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문제 정의
- 이 중에서 오매를 제외한 16종의 한약재 추출물의 urease 활성억제 작용에 대한 비교결과는 선행연구[12]에서 보고한 바 있다. 따라서 본 연구에서는 선행연구에서 상위 5위까지였던 약재(연교, 소목, 형개, 황련, 소엽)에 오매를 추가한 6가지 한약재에 대한 실험을 수행하였다.
- 본 연구에서는 urease 활성억제 작용이 강한 물질을 선정하기 위하여 전통동양약물 데이터베이스[14], 한국의 자원식물에 대한 문헌 자료[15] 등에 위를 보호하거나 항균효과가 있는 한약재를 검토하였다. 일차 선정된 한약재 17가지는 본 연구팀의 선행연구[12] 대상이었던 16가지 한약재에 오매가 추가된 것이다.
가설 설정
- Urea의 분해에 따른 phenol red의 color intensity의 변화를 spectrophotometer (Spectronic 20 D+, Milton Roy, USA)를 이용하여 560 nm에서 측정하였다. Urease의 작용에 대한 한약재 추출물의 억제효과가 강할수록 urea가 암모니아로 분해되는 정도가 낮아지게 되며 broth의 pH 증가도 적을 것이다. 이러한 pH 조건에서 phenol red는 황색으로 남아있게 되어 O.
제안 방법
- Silica gel column chromatography 3단계에서는 TLC 결과 silica gel로는 분리가 어렵다고 판단되어 octadecyl silica gel을 이용하였다. 3단계 실행에 앞서 octadecyl silica gel TLC (ODS-TLC)로 분석하여 methanol/water=10:1을 eluent로 선정하였다(Octadecyl SGCC in Fig. 1). 얻어진 3개의 분획(mw1~mw3) 중 mw3 분획의 urease 활성 억제효능이 가장 좋았고 urease의 상대 활성도가 control 대비 35.
- 9개의 분획물 중 urease 활성이 가장 낮은 n-hexane/ethyl acetate=3:1 분획에 대하여 chloroform/methanol/water=20:3:1 전개용매를 사용하여 2단계 silica gel column chromatography를 실시하고 5개의 분획으로 분리하였다. 5개의 분획물(cmw1~cmw5) 중 urease 활성이 가장 낮은 cmw3 분획에 대하여 methanol/water=10:1의 전개용매를 사용하여 3단계 column chromatography를 실시하고 3개의 분획물(mw1~mw3)을 얻었다. 이 3단계 분리에서는 TLC 분석 결과 silica gel로는 분리가 어렵다고 판단되어 resin을 octadecyl silica gel로 교체하여 사용하였다.
- 1단계 추출에서 사용한 전개용매의 비율은 n-hexane/ethyl acetate=15:1, 10:1, 5:1, 3:1, 1:1, 1:2과 chloroform/methanol=10:1, 5:1, 2:1이었다. 9개의 분획물 중 urease 활성이 가장 낮은 n-hexane/ethyl acetate=3:1 분획에 대하여 chloroform/methanol/water=20:3:1 전개용매를 사용하여 2단계 silica gel column chromatography를 실시하고 5개의 분획으로 분리하였다. 5개의 분획물(cmw1~cmw5) 중 urease 활성이 가장 낮은 cmw3 분획에 대하여 methanol/water=10:1의 전개용매를 사용하여 3단계 column chromatography를 실시하고 3개의 분획물(mw1~mw3)을 얻었다.
- Ethyl acetate 분획이 비극성이므로 전개용매를 비극성으로부터 극성쪽으로 점차 높여가면서 silica gel column chromatography를 수행하였다. 1단계 추출에서 사용한 전개용매의 비율은 n-hexane/ethyl acetate=15:1, 10:1, 5:1, 3:1, 1:1, 1:2과 chloroform/methanol=10:1, 5:1, 2:1이었다.
- Octadecyl silica gel chromatography(이하 Octadecyl SGCC라고 함)에는 LiChroprep RP-18 (40~63 µm, Merck)을 사용하였다.
- Silica gel column chromatography 2 단계는 hexane/ethyl acetate=3:1 분획을 대상으로 하였다. TLC 분석을 통하여 chloroform/methanol/water=20:3:1을 eluent로 선정하였다(SGCC2 in Fig. 1). Fraction collector로 300 drop씩 모으고 TLC를 이용하여 유사한 Korean Chem.
