 g glucose, 0.2 g saccharose, 1 g Yeast extract/11 H2O]배지에 접종하여 20℃에서 정치 배양하였다. 균사를 수확하여 1.
- 먼저, 증폭된 PCR 생성물을 1.2% low melting point agarose gel에 전기영동하고 400 bp band를 mess로 절단하였다. 절단된 agarose 절편은 1.
- 원균들을 사용하였는데 이 들은 충남대 학교 식 물병 리 학실험실에서 보관한 균주들이었다. 병원균의 분리는 단균사 분리와 단포자 분리를 병행하여 하였다(Table 1).
- 병원성 검정을 위해 사용된 묘삼을 시기를 달리하여 뽑은 후 이 nested PCR 분석기법을 활용하여 뿌리에 감염된 C. destructans를 검출해 낼 수 있는지 확인하였다. 1차 PCR과 nested PCR을 거친 다음, agarose gel 전기영동을 통해 확인하였을 때, 접종 2주된 묘삼부터 4주 된 묘삼들에서는 모두 C.
- 분리된 C. destmictans으' 병원성을 조사하기 위해 120℃에서 30분간 멸균한 토양에 접종원을 투입하여 이병토를 만들어 사용하였다.
- Cylindrocarpon destructans는 인삼 및 수목에 뿌리썩음 병을 일으키는 토양 전염성 식물병원균이다. 신속 정확한 검출 가능성을 알아보기 위하여 종 특이적인 primer와 nested PCR 기법을 활용하여 인삼 유묘로부터 뿌리썩음 병균 C. destructans의 검출을 시도하였다. ITS 1과 ITS 4 primer> 이용한 1차 PCR 증폭산물에 대해 Dest 1과 Dest 4 primer로 2차 PCR 증폭을 실시한 결과 병원성이 확인 된 C.
- 이병된 인삼으로부터 분리된 공시균을 PDA 배지 상에서 배양하면서 관찰하였다. C.
- , Japan) 1 unit을 첨가하였다. 이어서 Perkin Elmei사의 DNA thermal cycler 480을 이용하여 95℃에서 3분간 initial denaturation 시킨 후, 95℃ /35초, 55℃/1 분, 72℃/2분으로 35 cycle 반응시킨 다음 7TC에서 8분간 final extension시켜 PCR 반응을 마쳤다.
- 실험의 객관성을 부여하기 위해, 묘삼은 액체질소와 막자사발을 이용해 통째로 마쇄한 후 즉시 3 ml의 extraction buf!3r를 첨가함으로서 DNA의 손상을 예방하고, 그 중 500μl를 취해 다음 과정을 진행하였다. 한편 비교를 위하여 병원균을 접종하지 않은 건전한 묘삼의 DNA를 분리하여 분석하였다.
대상 데이터
- 공시된 병원균 중 CDGS 401-5, Umseong 1-A 균주를대상으로 그 병원성을 확인하였다. 공시균주들의 병원성은 매우 강하여 접종 2주부터 발병이 시작되고, 접종 3주째는 인삼뿌리 전체로 병징이 확대되어가는 것을 확인할 수 있었으나 지상부의 증상으로는 병의 유무를 진단할 수 없었다.
이론/모형
- Southern hybridization을 위해 PCR 산물을 0.5 X TBE buffer 상에서 1.0% agarose gel에 전기영동하고, Sambrook(1989) 등의 방법으로 Schleicher & Schunell 사의 nylon membrane에 DNA를 전이시켰다. 이후의 hybridization 과정은 Dig DNA Labeling andDetection kit을 이용하여 권장사용법에 따라 수행하였다.
- 2 g saccharose, 1 g Yeast extract/11 H2O]배지에 접종하여 20℃에서 정치 배양하였다. 균사를 수확하여 1.5 ml effendorf tube에 나누어 담아 -20℃에서 냉동시킨 다음 동결건조시켰고, 동결건조된 균사체는 Doyle 등(1990)이 수행한 CTAB method를 사용하여 DNA를 분리하였다. 먼저 동결 건조된 균사체를 멸균한 가는막대로잘게 마쇄 한 다음 400 μl의 extration bufier[200 mM Tris-C1 (pH 8.
- 본 연구에 사용된 primer 염기서열 합성과 PCR 수행 절차는 Hamelin 등(1996)의 문헌에 근거하였으며, primer 제작은 Genotech사에 의뢰하였다(Table 2).
