[국내논문]미성숙 돼지 정조세포 배양에 미치는 배양액, 배양온도 및 공배양 효과 Effect of Culture Medium, Temperature and Coculture on Culture of Immature Porcine Spermatogonia Cells원문보기
본 연구는 가축유전자원의 효율적 보존을 위해 정조세포를 줄기세포 형태로 장기보관하면서 필요에 따라 증식, 분화를 통해 가축의 복원에 활용하기 위한 연구의 일부로 진행되었다. 정조세포를 분리하여 배양한 결과 배양온도는 다른 세포들과는 달리 $32^{\circ}C$에 세포분열이 활발하였으며, TCM199에 $10\%$ FCS를 첨가한 배양액과 세르톨리세포 공배양으로 정조세포의 배양을 지지하였다. 40일령이 지나면서 정조세포 콜로니 즉 germline stem cells를 형성하였으며, 일부에서는 외형상 ES-like cells를 형성하거나, 세정관 형태로 정조세포들이 재구성되었다. 40일령까지 배양한 상태에서는 정조세포의 정모세포나 정자세포로 분화하는 징후를 관찰할 수 없었으며, 추후 이들 세포로 분화를 유기하는 실험이 진행되어야 할 것이다.
본 연구는 가축유전자원의 효율적 보존을 위해 정조세포를 줄기세포 형태로 장기보관하면서 필요에 따라 증식, 분화를 통해 가축의 복원에 활용하기 위한 연구의 일부로 진행되었다. 정조세포를 분리하여 배양한 결과 배양온도는 다른 세포들과는 달리 $32^{\circ}C$에 세포분열이 활발하였으며, TCM199에 $10\%$ FCS를 첨가한 배양액과 세르톨리세포 공배양으로 정조세포의 배양을 지지하였다. 40일령이 지나면서 정조세포 콜로니 즉 germline stem cells를 형성하였으며, 일부에서는 외형상 ES-like cells를 형성하거나, 세정관 형태로 정조세포들이 재구성되었다. 40일령까지 배양한 상태에서는 정조세포의 정모세포나 정자세포로 분화하는 징후를 관찰할 수 없었으며, 추후 이들 세포로 분화를 유기하는 실험이 진행되어야 할 것이다.
This study was carried out for development of effective preservation on animal genetic resources. Spermatogonia cells are the germline stem cells and they can be restored to adult animal with proliferation and differentiation intentionally. When the spermatogonia cells were purified from seminiferou...
This study was carried out for development of effective preservation on animal genetic resources. Spermatogonia cells are the germline stem cells and they can be restored to adult animal with proliferation and differentiation intentionally. When the spermatogonia cells were purified from seminiferous tubules and were cultured at $32^{\circ}C$, the cells were actively proliferated. The culture medium consisted of TCM199 plus $10\%$ FCS and coculture with Sertoli cells supported cultivation of spermatogonia cells. By passing 40 days of incubation, spermatogonia cells formed the germline colony or shape of ES-like colony or reconstruction of pseudo-seminifcrous tubule shape. At 40 days, the cultured cells were no sign for differentiation to spermatocyte or spermatid. The experiment of induced differentiation of this cells is needed.
This study was carried out for development of effective preservation on animal genetic resources. Spermatogonia cells are the germline stem cells and they can be restored to adult animal with proliferation and differentiation intentionally. When the spermatogonia cells were purified from seminiferous tubules and were cultured at $32^{\circ}C$, the cells were actively proliferated. The culture medium consisted of TCM199 plus $10\%$ FCS and coculture with Sertoli cells supported cultivation of spermatogonia cells. By passing 40 days of incubation, spermatogonia cells formed the germline colony or shape of ES-like colony or reconstruction of pseudo-seminifcrous tubule shape. At 40 days, the cultured cells were no sign for differentiation to spermatocyte or spermatid. The experiment of induced differentiation of this cells is needed.