- 01 mg/mL) 7 mL가 들어있는 cuvette에 넣었다. Urea의 분해에 따른 phenol red의 color intensity의 변화를 spectrophotometer (Spectronic 20 D+, Milton Roy, USA)를 이용하여 560 nm에서 측정하였다. Urease의 작용에 대한 한약재 추출물의 억제효과가 강할수록 urea가 암모니아로 분해되는 정도가 낮아지게 되며 broth의 pH 증가도 적을 것이다.
- 농축하여 얻어진 세 분획(물, n-부탄올, ethyl acetate)에 대하여 100 mg/mL 농도의 분획물 20 µL를 H. pylori bacterial suspension (20 µL)에 첨가하여 urease 활성 억제능력을 측정하였다.
- 고자장 영역에 대해서 DEPT (Distortionless Enhancement by Polarization Transfer) spectrum과 비교 분석한 결과 5개의 4급탄소, 5개의 methine signal과 9개의 methylene signal 그리고 7개의 methyl signal을 각각 확인하였다. 따라서 1개의 carboxylic acid와 이중결합 1개 및 hydroxyl기를 가진 ursane 골격으로서 이와 같은 결과를 문헌과 비교한 결과, 이 화합물을 ursolic acid로 결정하였다(Fig. 4).
- 오매로부터 활성성분을 분리·정제하고자 하는 batch 추출과 column chromatography 실험에서도 동일한 방법을 사용하여 각 분획의 urease 활성을 측정하였다. 모든 실험은 두 번 반복하였고 각 경우에 대하여 2개의 sample을 분석하였다.
- 이 3단계 분리에서는 TLC 분석 결과 silica gel로는 분리가 어렵다고 판단되어 resin을 octadecyl silica gel로 교체하여 사용하였다. 얻어진 3개의 분획물 중 urease 활성이 가장 낮은 3번 분획(mw3)을 NMR로 분석하여 urease 활성 억제 성분의 구조를 확인하였다. 각 분획에 대한 urease 활성은 이전section(2.
- 오매로부터 활성성분을 분리·정제하고자 하는 batch 추출과 column chromatography 실험에서도 동일한 방법을 사용하여 각 분획의 urease 활성을 측정하였다.
- 오매에 들어있는 urease 활성 억제 물질을 분리·정제하는 첫 단계로 메탄올(80%)로 추출한 후 비극성 용매인 에틸아세테이트와 극성 용매인 물로 분배추출하였다.
- 용매 선정을 위해 thin layer chromatography (TLC)로 흡착제 및 전개용매를 여러 가지로 바꾸어서 Rf 값의 이동, spot 형의 변화를 검토하였다.
- 3D). 이 mw3 분획에 함유되어있는 물질의 구조를 핵자기 공명 장치(NMR)를 이용하여 분석하였다.
- 8 g을 얻었다. 이 메탄올 추출물을 비극성 용매인 ethyl acetate와 극성 용매인 물로 분배 추출하였고, 물 층을 다시 물보다 극성이 낮은 n-부탄올로 추출하였다(Fig. 1). 각 층을 농축하여 물 층, n-부탄올 층, ethyl acetate 층에서 각각 155.
- 본 연구에서 대상으로 한 한약재(연교, 소목, 형개, 황련, 소엽, 오매)의 에탄올(70%) 중에서 오매(Mume Fructus) 추출물이 가장 강력한 urease 활성억제 능력을 보였다. 이 오매에 함유된 urease 활성 억제성분을 극성이 다른 여러 가지 용매를 사용하여 회분식으로 추출하였고 이어서 실리카 겔 칼럼과 octadecyl 실리카겔 칼럼을 이용한 크로마토그래피로 분리·정제하였다. NMR 분석을 통하여 이 정제된 오매 추출물에 함유된 활성성분이 ursolic acid임을 규명하였다.
- 이 균주의 계대배양을 위한 액체배지로는 10 vol% horse serum (JRH Bioscience, USA)을 첨가한 brucella broth (Difco, USA) 배지를 이용하였다. 이상적인 배양조건을 맞추기 위하여 anaerobic jar (3 L, Difco, USA)에 혼합가스(10% CO2, 5% O2, 85% N2)를 주입하면서 진탕배양기에 고정하여 회전속도(120 rpm)와 온도(37℃)를 유지하였다.
- 회분식 용매추출에서 urease 활성 억제효과가 가장 크게 나타난 ethyl acetate 분획물에 대하여 실리카겔을 이용하여 두 단계 그리고 이어서 octadecyl 실리카겔을 이용하여 한 단계, 총 세 단계에 걸쳐서 column chromatography를 수행하였다(Fig. 1). Silica gel column chromatography (이하 SGCC라고 함)에는 silica gel 60 (63~200 µm, Merck)을 사용하였다.
