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문제 정의
- 본 연구에서는 RueCRUagraueoZeis)로부터 생 리 활성 물 질 탐색 연구의 일환으로 고혈압을 유발하는 angiotensin converting enzyme, 관절 염 을 유발하는 xanthine oxidase의 저해물질을 분리하고 저해효과를 검토하여 기능성을 입증 하고 항산화 효과와 항진균 효과를 살펴 봄으로서 기 능성 식 품 소재로서 활용키 위한 기초 자료를 마련하고자 하였다.
제안 방법
- 45 Um membrane filter로 제균한 추출물 100 11L를 흡수시키고, 대조구로는 멸균수를 사용하였다. 37℃의 미호기성 조건에서 24시간 동안 배양한 다음, disc 주위의 저해환 생성 유무를 확인하여 지름을 측정하였다.
- DPPH( a, a -diphenyl-P-picrylhydrazyl) radical에 대한 소거활성은 Blois(ll)의 방법을 변형하여 측정하였다. 각 시료 0.
- Rue잎 을 물과 에 탄올로 추출하여 항균활성 과 생 리 활성 효과를 탐색하였다. 그 결과 각 추출물의 총페놀 함량은 물 추 출물에서 16.
- 37℃의 미호기성 조건에서 48~72시간 동안 배양한 후 분광광도계를 이용하여 570 nm에서 흡광도를 측정하였으며, 표준곡선을 이용하여 균수를 구한 후 저해율(%) = {1 — (반응구의 균수/대조구의 균수)X1。이의 식으로 계산하였다. disc paper 방법(8)으로 H. pylori 평 판 최적 배지 (최적 으』체 게, 지 에 0.75 g agar 첨 ;가) 에 H. pylori 균 100 UL를 분주 하여 멸균 유리봉으로 도말한 다음, 멸균된 disc paper(0 8 mm)를 올리고 0.45 Um membrane filter로 제균한 추출물 100 11L를 흡수시키고, 대조구로는 멸균수를 사용하였다. 37℃의 미호기성 조건에서 24시간 동안 배양한 다음, disc 주위의 저해환 생성 유무를 확인하여 지름을 측정하였다.
- Tarladigis 등(19)은 지방의 산화는 시간의 경과, 지방산 의 조성, 산소의 활성, 항산화제 등 여러 영 향인자에 의해 영 향 을 받는다고 보고하였다. 따라서 추출물의 상대적 인 항산화 력의 측정은 potassium persulfate와의 반응에 의해 생성된 ABTS free radical이 추출물의 항산화력 물질 에 의해 제거 되어 radical 특유의 색인 청록색이 탈색되는 것을 이용한 방법을 사용하였고, PF의 측정 을 위하여 6-carotene을 첨 가 한 linoleic acid emulsion을 사용하여 Rue 추줄물의 항산화 력을 측정하였다. 그리고 아스코르빈산, 토코페롤, polyhydroxy 방향족 화합물, 방향족 아민류에 의하여 환원되어 짙 은 자색이 탈색되는 것을 이용하여 전자공여능을 측정하였으며, TBARS는 지방의 산화에 의해 생기는 malonaldehyde 의 양을 측정하여 추출물의 항산화력을 확인한 결과, Table 8과 같이 전자공여능은 열수추출물과 알콜추출물이 89.
- 2 mL를 섞 은 후 50℃ water bath에서 10시간 반응시 켰 다. 반응 후 반응액 1 mL에 TBA/TCA 시 약 2 mL를 가하고 15분간 boiling한 다음 10분간 냉 각시 킨 후 15분간 1,000 rpm으로 원심 분리 하여 실온에서 10분간 방치후 상징 액을 532 nm에서 흡광도를 측정 하였으며, TBARS값은 1 mL 반응혼합물에 대해서 생성된 l, l, 3, 3-tetra-ethoxypropane(TEP)의 Rg으로 표시 하였다.
- 액 체 배 양법 으로 H. pylori 최적 액 체 배 지 (50 mL당 special peptone 0.5 g, NaCl 0.25 g, yeast extract 0.25 g, beef extract 0.2 g 및 pyruvic acid 0.025 g) 5 mL에 H. pylori 100 μL를 분주하고 각 추출물을 0, 45 Um membrane filter로 제균하여 0.5 mL씩 주입 하고 대조구에는 멸균수를 사용하였다. 37℃의 미호기성 조건에서 48~72시간 동안 배양한 후 분광광도계를 이용하여 570 nm에서 흡광도를 측정하였으며, 표준곡선을 이용하여 균수를 구한 후 저해율(%) = {1 — (반응구의 균수/대조구의 균수)X1。이의 식으로 계산하였다.
