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문제 정의
- 옛부터 민간요법으로 유정이나 몽정, 조루증 증세에 야관문 전초를 썰어서 돼지고기와 함께 생강을 넣고 푹 고아 먹으면 아주 좋은 효과를볼 수 있다고 알려지고 있고, 민동본초, 귀주민간 약물(貴州民間藥物) 사천중약지(四川中藥誌) 등에서 신허유뇨(腎虛遺尿), 소갈(消渴), 유뇨(流尿) 등을 처방한 예와 구전에 의거하여 사용되고 있는 실정이다. 이에 본 연구에서는 야관문 추출물이 음경 해면체평활근 생리 활성에 대한 영향을 탐색하였다.
제안 방법
- 10-5 M Phenylephrine (PhE)에 의한 수축반응을 관찰한 후, PhE에 의하여 수축된 조직에서 acetylcholine(ACh., 10-7～10-5 M)에 의한 이완 반응을 측정하였다. ACh에 의한 이완반응에 대한 관찰이 끝난 후 organ bath를 관류용액으로 3회 이상 세척하였다.
- 장력의 표현은 약물의 투여 시 발생하는 최고 수축점 또는 최저 이완점을 기준으로 하였다. 10-5M PhE에 의한 수축을 100%로 정하고 투여 시약에 대한 이완 또는 수축반응을 %로 비례표시 하였다. 장력의 측정을 위하여서는 PowerLab data 400 acquisition system(Software Chart, version 5, AD Instrument, Castle Hill, Australia) 을 사용하였다.
- PhE(10-5 M)을 투여하여 수축반응을 관찰한 후 ACh(10-5 M)에 의한 이완반응을 측정하여 내피의 손상여부를 확인하였으며 ACh에 의한 이완반응이 40%이상이 되지 않으면 실험에 사용 하지 않았다.
- 7g이었다. PhE로 발생한 수축반응에 대한 ACh의 이완반응과 시료(A, C, D, E, G, G1, H, I, J)에 대한 반응을 PhE에 의한 수축반응에 대해 %로 비교하였다. ACh에 의한 이완반응은 해면체 내부 공간을 둘러싸고 있는 내피가 손상되지 않았음을 의미하였다.
- 해면체 조직은 처음에 1g을 기본 장력을 맞추 었으며, 약 60분간 기다려 안정화가 된 후 실험을 하였다. 매 15분마다 산소가 포화된 관류용액으로 바꾸어 주었으며, 실험이 시작되기 전까지 기본 장력을 1g이 되도록 다시 조정하였다. 약물의 투여는 낮은 농도부터 높은 농도로 축적하는 방식으로 하였으며, 최고의 이완점에 도달했을때 다음 농도의 약물을 투여 하였다.
- 한편 야관문 추출물의 농도를 제일 많은 량 20㎕를 투여한 시료들 중에서는 H 시료와 J시료가 95% 이상의 높은 이완 반응을 보였다. 시료중 최고 활성을 나타난 시료 H를 prep-HPLC 및 분석용 HPLC를 이용, YK-H1, YK-H2, YK-H3 및 YK-H4등 4개의 물질을 분리하였으며, 또한 시료 J를 prep-HPLC 및 분석용 HPLC를 이용하여 YK-J1, YK-J3 및 YK-J4 등 세 개의 물질을 분리하였다. 분리된 7개의 물질들의 구조 결정에 대한 연구를 진행하고 있다.
- 4로 맞추었다. 실험하는 동안 100% 산소를 투여 하였으며, organ bath의 온도는 37℃를 유지하였다.
- 야관문 잎 1kg을 음건하여 80% MeOH로 추출 하여, 감압농축 후 극성에 따라 n-hexane, EtOAc, n-BuOH 및 water층으로 분획하였다. 4개의 분획 층을 성기능 활성 시험 방법 중에 하나인 Organ bath(동물 음경해면체 절편을 이용한 생체외 실험) 시험 결과 n-hexane층이 가장 활성이 높은 것으로 나타났다(Fig.
- 매 15분마다 산소가 포화된 관류용액으로 바꾸어 주었으며, 실험이 시작되기 전까지 기본 장력을 1g이 되도록 다시 조정하였다. 약물의 투여는 낮은 농도부터 높은 농도로 축적하는 방식으로 하였으며, 최고의 이완점에 도달했을때 다음 농도의 약물을 투여 하였다. 관류용액을 바꾼 후 새로운 약물을 투여 할 때는 조직의 안정화를 위하여 약 5～10분 정도 기다렸다.