- 0% agarose gel에 전기영동하고, Sambrook(1989) 등의 방법으로 Schleicher & Schunell 사의 nylon membrane에 DNA를 전이시켰다. 이후의 hybridization 과정은 Dig DNA Labeling andDetection kit을 이용하여 권장사용법에 따라 수행하였다.
성능/효과
- destructans를 검출해 낼 수 있는지 확인하였다. 1차 PCR과 nested PCR을 거친 다음, agarose gel 전기영동을 통해 확인하였을 때, 접종 2주된 묘삼부터 4주 된 묘삼들에서는 모두 C. destructans가 검출되었다. 먼저, 1차 PCR에서는 C.
- 배양하면서 관찰하였다. C. destmchms는 PDA 배지 상에서 배지를 물들이는 검붉은 색소를 내는 특징을 보였다. 배양 초기의 균사는 백색이고, 격벽이 있으며 45º~90º 로 분지하고 대형 및 소형 분생포자와, 201에서 3Q일 이상 배양하면 후막포자를 형성하였다.
- destructans의 검출을 시도하였다. ITS 1과 ITS 4 primer> 이용한 1차 PCR 증폭산물에 대해 Dest 1과 Dest 4 primer로 2차 PCR 증폭을 실시한 결과 병원성이 확인 된 C. destructans에서만 400 bp의 종특이적 증폭산물을 얻을 수 있었다. 종 특이적 primer와 nested PCR 기법을 이용한 인삼뿌리썩음병균 DNA에 대한 반응 민감도는 최 저 약 1 fg으로 나타나 단 몇 개의 포자만 존재해도 검 출이 가능하였다.
- fragariae6^ 대해 nested PCR의 종 특이성을 검정하였다. 각 병원균의 균주들로부터genomic D* NA 추출한 후 약 1 ng을 취하여 1차 PCR및 nested PCR을 수행하였을 때 , 1차 PCR에서는 모든 병원균에서 밴드를 형성하였으나(data not shown) nested PCR 에서는 C. destructans의 균주들에서만 약 400 bp 정도의밴드가 형성되었으므로 그 종 특이성을 확인할 수 있었다. 이는 Hamelin 등(1996)의 nested PCR 기법을 이용해 다른 식물병원진균 및 Cylindrocarpon 종간 비교를 통한 특이성 검정 결과와 일치하였고, 이로써 처리방법만 잘 정립한다면 본 nested PCR 기법을 안정적으로 인삼에 적용할 수 있음이 검증되었다(Fig.
- 공시된 병원균 중 CDGS 401-5, Umseong 1-A 균주를대상으로 그 병원성을 확인하였다. 공시균주들의 병원성은 매우 강하여 접종 2주부터 발병이 시작되고, 접종 3주째는 인삼뿌리 전체로 병징이 확대되어가는 것을 확인할 수 있었으나 지상부의 증상으로는 병의 유무를 진단할 수 없었다. 또한, 접종 4주째에는 표피만 남을 정도로 병이 급속히 진전되는 것을 확인하였다.
- destructans 고유의 약 600 bp의 증폭 산물은 거의 증폭되지 않았고, 묘삼으로부터 온 약 700 bp 정도의 증폭산물만이 확인되었다. 따라서 감염 여부를 육안으로 확인하기 어려운 접종 2주째 묘삼으로부터 nested PCR을 통해 2차 PCR에서 C. destructans만을 특이적으로 증폭시 킴 으로서 뿌리 썩 음병 균의 검 출이 가능하였다(Fig 2, Fig 5). 이로써 식물체 유래의 DNA가 종 특이적 primer에 의한 증폭을 저해하지는 않는 것을 알 수 있다.
- 또, 본 연구에서 사용된 DNA 추출법을 이용하여 C. destructans의 1개 포자로부터 얻을 수 있는 DNA 양을 측정 하였을 때 약 50 fg이라는 수치 가 나왔다(data not shown). 즉, 약 50 copy 이상의 rDNA 영역이 존재할 것으로 추산되어지는데, 이는 DNA 추출 시 손실되는 양을 감안하면, 단일 핵내 수백 copy로 알려진 rDNA 반복서열 개수의 예측범위라고 할 수 있다(Bruns 등, 1991).