- Xanthine oxidase 활성저 해 측정 법은 Stirpe와 Corte(lO) 의 방법에 준하여 측정하였다. 즉, 반응구는 0.1 M potassium phosphate buffer(pH 7.5)에 xanthine 2 mM을 녹인 기질액 3 이에 효소액 0.1 mL와 추출용액 0.3 mL를 넣고 대조구에 는 추출용액 대신 증류수를 0.3 mL 첨가하여 37℃에서 30분 간 반응시 키고 20% trichloroacetic acid(TCA) 1 ml工를 가하여 반응을 종료시킨 다음 원심분리하여 단백질을 제거한 후 반응액 중에 생성된 uric acid를 흡광도 292 nm에서 측정하여 저해율(%) = {1 — (반응구의 uric acid의 생성량/대조구의 uric acid의 생성량)X 100}의 식으로 저해율을 구하였다.
대상 데이터
- Butylated hydroxytoluene(BHT), 2, 2'-azinobis(3-ethyl- benzothiazoline-6-sulfonic acid)(ABTS), yeast extract, beef extract, pyruvic acid, P-carotene, H2O2, linoleic acid, tween 40, a, a -diphenyl-f-picrylhydrazyKDPPH), xanthine oxidase, xanthine, angiotensin converting enzyme (ACE), hippuryl-L-histidyl-L-leucine(HHL), hippuric acid 등은 Sigma사(USA)의 특급시약을 사용하였으며, 시료의 페놀 분리 에 사용한 HPLC는 Agilent 1100 series와 VWD 1100 detector를 사용하였고 이동상으로는 메탄올은 J.T. Baker人}.의 HPLC급을 phosphoric acid, Folin-ciocalteu人] 약, trichloro-acetic acid, NazCCb, HC1 등은 일제 특급시약 을 사용하였다.
- 실험에 사용한 균주는 위 , 십 이 지 장구』양 원 인균인 H. py- ZcW로서 표준균주인 ATCC 43504를 사용하였다. H.
이론/모형
- 5 mL에 60 UM DPPH 3 mL를 넣고 vortex한 후 15분 동안 방치 한 다음 517 nm에서 흡광도를 측정하여 (시료 첨가 구 흡광도-대조구의 홉광도/ 대조구의 흡광도) X I00으로 나타내었다. ABTS radical cation decolorization의 측정은 P이legrin 등(12)의 방법에 의해 측정하였다. 즉, 7 m曲 ABTS [2, 2‘-azinobis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid)] 5 ml工와 140 mM K2S2O8 88 UL를 섞 은 용액 1 mL와 ethanol 88 mL를 혼합한 ABTS용액 1 mL와 시료용액 5011L를 혼합 하여 30초간 진탕한 후 2.
- Angiotensin converting enzyme 저 해효과 측정은 Cush- man과 Ond의xi(9)의 방법으로 행하였다. 즉, 반응구는 0.
- 5분간 incubatioir하고 734 nm에서 흡광도를 측정하였다, ABTS radical cation decolorization 효과는 percentage inhibition]%)으로 나타내었다. Antioxidant Protection Factor(PF)는 Andarwulan과 Shetty의 방법 (13)으로 측정하였다. 10 mg의 p-carotene/50 mL chloroform 용액 1 mL를 evaporator용 수기에 넣고 40℃ water bath에서 chloroform을 증류시 킨 후 20 μL linoleic acid, 184 μL Tween 40과 50 mL H2O2를 가하여 emulsiorr을 만들고, 5 mL의 emulsion에 시료용액 100 虬를 혼합하여 vortex로 잘 섞 어준 뒤 50℃에서 30분간 반응시 켜 냉각시 킨 다음 식 힌 다음, 470 nm에서 흡광도를 측정하였다.
- PF=반응구의 흡 광도/대조구의 흡광도로 나타내었다. Thiobarbituric acid reactive substances(TBARS)Buege와 Aust의 방법 (14) 에 따라 측정하였다. 1% linoleic acid와 1% Tween 40으로 emulsion을 만들고 emulsion 0.
- Xanthine oxidase 활성저 해 측정 법은 Stirpe와 Corte(lO) 의 방법에 준하여 측정하였다. 즉, 반응구는 0.
성능/효과
- 90%보다 높게 나타났으며 활성 산소중 지 방산화를 일으키 는데 주요 한 역할을 하는 hydroxyl radical에 대한 각 추출물의 영 향은 알콜 추출물이 binding 능력이 탁월하여 물 추출물에 비해 낮은 TBARS 값을 나타내었다. Angiotensin converting enzyme과 xanthine oxidase 저 해 활성은 알콜 추출물이 물 추출물보다 더 높게 나타났고, HPLC에 의한 페놀 분석 결과 rosemarinic acid의 함량이 알콜 추출물에서 가장 많았으며 다음으로 qurcetin 함량이 높게 나타났다.
