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문제 정의
- 따라서 본 실험은 사과 왜성대목 M.9 조직배양묘를 12회 이상 계대배양시켜 발근과 순화과정을 거쳐 포장에서 휘묻 이에 의해 번식을 할 경우, 기내유래 대목과 일반 대목의 발근율, 복토된 발근 예정 부위의 호르몬, 무기성분, 당류 및 리그닌 등의 변화가 발근에 어떠한 영향을 미치는 지를 구명하고자 하였다.
- 본 실험은 사과 왜성대목 M.9 조직배양묘를 12회 이상 계대배양 시켜 발근, 순화 후 포장에서 휘묻이에 의해 번식 을 할 경우, 복토된 발근 예정 부위의 호르몬, 무기성분 등의 변화와 발근에 미치는 영향을 보고자 실시하였다. 휘묻 이후 첫 부정근 출현 일수는 기내유래 M.
제안 방법
- 이 여과액에 다시 음이온교환수 지 (DEAE-sepadex)를 첨가하여 약 20분간 교반한 후 여과 시킨 여과액 10 mL 취하여 Sep-Pak C18 cartridge를 통과 시켰다. 다시 통과된 액을 0.45 "m pore size의 membrane filter를 통과시킨 후 당 함량을 HPLC (Waters 600E)로 분석하였다.
- 3 등의 사과대목들은 내한성, 왜화도 등 몇 가지 특성은 매우 우수하지 만, 발근력이 낮아 삽목이나 휘묻이에 의한 전통적인 방법 으로는 번식이 어려워 널리 이용되지 못하는 실정이다(Chistine and Jones 1991; Domoto 1991). M.9와 M.26의 발근 촉진을 위해 배(Pyrus betuli folia.) 실생을 사용 하고 (Qiao et al. 1994), M.27, MM.111 대목의 신초 기부에 IBA처리 (Gomaa and Stino 1989)하여 발근율 향상을 시도하였다.
- 5로 조정한 후 다시 ethyl acetate로 3회 분획하여 수층을 제거한 후 감압농축하였다. 농축된 잔사를 ethyl acetate에 용해시켜 1 L의 reaction vial에 옮긴 후, 질소가 스로 건조시킨 다음 2차례 ethereal diazomethane으로 methyl ester를 유도화한 다음 GC-MS (HP6990) 로 분석하였다.
- 식물체 분해 액 (H2SO4: HC104 : H20 = 2 : 9 : 5) 을 10 mL를 가하여 hot plate에서 온도를 서서히 높여 흰색 으로 변할 때까지 분해시킨 후 자연냉각시켰다. 따뜻한 증 류수 70 mL을 가한 후 교반하여 찌꺼기를 완전히 녹여 여 과지(Whatman No.6)로 여과하여 100 mL로 양을 조절하여 Inductively Coupled Plasma (Perkin Elmer Optima 3000SC)을 이용하여 분석하였다.
- 당분석은 Son (1998)의 방법을 이용하여 목분 시료 5 g을 95% methanol 40mL에 넣고, 항산화제 butylated hydroxy toluene 10 mg을 첨가하여 5분간 마쇄하였다. 약 1 ~2시간 교반한 후 여과지 (Whatman No.2)로 여과하여 여과액에 양이온교환수지 (CM-sepadex)를 첨가하여 약 20분간 교 반한 후 다시 여과하였다. 이 여과액에 다시 음이온교환수 지 (DEAE-sepadex)를 첨가하여 약 20분간 교반한 후 여과 시킨 여과액 10 mL 취하여 Sep-Pak C18 cartridge를 통과 시켰다.
- ABA 함량 분석은 Lee 등(2004)의 방법을 이용하여 목분 시료를 isopropanol과 glacial acetic acid가 95:5의 비율로 혼합된 용매로 추출, 여과시켰다. 여기에 표준물질로 20 ng 의 [(士, -3, 5, 5, 7, 7, 7-d6]-ABA를 첨가시켜 감압농축하였다. 농축된 잔사를 1 N의 NaOH를 이용하여 pH 12~13으로 조정한 다음 methyl chloride로 3회 분획하여 수층의 pH를 2.