- 회분식 추출에서 urease 활성 억제 물질이 가장 많이 포함된 에틸 아세테이트 분획을 대상으로 silica gel column chromatography를 수행하였다. 추출용매(eluent)는 9가지로서 n-hexane/ethyl acetate 혼합 용매 또는 chloroform/methanol의 혼합용매를 사용하였다(SGCC1 in Fig.
대상 데이터
- Silica gel column chromatography (이하 SGCC라고 함)에는 silica gel 60 (63~200 µm, Merck)을 사용하였다.
- Silica gel column chromatography 2 단계는 hexane/ethyl acetate=3:1 분획을 대상으로 하였다. TLC 분석을 통하여 chloroform/methanol/water=20:3:1을 eluent로 선정하였다(SGCC2 in Fig.
- 각 한약재는 경동시장에서 구매하여 60 mesh 크기의 분말로 만들어 각 한약재 10 g에 에탄올(70%) 100 ml에 넣고 80℃에서 1시간 동안 추출하였다. 각 추출물은 여과지(Whatman No.
- 대상 한약재는 전통동양약물 데이터베이스와 한국의 자원식물에 관한 문헌자료, 전문가와의 상의를 거쳐 위를 보호하거나 항균효과가 있는 한약재 17종(소엽, 연교, 치자, 백출, 창출, 건강, 황금, 형개, 애엽, 갈근, 계피, 소목, 정향, 황련, 양강, 오수유, 오매)을 일차 선정하였다. 이 중에서 오매를 제외한 16종의 한약재 추출물의 urease 활성억제 작용에 대한 비교결과는 선행연구[12]에서 보고한 바 있다.
- 실험에 사용된 Helicobacter pylori는 경상대학교 의과대학에서 분양받은 ATCC 43504였다. 이 균주의 계대배양을 위한 액체배지로는 10 vol% horse serum (JRH Bioscience, USA)을 첨가한 brucella broth (Difco, USA) 배지를 이용하였다.
- 회분식 추출에서 urease 활성 억제 물질이 가장 많이 포함된 에틸 아세테이트 분획을 대상으로 silica gel column chromatography를 수행하였다. 추출용매(eluent)는 9가지로서 n-hexane/ethyl acetate 혼합 용매 또는 chloroform/methanol의 혼합용매를 사용하였다(SGCC1 in Fig. 1). Fraction collector로 300 drop씩 모아서 분리한 9개 분획을 비교하니 n-hexane/ethyl acetate=3:1을 eluent로 사용한 분획의 urease 활성 억제 효능이 가장 좋았고 urease의 상대활성도가 control 대비 3.
이론/모형
- 얻어진 3개의 분획물 중 urease 활성이 가장 낮은 3번 분획(mw3)을 NMR로 분석하여 urease 활성 억제 성분의 구조를 확인하였다. 각 분획에 대한 urease 활성은 이전section(2.-3)에서 설명한 방법을 사용하여 측정하였다.
성능/효과
- 5, October, 2013성분을 포함하는 것으로 판단되는 5개의 분획을 얻었다 (cmw1~cmw5). 5개의 분획 중 cmw3 분획의 urease 활성 억제 효능이 가장 좋았고 urease의 상대 활성도가 control 대비 22.0%에 불과하였다(Fig. 3C).
- 1). Fraction collector로 300 drop씩 모아서 분리한 9개 분획을 비교하니 n-hexane/ethyl acetate=3:1을 eluent로 사용한 분획의 urease 활성 억제 효능이 가장 좋았고 urease의 상대활성도가 control 대비 3.5%에 불과하였다(Fig. 3B).
- 이 오매에 함유된 urease 활성 억제성분을 극성이 다른 여러 가지 용매를 사용하여 회분식으로 추출하였고 이어서 실리카 겔 칼럼과 octadecyl 실리카겔 칼럼을 이용한 크로마토그래피로 분리·정제하였다. NMR 분석을 통하여 이 정제된 오매 추출물에 함유된 활성성분이 ursolic acid임을 규명하였다. Ursolic acid는 이미 의학문헌에 항균 및 항암효과가 보고되고 있는 물질이며 본 실험결과는 오매에 함유된 이 성분이 항생제를 대신하여 H.