- 이에 n-hexane층을 다시 Silica gel column을 사용하여 chloroform : MeOH(10:0～0:10)로 극성에 따라 Scheme 1과 같이 10개로 분획하였으며, 분획 시료 B와 G에서는 각각 침전물을 얻었고, 모든 시료에 대한 음경해면체 실험한 결과의의있는 결과를 얻었다.
- 장력의 표현은 약물의 투여 시 발생하는 최고 수축점 또는 최저 이완점을 기준으로 하였다. 10-5M PhE에 의한 수축을 100%로 정하고 투여 시약에 대한 이완 또는 수축반응을 %로 비례표시 하였다.
- 조직이 안정되면, PhE를 다시 투여하여 수축을 시킨 후 야관문에서 추출한 시료를 낮은 농도부터 높은 농도로(10uL, 15uL, 20uL) 점진적으로 투여하여 시료에 의해 일어나는 반응을 관찰 하였다.
대상 데이터
- 그리고 Silica gel(70～230 mesh, Merk, Germany), TLC plate (20×20 cm, Kieselgel 60 F254, Merck)를 사용하였고, Sephadex LH-20(25～100μm, Pharmacia Biotech, Sweden)을 사용하였다. Acetycholine (ACh), HEPES, phenylephrine(PhE)는 미국의 Sigma 회사로부터 구입하여 사용하였다.
- HPLC는 LC900(JASCO, Japan)을 사용하였고, MPLC는 Combi Flash(ISCO, U.S.A)를 사용 하였다. NMR spectrometer는 NMR Bruker (600MHz)를 UV-vis spectrophotometer는 carry 100conc(Varian)을 사용하였다.
- A)를 사용 하였다. NMR spectrometer는 NMR Bruker (600MHz)를 UV-vis spectrophotometer는 carry 100conc(Varian)을 사용하였다.
- 본 실험에서 사용된 n-hexane, chloroform, ethyl acetate, ethanol, methanol, n-butanol, 등용매는 국내 삼전순약 제품을 사용하였다. NMR용 용매는 methanol-d4(Merck, Germany), (Methyl sulfoxide)-d6(Aldrich, U.S.A), chloroform-d (Aldrich, U.S.A)를 사용하였으며, HPLC용 시약은 methanol(삼전순약 ; 정제후 사용), acetonitrile (J.T. Baker, U.S.A.)를 사용하였다. 그리고 Silica gel(70～230 mesh, Merk, Germany), TLC plate (20×20 cm, Kieselgel 60 F254, Merck)를 사용하였고, Sephadex LH-20(25～100μm, Pharmacia Biotech, Sweden)을 사용하였다.
- )를 사용하였다. 그리고 Silica gel(70～230 mesh, Merk, Germany), TLC plate (20×20 cm, Kieselgel 60 F254, Merck)를 사용하였고, Sephadex LH-20(25～100μm, Pharmacia Biotech, Sweden)을 사용하였다. Acetycholine (ACh), HEPES, phenylephrine(PhE)는 미국의 Sigma 회사로부터 구입하여 사용하였다.
- 또한 시료 J를 prep-HPLC를 이용, Fr.1, Fr.2, Fr.3 및 Fr.4등 4개의 시료를 분리하였다. Fr.
- 본 실험에서 사용된 n-hexane, chloroform, ethyl acetate, ethanol, methanol, n-butanol, 등용매는 국내 삼전순약 제품을 사용하였다. NMR용 용매는 methanol-d4(Merck, Germany), (Methyl sulfoxide)-d6(Aldrich, U.
- 시료중 최고 활성을 나타난 시료 H를 사용하여 prep-HPLC를 이용, Fr.a, Fr.b, Fr.c 및 Fr.d등 4개의 시료를 분리하였으며, Fr.c에서 YK-H3을 얻었고 Fr.d에서 YK-H4를 얻었다. Fr.
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나. 동물실험
실험동물은 전북대학교 의과대학 동물 사육장에서 동일 조건하에 사육된 Newzealand White 종 수컷 토끼 체중 2.5～3.4 Kg를 사용하였다. 조직의 준비과정을 간단히 설명하면 다음과 같다 (Park JK.
- 야관문 잎은 강원도의 한약재 시장에서 구입 하여 음지에서 건조시킨 후 잎을 따로 분리하여 사용하였다.
- 조직의 절편은 2ml의 organ bath에 수직으로 위치시키고, 조직에서 발생한 장력은 physiograph 용지에 기록하였다. 이때 사용한 용액은 HEPES 이며, 이의 조성은 (mM) NaCl 118, KCl 4.7, CaCl2 2.5, MgCl2 2, NaHCO3 25, glucose 10.0, HEPES 10이며, 1N NaOH 용액을 이용하여 pH 를 7.4로 맞추었다. 실험하는 동안 100% 산소를 투여 하였으며, organ bath의 온도는 37℃를 유지하였다.