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문제 정의
본 연구는 가축 유전자원의 효율적 보존을 위해 정조세포를 줄기세포 형태로 장기 보관하면서 필요에 따라 증식, 분화를 통해 가축의 복원에 활용하기 위한 연구의 일부로 진행되었다. 정조세포를 분리하여 배양한 결과 배양 온도는 다른 세포들과는 달리 32℃에 세포분열이 활발하였으며, TCM199에 10% FCS를 첨가한 배양액과 세르톨리 세포 공배양으로 정조세포의 배양을 지지하였다.
제안 방법
5℃ 가습 배양기에서 각각 배양하였다. 배양 직후, 1일, 2일, 3일, 5일까지 배양하며 세포 증식 정도와 세포 형태 변화를 관찰하였다.
2mg/ml DNase를 첨가한 다음 40㎛ Nylon mesh를 통과시켜 세포들을 더욱 분리한 후 신선한 Ca2-, Mg2+ free PBS로 교체하였다. 분리된 세포들을 Percoll (Sigma , USA)을 이용하여 20%와 40% 두개층으로 불연속 밀도구배를 만들어 원심분리 후 20%와 40% 연접한 층에서 세포들을 회수하였다. 회수된 세포들을 32℃ 가습배 양기에 60mm dish(Falcon, USA) 12시간 배양하여, 바닥에 부착된 세포들이 회수되지 않게 주의하여 상층을 분리하여 원심분리한 후 정조세포들을 회수하였다.
분리된 정조세포들을 2,000cells/㎠의 농도로 TCM199(Gibco, USA)에 10% 소태아 혈청을 첨가하여 배양하거나, Ham's F-10(Gibco, USA)에 10% 소태아 혈청을 첨가하여 32℃와 38.5℃ 가습 배양기에서 각각 배양하였다. 배양 직후, 1일, 2일, 3일, 5일까지 배양하며 세포 증식 정도와 세포 형태 변화를 관찰하였다.
생후 1〜2주된 돼지의 정소를 분리하여, 백막을 제거하고 정소 실질을 세분하여, 세분된 정소 실질을 Ca2+, Mg2+ free PBS(Gibco, USA)에 0.8mg/ml 농도의 collagenase(Gibco, USA), 0.01 mg/ml DNase(Sigma, USA), l㎍/ml trypsin inhibitor(Sigma, USA)가 첨가된 배양액에서 shaking water bath로 1시간 교반하였다 . 효소에 의해 분해된 세정관들을 3번 세척한 후 0.
세르톨리 세포와 공배양한 처리에서 월등히 높은 분열 효율을 보였는데, 세르톨리 세포에서 분비되는 인자 혹은 상호 접촉자극으로 이러한 증진 효율을 보인 것으로 사료되며, 40일간 배양한 후에는 공배양된 처리에서 콜로니를 형성하며, 세포구를 만들었다. 형성된 세포구가 배아줄기세포를 배양했을 때 형성되는 ES cells와 형태상으로는 유사하나 그 특성은 확인되지 않았다.
세포 증식 정도를 결정하기 위하여 배양세포들을 5군데 영상 캡쳐해서 cells/cni로 환산하여 결정 하였다.
01 mg/ml DNase(Sigma, USA), l㎍/ml trypsin inhibitor(Sigma, USA)가 첨가된 배양액에서 shaking water bath로 1시간 교반하였다 . 효소에 의해 분해된 세정관들을 3번 세척한 후 0.5mg/ml trypsin(Sigma, USA)이 첨가된 배양액으로 5분간 추가 교반한 후, 0.1mg/ml trypsin inhibitor와 0.2mg/ml DNase를 첨가한 다음 40㎛ Nylon mesh를 통과시켜 세포들을 더욱 분리한 후 신선한 Ca2-, Mg2+ free PBS로 교체하였다. 분리된 세포들을 Percoll (Sigma , USA)을 이용하여 20%와 40% 두개층으로 불연속 밀도구배를 만들어 원심분리 후 20%와 40% 연접한 층에서 세포들을 회수하였다.