- 5%에 불과하였다. O.D. 값을 기준으로 비교하였을 때 다른 다섯 가지 한약재 추출물보다 오매 추출물의 urease 활성 억제 능력이 월등히 강하였다.
- NMR 분석을 통하여 이 정제된 오매 추출물에 함유된 활성성분이 ursolic acid임을 규명하였다. Ursolic acid는 이미 의학문헌에 항균 및 항암효과가 보고되고 있는 물질이며 본 실험결과는 오매에 함유된 이 성분이 항생제를 대신하여 H. pylori 제거에 활용될 수 있음을 시사하였다.
- 2) 1개가 관측되었으며, 고자장 영역에서 다수의 signal이 관측되었다. 고자장 영역에 대해서 DEPT (Distortionless Enhancement by Polarization Transfer) spectrum과 비교 분석한 결과 5개의 4급탄소, 5개의 methine signal과 9개의 methylene signal 그리고 7개의 methyl signal을 각각 확인하였다. 따라서 1개의 carboxylic acid와 이중결합 1개 및 hydroxyl기를 가진 ursane 골격으로서 이와 같은 결과를 문헌과 비교한 결과, 이 화합물을 ursolic acid로 결정하였다(Fig.
- 8 Hz) signal이 관측되었다. 따라서 triterpenoid에서 보여지는 전형적인 pattern임을 알 수 있었으며, methyl signal의 특징으로부터 ursane 골격의 triterpenoid임을 추측할 수 있었다.
- 오매와 선행연구에서 urease 활성 억제능이 좋았던 약재 5가지(연교, 소목, 형개, 황련, 소엽)를 비교하였는데 오매 추출물의 urease 활성 억제 능력이 가장 우수하였다. 본 연구는 오매 추출물의 분리정제 및 NMR 분석을 통하여 오매에 함유된 urease 활성 억제물질이 ursolic acid임을 밝혔다. 문헌보고에 의하면 오매 추출물은 항산화[16] 및 항균[17]효과가 있으며, ursolic acid는 대장암, 피부암 및 간암세포에 대한 항종양 및 세포자살 효과가 있는 것으로 보고되었다[18-20].
- 위궤양, 위염 등의 질병을 일으키는 Helicobacter pylori 균이 강산성 조건인 위장에서 서식할 수 있는 것은 이 균이 생산하는 urease의 활성 때문으로 알려져 있다. 본 연구에서 대상으로 한 한약재(연교, 소목, 형개, 황련, 소엽, 오매)의 에탄올(70%) 중에서 오매(Mume Fructus) 추출물이 가장 강력한 urease 활성억제 능력을 보였다. 이 오매에 함유된 urease 활성 억제성분을 극성이 다른 여러 가지 용매를 사용하여 회분식으로 추출하였고 이어서 실리카 겔 칼럼과 octadecyl 실리카겔 칼럼을 이용한 크로마토그래피로 분리·정제하였다.
- 분리·정제된 물질의 NMR 분석결과 1 H-NMR (400 MHz, pyridine) spectrum에서 한 개의 olefin methine (δH 5.49, br s) 및 한 개의 oxygenated methine signal (δH 3.46, dd, J=10.0, 5.6 Hz)이 관측되었다.
- 1). 얻어진 3개의 분획(mw1~mw3) 중 mw3 분획의 urease 활성 억제효능이 가장 좋았고 urease의 상대 활성도가 control 대비 35.2% 이었다(Fig. 3D). 이 mw3 분획에 함유되어있는 물질의 구조를 핵자기 공명 장치(NMR)를 이용하여 분석하였다.
- 일차 선정된 한약재 17가지는 본 연구팀의 선행연구[12] 대상이었던 16가지 한약재에 오매가 추가된 것이다. 오매와 선행연구에서 urease 활성 억제능이 좋았던 약재 5가지(연교, 소목, 형개, 황련, 소엽)를 비교하였는데 오매 추출물의 urease 활성 억제 능력이 가장 우수하였다. 본 연구는 오매 추출물의 분리정제 및 NMR 분석을 통하여 오매에 함유된 urease 활성 억제물질이 ursolic acid임을 밝혔다.
- 1). 이렇게 얻어진 세 개의 분획 중 물과 n-부탄올 분획에서는 한약재 추출물을 넣지 않은 대조군(control)과 비교하여 O.D. 값이 각각 20.0% 및 14.5% 낮았으며 이는 urease 활성 억제가 크지 않았음을 나타낸다. 이와 달리 에틸아 세테이트 분획의 O.
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