- 8보다 높게 나타났다. DPPH에 대한 전자공여 능은 물 추출물이 89.38로 알콜 추출물 86.90%보다 높게 나타났으며 활성 산소중 지 방산화를 일으키 는데 주요 한 역할을 하는 hydroxyl radical에 대한 각 추출물의 영 향은 알콜 추출물이 binding 능력이 탁월하여 물 추출물에 비해 낮은 TBARS 값을 나타내었다. Angiotensin converting enzyme과 xanthine oxidase 저 해 활성은 알콜 추출물이 물 추출물보다 더 높게 나타났고, HPLC에 의한 페놀 분석 결과 rosemarinic acid의 함량이 알콜 추출물에서 가장 많았으며 다음으로 qurcetin 함량이 높게 나타났다.
- Disc paper법으로 H. pylori 평판 최적배지에서 즉정한 결과 Table 4에서 와 같이 물 추출군에서 는 페 놀함량을 각각 150 Ug/mL와 200 Pg/mL 첨가했을 때 10 mm, 12 mm의 clear zone을 형 성 하였으며 , 알콜 추줄물에서 는 페놀 첨가량 이 50 — 200 ug/mL로 증가함에 따라 9 mm, 10 mm, 11 mm, 13 mm의 clear zone이 형성되어 H. pylori0^ 대한 억제효과가 있는 것으로 나타났으며, 항균활성 검 정은 H. pylori 최적 액 체 배지 에서 측정한 결과, Table 5에서와 같이 물 추출물 에서 역시 페놀 150 Ug/mL와 200 Ug/mL 첨가했을 때 저 해 활성을 찾아 볼 수 있었고, 알콜 추출물에서 또한 페놀 첨가 량 별로 8.57%, 8.57%, 16.13%, 26.49%로 열수 추출보다 알 콜 추출물에서 더 높은 저 해 활성을 나타내었다. 이것은 물 과 알콜 즉 용매의 극성 이 각각 다르기 때문에 추출되는 페 놀의 종류의 차이에 따른 것으로 사료되어진다.
- HPLC를 이용하여 생리 활성에 관여하는 6종의 페놀 pro- tocatecuic acid, caffeic acid, chlorogenic acid, courmeric acid, rosemarinic acid, quercetin을 선택 하여 시료중의 이러한 페놀 존재 유무 확인을 위해 표준물질과 retention time을 비교하여 정량 분석한 결과 Table 3과 같이 protocatecuic acid는 검출되지 않았으며 알콜 추출물에서 방부 작용에 효과가 있는 rosemarinic acid 함량이 높은 것으로 나타나 식품 이나 화장품 등의 변질을 막는 천연 방부제의 역할을 기대할 수 있으며 flavonoid 물질인 quercetin 함량도 높은 것으로 나타나 혈압강하 작용에 효과가 있을 것으로 생각된다.
- Rue잎 을 물과 에 탄올로 추출하여 항균활성 과 생 리 활성 효과를 탐색하였다. 그 결과 각 추출물의 총페놀 함량은 물 추 출물에서 16.39 mg/g 알콜 추출물에서 17.07 mg/g로 나타났다. Helicobacter py/cn.
- 따라서 추출물의 상대적 인 항산화 력의 측정은 potassium persulfate와의 반응에 의해 생성된 ABTS free radical이 추출물의 항산화력 물질 에 의해 제거 되어 radical 특유의 색인 청록색이 탈색되는 것을 이용한 방법을 사용하였고, PF의 측정 을 위하여 6-carotene을 첨 가 한 linoleic acid emulsion을 사용하여 Rue 추줄물의 항산화 력을 측정하였다. 그리고 아스코르빈산, 토코페롤, polyhydroxy 방향족 화합물, 방향족 아민류에 의하여 환원되어 짙 은 자색이 탈색되는 것을 이용하여 전자공여능을 측정하였으며, TBARS는 지방의 산화에 의해 생기는 malonaldehyde 의 양을 측정하여 추출물의 항산화력을 확인한 결과, Table 8과 같이 전자공여능은 열수추출물과 알콜추출물이 89.38 %, 86.90%였으며 ABTS*는 열수추출물이 96.61%, 알콜추 출물이 93.00%로 높은 항산화력을 나타냈으며 PF는 0.83, 1.20의 비교적 낮은 값을 나타내었고 지방산패정도를 나타내는 TBARS는 대조구의 62.0 PM에 비해 열수추출물 첨 가 구가 14.1 UM, 알콜추출물 첨 가구가 13.9 로 나타나 물과 알콜 추출물간의 지 방 산화력 의 차이는 뚜렷하지 않은 것으로 나타났다.