데이터처리
- 마이크로소프트사의 Excel과 Origin 5.0을 이용 하였고, paired Student t-test로 검증하였으며 p ＜0.05를 의의있는 것으로 판정하였다. 통계학적인 수식은 평균±표준오차로 표시하였다.
- 05를 의의있는 것으로 판정하였다. 통계학적인 수식은 평균±표준오차로 표시하였다.
이론/모형
- 10-5M PhE에 의한 수축을 100%로 정하고 투여 시약에 대한 이완 또는 수축반응을 %로 비례표시 하였다. 장력의 측정을 위하여서는 PowerLab data 400 acquisition system(Software Chart, version 5, AD Instrument, Castle Hill, Australia) 을 사용하였다.
성능/효과
- 20㎕를 투여시에는 H시료가 15㎕ 투여시와 마찬가지로 최고 반응(99.4%)을 보였으며 J시료도 95.7%의 높은 이완 반응을 보였다. I시료의 경우에는 시료 부족으로 인하여 20㎕ 투여 시험을 수행하지 못했다.
- 야관문 잎 1kg을 음건하여 80% MeOH로 추출 하여, 감압농축 후 극성에 따라 n-hexane, EtOAc, n-BuOH 및 water층으로 분획하였다. 4개의 분획 층을 성기능 활성 시험 방법 중에 하나인 Organ bath(동물 음경해면체 절편을 이용한 생체외 실험) 시험 결과 n-hexane층이 가장 활성이 높은 것으로 나타났다(Fig. 2).
- 각 시료를 10㎕씩 투여하였을 때 C시료의 최저 이완 작용(4.8±1.4%)을 보인 반면 A시료는 최고 이완작용(20.2±6.0%)을 보였다. 시료 C와 G-1를 제외한 모든 시료에서 ACh 10-7 M에 의한 이완반응 즉 7.
- 0%)을 보였다. 시료 C와 G-1를 제외한 모든 시료에서 ACh 10-7 M에 의한 이완반응 즉 7.8%보다 높은 10%이상의 이완 반응 효과를 보였다. 또한 15㎕를 투여하였을 경우에는 C시료가 최저 반응(15.
- 실험한 전례(n=9)의 음경 해면체 평활근 절편이 PhE(10-5M)에 수축반응을 보였으며, 평균 수축력은 2.1±0.7g이었다. PhE로 발생한 수축반응에 대한 ACh의 이완반응과 시료(A, C, D, E, G, G1, H, I, J)에 대한 반응을 PhE에 의한 수축반응에 대해 %로 비교하였다.
- 야관문 n-hexane층에서 추출하여 분획한 9개 모든 시료에서 정도의 차이는 있으나 이완반응을 보였다(Fig. 3).
- 야관문에서 추출한 n-hexane층을 음경해면체 평활근의 활성물질 탐색한 결과 극성 별로 분리한 9개 모든 시료에서 정도의 차이는 있으나 음경해면체 평활근의 이완 반응을 일으켰으며, 추출물 10㎕ 투여한 9개 시료 중 A시료(20.2±6.0%) 가 최고의 이완 반응을 보였으며, 15㎕를 투여한 시료 중에서는 J시료(54.8±9.7%)가 최고의 이완 반응이 나타났다. 한편 야관문 추출물의 농도를 제일 많은 량 20㎕를 투여한 시료들 중에서는 H 시료와 J시료가 95% 이상의 높은 이완 반응을 보였다.
- 9%보다 더 강한 경향을 보였다. 한편 야관문 추출물의 농도를 제일 많은 량 20㎕를 투여한 시료들 중에서 E시료가 최저반응인 (28.9±0.6%)를 보였으며, 모든 시료에서 ACh에 의한 이완반응 10-6M정도 이상의 이완 반응을 보였다. G시료 경우에는 ACh 10-5M에 의한 이완반응 53.
- 7%)가 최고의 이완 반응이 나타났다. 한편 야관문 추출물의 농도를 제일 많은 량 20㎕를 투여한 시료들 중에서는 H 시료와 J시료가 95% 이상의 높은 이완 반응을 보였다. 시료중 최고 활성을 나타난 시료 H를 prep-HPLC 및 분석용 HPLC를 이용, YK-H1, YK-H2, YK-H3 및 YK-H4등 4개의 물질을 분리하였으며, 또한 시료 J를 prep-HPLC 및 분석용 HPLC를 이용하여 YK-J1, YK-J3 및 YK-J4 등 세 개의 물질을 분리하였다.
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