성능/효과
본 실험의 조건에서는 정조세포의 증식에 세르톨리 세포와의 공배양 자극이 필수적이라는 것을 보여주며, 40일간 배양한 상태에서 ES-like cells의 형성이나 세정관 형태로 재구성은 일어나나, 정조세포의 이후 분화 단계인 정모세포나 정자세포, 정자로 분화되는 특별한 징후는 보이지 않았다.
본 연구는 가축 유전자원의 효율적 보존을 위해 정조세포를 줄기세포 형태로 장기 보관하면서 필요에 따라 증식, 분화를 통해 가축의 복원에 활용하기 위한 연구의 일부로 진행되었다. 정조세포를 분리하여 배양한 결과 배양 온도는 다른 세포들과는 달리 32℃에 세포분열이 활발하였으며, TCM199에 10% FCS를 첨가한 배양액과 세르톨리 세포 공배양으로 정조세포의 배양을 지지하였다. 40일령이 지나면서 정조세포 콜로니즉 germline stem cells를 형성하였으며, 일부에서는 외형상 ES-like cells를 형성하거나, 세정관 형태로 정조세포들이 재구성되었다.
5℃로 나누어서 배양한 결과는 Table 1과 같다. 처음 파종하였을 때 정조세포수는 각 처리 별로 2,000cells/㎠이었으나, 배양 1일, 2일, 3일, 5일부터 처리별로 분열 속도가 달랐다 32℃로 배양했을 때가 분열 속도가 빨랐으며, Ham's F-10보다 TCM199로 배양하였을 때 분열 속도가 더욱 빨랐다. 배양 5일째에는 정조세포수가 32℃ 배양조건에서 TCM199로 배양했을 때 14,000 cells/cni로 증식되었다.
후속연구
40일령이 지나면서 정조세포 콜로니즉 germline stem cells를 형성하였으며, 일부에서는 외형상 ES-like cells를 형성하거나, 세정관 형태로 정조세포들이 재구성되었다. 40일령까지 배양한 상태에서는 정조세포의 정모세포나 정자세포로 분화하는 징후를 관찰할 수 없었으며, 추후 이들 세포로 분화를 유기하는 실험이 진행되어야 할 것이다.
일반 세포들은 37〜39℃에서 정상적으로 배양되는 것과는 달리 조정 관련 세포들은 32℃에서 배양이 더욱 잘 되는 것은 정소가 복강 외부에 저온 상태로 유지되는 것과 관련이 있는 것으로 생각된다. 배양액에 따른 차이는 정확하게 알 수는 없으나, TCM199에서 세포 증식율이 높게 나타난 원인은 추후 더욱 규정되어야 할 것이다. Izadyar 등(2003)은 소에서 type A 정조세포를 2〜4주간 배양하여 콜로니를 형성하였는데 일부 콜로니는 c-kit에 양성으로 형태학적으로나 분자생물학적 특성으로 볼 때 정모세포와 정자세포로 추정되었으며, 일부 크고 둥근 콜로니는 c-kit 음성으로 정조줄기세포로 추정된다고 보고하였다.
자연적인 생식 줄기세포인 정조세포는 체내에서 정모세포, 정자세포, 정자로 계속적인 분화가 일어나는 특징을 가지고 있다. 체외에서 배양한 정조세포를 체내로 이식하면 정상적으로 조정 기능을 수행하는데, 이러한 정조세포를 줄기세포특징을 이용하여 유전자원 보존 및 복원에 활용할 수 있다면 기존의 동물 유전자원 보존방법보다 효율적일 것이다.
그러나 포유동물에서 감수 분열을 포함한 체내에서 일어나는 정자 생성과정의 체외에서 완전한 재현은 아직까지 모호한 상태이다. 포유동물의 체외 정자 생산과정이 밝혀진다면 (1) 유전자원 보존방법으로 활용뿐만 아니라 (2) 조정세포 생성의 기작이해 (3) 웅성 생식세포의 직접적인 유전 자 변형(4) 웅성요인에 따른 불임의 처치 등에 활용이 가능할 것으로 기대된다.
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