- Xantine oxidase는 생 체내 퓨린 대사에 관여하는 효소로 xanthine 혹은 hypoxanthine으로부터 urate를 형 성 하여 혈 장내 urate가 증가되면 골절 에 축적 되어 심한 통증을 유발하는 통풍을 일으킨다(18). 따라서 XOase에 대한 Rue 추출물의 저 해 활성을 살펴본 결과 Table 7과 같이 물 추출물은 45.56 %, 알콜추출물은 100.00%의 높은 저 해 효과를 나타내었다. 이러한 결과로 볼 때 Rue 추출물에 함유된 phen이성 물질은 gout의 예방과 치료에 효과가 있음을 예측할 수 있었다.
- 에 대한 disc 방법에서 200 Ug/mL의 폴리 페놀 첨 가 시 물과 알콜 추출물은 각각 12 mm, 13 mm 의 직경을 나타내어 항균활성이 있음을 알 수 있었으며, 2-fold dilution 방법으로 항균활성 검증 결과 물 추출물보다 알콜 추출물에서 더 높은 항균활성을 나타내었다. 물과 알콜 각 추출물의 ABTS radical decolorlization과 antioxidant protection factor(PF)를 살펴 본 결과 ABTS는 물 추출물이 약 96%로 높은 저 해 율을 나타내 었 으며 PF는 알콜 추출물에서 1.2로 물 추출물 0.8보다 높게 나타났다. DPPH에 대한 전자공여 능은 물 추출물이 89.
- 이러한 산화 반응을 방지 하기 위하여 유리 소거 제를 이용하여 연쇄반응 의 전파단계에서 과산화기와 탈수소 반응을 통해 수소원자 를 공유함으로써 라디칼이 비교적 안정한 형태를 형성하게 되 는데 , 이러한 유리 소거 제 를 항산화제 라고 하며 , 페놀성 화 합물이 널리 이용되고 있다(15). 본 실험에서 사용한 Rue의 총 페 놀함량은 Table 2와 같이 물과 60% 에 탄올 추출물에서 각각 16.39 mg/g, 17.07 mg/g로 나타났다. Choi 등(16)이 홍차, 녹차 등에 함유되어 있는 총 페놀 함량이 10.
- Helicobacter py/cn.에 대한 disc 방법에서 200 Ug/mL의 폴리 페놀 첨 가 시 물과 알콜 추출물은 각각 12 mm, 13 mm 의 직경을 나타내어 항균활성이 있음을 알 수 있었으며, 2-fold dilution 방법으로 항균활성 검증 결과 물 추출물보다 알콜 추출물에서 더 높은 항균활성을 나타내었다. 물과 알콜 각 추출물의 ABTS radical decolorlization과 antioxidant protection factor(PF)를 살펴 본 결과 ABTS는 물 추출물이 약 96%로 높은 저 해 율을 나타내 었 으며 PF는 알콜 추출물에서 1.
- 00%의 높은 저 해 효과를 나타내었다. 이러한 결과로 볼 때 Rue 추출물에 함유된 phen이성 물질은 gout의 예방과 치료에 효과가 있음을 예측할 수 있었다.
- 추출물은 73.89%로 나타나 물 추출물보다 알코올 추출물이 ACE에 대해 더 높은 저해 활성을 나타내 고혈압 예방에 도움이 될 것으로 예상된다.
후속연구
- 5이며, 이 범위를 벗어난 산성이나 알칼리 조건 에서 발육하지 않는다고 보고되 었다(3). 우리나라 성 인 의 약 80% 정도가 이 균에 감염 되 었으나 임상증상을 나타내 지 않고 있다가 어떠한 발병 촉진인자의 영향으로 만성적 인 위십이지장 궤양을 유발한다는 보고(4) 등을 감안하여 볼 때 Helicobacter pylori 자체 에 대한 연구와 병 행 하여 Helicobacter pylorie 대한 근본적인 예방이나 치료를 위한 새로운 방법이 시도될 필요가 있다. 최근에는 식 물류에 들어있는 생리활성 성분에 대한 관심이 높아져 이들 생리활성 성분 을 함유한 천연식물 소재들을 천연 항산화제와 항진균제의 원료로 이용하려는 시도가 많이 이루어지고 있다.
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