- 3 mg/L이 첨가된 MS 발근 배지에서 발근, 순화시켰다. 이 듬해 기내 유래 M.9와 일반 M.9를 접수로 이용하여 사과 실생대목 (2년생)에 3월 하순 각각 눈접을 하였다.
- 5으로 조절하여 diethyl ether로 유기층을 추출하였다. 이 추출액에 Na2SO4 을 이용하여 수분을 완전히 제거한 다음 농축시킨 후 methanol (3 L)에 용해시 켜 IAA 함량을 HPLC(Waters2695, Alliance)를 이용하여 분석하였다.
- 무기성분 분석은 Kim (2004)의 방법을 이용하여 분석하였다. 전질소는 동결 건조한 목분 0.4 g을 질소분해용 튜브 에 넣고 식물체 분석용 분해촉진제 1 pellet (1.5 g K2SO4+ 7.5 mg Se, Tecator)과 H2SO4 10 mL를 넣어서 100℃에서 30분, 150℃에서 30분, 250℃에서 30분, 380℃에서 1시간 30분 동안 순차적으로 끓여 자연 냉각시킨 후 자동 켈달분해장치 (TT125+Vapodest45, Gerhdrdt)로 분석하였다.
- 접수의 신초가 20 cm 정도 신장하였을 때 톱밥과 흙을 등량으로 혼합한 복토재료를 신초의 절반이 묻히도록 복토 를 하였다. 시료 채취는 해토를 시킨 후 발근율을 조사하고 기부에서부터 5 cm 정도 황화된 부위를 채취하였다.
- 리그닌 분석은 Min 등 (1991)의 방법을 이용하였다. 함수 율을 측정한 시료 목분 2 g을 탈지 용액 (ethanol: benzen = 1:2) 500 mL에 침지하여 3회 (1회/일) 탈지시킨 후 글라 스필터 (1G3)로 여과하여 건조를 시켰다. 건조된 탈지 시료 1 g에 72% H2SO4 15 mL를 천천히 넣어 교반하여 산가수 분해를 시킨 후 1 L 삼각플라스크에 세정하여 넣고 500 mL로 양을 조절하였다.
대상 데이터
- 접수의 신초가 20 cm 정도 신장하였을 때 톱밥과 흙을 등량으로 혼합한 복토재료를 신초의 절반이 묻히도록 복토 를 하였다. 시료 채취는 해토를 시킨 후 발근율을 조사하고 기부에서부터 5 cm 정도 황화된 부위를 채취하였다. 채취 된 시료는 신속히 증류수로 세척하여 이물질을 제거한 후 약 0.
데이터처리
- yMean separation within a column by Duncan's multiple range test at 5% level.
- zMean separation within a column by Duncan's multiple range test at 5% level.
이론/모형
- ABA 함량 분석은 Lee 등(2004)의 방법을 이용하여 목분 시료를 isopropanol과 glacial acetic acid가 95:5의 비율로 혼합된 용매로 추출, 여과시켰다. 여기에 표준물질로 20 ng 의 [(士, -3, 5, 5, 7, 7, 7-d6]-ABA를 첨가시켜 감압농축하였다.
- IAA 함량 분석은 Goo (1995)의 방법을 이용하여 동결 건조된 목분 1 g을 80% methanol으로 24시간 2회 추출하여 여과시켰다. IAA의 회수율을 측정하기 위하여 methanol 추출액에 indole-3-propionic acid 200 ng를 첨가하여 농축 한 후 증류수로 용해시켰다.
- 당분석은 Son (1998)의 방법을 이용하여 목분 시료 5 g을 95% methanol 40mL에 넣고, 항산화제 butylated hydroxy toluene 10 mg을 첨가하여 5분간 마쇄하였다. 약 1 ~2시간 교반한 후 여과지 (Whatman No.
- 리그닌 분석은 Min 등 (1991)의 방법을 이용하였다. 함수 율을 측정한 시료 목분 2 g을 탈지 용액 (ethanol: benzen = 1:2) 500 mL에 침지하여 3회 (1회/일) 탈지시킨 후 글라 스필터 (1G3)로 여과하여 건조를 시켰다.