- 종 특이적 primer와 nested PCR 기법을 이용한 인삼뿌리썩음병균 DNA에 대한 반응 민감도는 최 저 약 1 fg으로 나타나 단 몇 개의 포자만 존재해도 검 출이 가능하였다. 또한, nested PCR 기법은 실제 이병토 양에 심었을 경우에도 C. 에 감염된 인삼 유묘 로부터만 정확하게 병원균을 검출해 내었다. 종특이적 primer와 nested PCR 기법을 이용한 본 연구 결과는 실 제 재배농가에서 인삼 경작시 뿌리썩음병 진단에 매우 유 용하게 활용될 수 있을 것으로 판단된다.
- 공시균주들의 병원성은 매우 강하여 접종 2주부터 발병이 시작되고, 접종 3주째는 인삼뿌리 전체로 병징이 확대되어가는 것을 확인할 수 있었으나 지상부의 증상으로는 병의 유무를 진단할 수 없었다. 또한, 접종 4주째에는 표피만 남을 정도로 병이 급속히 진전되는 것을 확인하였다. 병징은 발병 초기에 붉은 빛의 내부가 노출된 상처가 점점 확대되고, 내부로 썩어들어가는 전형적인 인삼 뿌리썩음병의 증상이었다(Fig- 2).
- destructans가 검출되었다. 먼저, 1차 PCR에서는 C. destructans 고유의 약 600 bp의 증폭 산물은 거의 증폭되지 않았고, 묘삼으로부터 온 약 700 bp 정도의 증폭산물만이 확인되었다. 따라서 감염 여부를 육안으로 확인하기 어려운 접종 2주째 묘삼으로부터 nested PCR을 통해 2차 PCR에서 C.
- 따른 검출 한계를 제시하고자 실행되었다. 먼저,PDB 배지에서 25℃로 2주간 배양한 Umseong 1-A 균주로부터 DNA를 분리하여 10 ng~0.1 10 배씩 희석하여 ITS 1과 ITS 4 primer로 증폭한 후 1.2% agarose gel 에 전기영동하였을 때 600 bp 증폭산물을 100 以에서까지 얻을 수 있었고 Southern hybridization을 실시 하였을 때에는 약 1 也까지 증폭이 확인되었다. 이와 같이 PCR 만을 행하였을 때보다 그 증폭산물을 hybridization 하였을 때의 민감도가 약 100배 가량 더 증가함을 알 수 있다.
- 2% agarose gel 에 전기영동하였을 때 600 bp 증폭산물을 100 以에서까지 얻을 수 있었고 Southern hybridization을 실시 하였을 때에는 약 1 也까지 증폭이 확인되었다. 이와 같이 PCR 만을 행하였을 때보다 그 증폭산물을 hybridization 하였을 때의 민감도가 약 100배 가량 더 증가함을 알 수 있다.
- destructans에서만 400 bp의 종특이적 증폭산물을 얻을 수 있었다. 종 특이적 primer와 nested PCR 기법을 이용한 인삼뿌리썩음병균 DNA에 대한 반응 민감도는 최 저 약 1 fg으로 나타나 단 몇 개의 포자만 존재해도 검 출이 가능하였다. 또한, nested PCR 기법은 실제 이병토 양에 심었을 경우에도 C.
후속연구
- 그러나 이 연구는 수목병에 국한되어 있고 검출 한계를 포함한 primer와 nested PCR의 특성에 관한 자료가 충분하지 못하기 때문에 인삼에의 적용을 위해서는 좀 더 세밀한 연구가 뒷받침되어야 할 필요가 있다. 본 연구에서는 C.
- 또한, 값이 비싸고 재식 과정을 거치며 4년 이상 재배해야 하는 등의 특성으로 인해 묘삼으로부터의 빠르고 민감한 검출법 개발 역시 더욱 요구되고 있는 실정이다. 따라서 이런 점으로 볼 때, 인삼 뿌리썩음병을 대상으로 한 PCR 진단법 또한 시급히 개발되어야 할 과제이다.
- 에 감염된 인삼 유묘 로부터만 정확하게 병원균을 검출해 내었다. 종특이적 primer와 nested PCR 기법을 이용한 본 연구 결과는 실 제 재배농가에서 인삼 경작시 뿌리썩음병 진단에 매우 유 용하게 활용될 수 있을 것으로 판단된다.
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