- 무기성분 분석은 Kim (2004)의 방법을 이용하여 분석하였다. 전질소는 동결 건조한 목분 0.
성능/효과
- 발근이 잘되는 시기는 전체 탄수화물 함량, fructose, glu- cose의 함량이 높고 (Stolz and Hess 1966), Mains屬 발근 시 sucrose가 가장 효과적인 당원 (Karhu and Ulvinen 1995) 이라는 보고와 같이 발근력은 당류의 종류와 양에 많은 영향을 받는다. 그러나 본 실험의 결과를 볼 때 기내 유래 대 목의 발근력 증가 (Table 1)는 발근 부위의 당류의 변화에 기인한 것이라고 할 수가 없으며 기내 유래 대목의 황화처 리에 따른 당류의 변화도 역시 영향이 없다고 생각된다.
- 기내유래 대목의 sucrose, glucose, fructose, maltose함량과 일반 기외대목의 함량 간에는 유의성이 인정되지 않았다. 기내 유래 및 일반 M.9 대목의 리그닌 변화는 휘묻 이 전, 10일 후, 30일 후에는 고도의 유의성이 인정되었다. 그러므로 기내유래 대목의 발근력의 증가는 당류와 호르몬 의 함량 변화 보다는 무기성분과 리그닌 함량 변화에 더 많이 기인하는 것으로 보인다.
- 9 대목 보다는 5일 정도 빨랐다. 복토 후 약 5개월 경과하여 낙엽 이 된 후 굴취하여 조사한 발근율은 기내유래 M.9 대목이 100% 발근되어 일반 M.9 대목의 발근율 83.3% 보다 유의 하게 높았다.
- 기내 . 외 대목 및 휘묻이후 경 과 일수별의 질소, 붕소, 망간, 아연 함량 모두 기내 및 일반 대목간 고도의 유의성이 인정되었다. 그러나 아연은 휘묻이 20일 후의 유의성이 인정되지 않았다.
- 이상의 결과를 종합해 볼 때, 기내 배양 사과 대목 M.9의 순화 후 휘묻이 번식 시 일반 M.9대목에 비해 발근이 더 잘되는 요인은 호르몬 (IAA, ABA)과 당 (sucrose, glucose, fructose, maltose)의 변화 보다는 무기성분 (N, B, Mn, Zn)과 리그닌의 함량 변화가 더 많이 관여하는 것으로 추정된다.
- 휘묻이 할 줄기 부분의 ABA 함량은 일반 M.9가 기내유 래 M.9에 비해 766.7 ng/g으로 높았다..
- 9 대목의 휘묻이에 따른 황화부위 의 IAA 및 ABA 함량 변화는 Table 2와 같다. 휘묻이 할 줄기 부분의 IAA 함량은 기내유래 M.9가 일반 M.9에 비해 188.2 ng/g으로 높았다. 휘묻이후 경과 일수별 IAA 함량은 10일 후에는 기내유래 M.
- 2 ng/g으로 높았다. 휘묻이후 경과 일수별 IAA 함량은 10일 후에는 기내유래 M.9의 황화처리 부위에서 136.4 ng/g으로 더 많았으나, 20일 및 30일 후에는 일반 M.9의 황 화처리 부위가 더 많았다. 그러므로 기내유래 대목의 1AA 함량은 휘묻이 일수가 진전될수록 그 차이는 적어지거나 미미하였다.
후속연구
- 본 실험에서 IAA 및 ABA 함량 변화를 살펴보았을 때 조 직배양묘의 유년화에 따른 발근력의 증가는 IAA 함량의 증가 보다는 ABA 함량의 감소에 따른 영향이 더 크다고 추측되지만 추가적인 실험이 필요하다고 생각한다.
- 그러나 본 실험은 기내 . 외 유래 대목의 세포벽 내 리그닌 함량의 차이만을 정량하였으므로 부정근 발생을 저해하는 기계적 장해의 경감, 세포벽 두께의 감소 등의 직 접적 관련 요인을 밝힐 추가적인 실험이 필요할 것으로 생 각되었다.
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