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문제 정의
- 따라서 본 연구에서는 현재 일반적으로 이용되고 있는 몇 종의 동결 희석액과 냉각속도 및 이ycerol의 첨가농도가 돼지정자의 동결 융해후 생존율, 정상 첨체율을 검토하여 현장에서 동결 정액을 액상정액처럼 활용하고, 브랜드육 생산을 위해 필요한 정액의 동결보존을 위한 동결 정액의 제조를 위한 표준 동결 용액, glycerol 농도 및 냉각속도를 결정하기 위해 실시하였다.
- 본 실험은 돼지 정액의 동결보존을 위한 희석액과 냉각속도 및 동해방지제의 적정 농도를 결정하기 위해 실시하였으며, 얻어진 결과는 다음과 같다.
제안 방법
- LEY 희석액을 이용하여 glycerol의 첨가농도에 따른 생존율과 첨체 변화를 검토하기 위해서, LEY 희석액에 4, 6, 8%의 glycerol를 첨가하고 25℃에서 5℃까지의 냉각속도를 90분간으로 하여 실험 1과 동일한 방법으로 정액을 동결하였다.
- 각각 1차 희석액으로 희석이 완료된 정액을 동결기에 넣고 25℃에서 5℃까지 냉각을 개시하고, 5℃까지의 냉각시간을 20, 45, 90, 120, 180분으로 하였으며, 이 사이에 온도가 18, 13, 10, 8℃로 냉각되었을 때, 동일 온도의 2차 희석액으로 1차 희석된 정액 비율의 10, 20, 30 40%씩을 나누어서 첨가하여 1차, 2차 희석액의 비율이 동량이 되도록 하여 정자의 최종 농도가 12×108/ml이 되도록 하고, 5 ml의 macrotube straw(Minitube, Germany)에 분주한 다음, plastic과 steel ball로 straw의 양쪽을 봉인하고 스티로폼 상자에 준비한 액체질소 상면 5cm에서 20분간 방치하여 예비동결을 하였다. 이어서 액체질소 중에 침지시켜 동결을 완료하였고 융해 후의 생존율, 정상 첨체율을 검사하기 위해 1주일 이상 액체질소통에 보존하였다.
- 첨체검사는 Maxwell과 Johnson(1997)의 방법에 준하여, 융해하여 희석한 정액 30㎕를 무형광 slide glass에 올리고 cover glass를 이용하여 도말하고 상온에서 건조시킨 후, 0℃의 methyl alcohol에 침지시켜 2분간 고정하고, 다시 상온에 건조하였다. 건조시킨 slide glass에 150 M 의 FITC-PSA(Sigma, L-0770)와 2.4mM의 PI 75㎕를 떨어뜨리고 그 위에 투명필름을 덮어 slide glass 전체에 염색액이 퍼지도록 하고 암실에서 20분간 염색을 하였다. 염색이 종료된 후, 투명 필름을 제거하고 slide glass 를 증류수에 10분간 침지시켜 탈염색하고 풍건시킨 다음, 다시 antifading solution을 50㎕ 떨어뜨리 고 slide glass와 같은 크기의 cover glass를 덮어 압착시킨 다음, 형광현미경 하에서 1,000배로 200개의 정자를 관찰하여, 노란색으로 염색된 첨체가 적색으로 염색된 두부에 밀착한 정자만을 정상적인 첨체로 하고, 나머지는 손상된 첨체로 판단하였다.
- 각각의 희석액으로 동결한 정액을 47℃의 온수에서 10초가 녹인 다음, 35℃로 가온하여 준비한 95ml의 NTS-1 융해액으로 희석하였다. 생존율 검사는 Maxwell과 Johnson] 1997)의 방법에 준하여, 융해액으로 희석한 정액 500㎕를 채취하여 1.5ml의 tube에 담고 여기에 SYBR-14(Molecular Probe, USA, L-7011) 5㎕(0.1mM)와 Propidium lodide(PI) 3㎕(2.4mM)를 각각 첨가하고 암실의 상온에서 20분간 방치하여 염색을 실시한 다음, 암실에서 염색된 정자를 10㎕ 채취하여 무형광 slide glass에 올리고 cover glass를 덮고 형광현미경 하에서 400배로 200개의 정자를 관찰하여 녹색과 적색으로 염색된 정자를 계산하고 녹색으로 염색된 정자는 생존한 것으로, 적색으로 염색된 것은 사멸정자로 하여 생존율을 계산하였다.
- 4mM의 PI 75㎕를 떨어뜨리고 그 위에 투명필름을 덮어 slide glass 전체에 염색액이 퍼지도록 하고 암실에서 20분간 염색을 하였다. 염색이 종료된 후, 투명 필름을 제거하고 slide glass 를 증류수에 10분간 침지시켜 탈염색하고 풍건시킨 다음, 다시 antifading solution을 50㎕ 떨어뜨리 고 slide glass와 같은 크기의 cover glass를 덮어 압착시킨 다음, 형광현미경 하에서 1,000배로 200개의 정자를 관찰하여, 노란색으로 염색된 첨체가 적색으로 염색된 두부에 밀착한 정자만을 정상적인 첨체로 하고, 나머지는 손상된 첨체로 판단하였다.
- /ml이 되도록 하고, 5 ml의 macrotube straw(Minitube, Germany)에 분주한 다음, plastic과 steel ball로 straw의 양쪽을 봉인하고 스티로폼 상자에 준비한 액체질소 상면 5cm에서 20분간 방치하여 예비동결을 하였다. 이어서 액체질소 중에 침지시켜 동결을 완료하였고 융해 후의 생존율, 정상 첨체율을 검사하기 위해 1주일 이상 액체질소통에 보존하였다.
- 천안 연암대학 유전자원센터에서 액상 정액 공급을 목적으로 사육하고 있는 종모 돈을 이용하여 수압법으로 농후정액을 분리 채취하여 30℃로 유지시켰다. 채취한 정액을 전처리용액(증류수리터당 glucose 60g, sodium citrate 3.75g, NaHCOs1.2g, EDTA-2Na 3.7g, streptomycin 1.0g, penicillinG 100만 단위를 첨가한 것)으로 동량 희석하여 25℃로 조절한 원심분리기에서 3,000rpm, 5분간 원심분리하여 상층액을 제거하고 Table 1의 1차 희석액으로 최종 희석액(2차 희석액 포함)의 1/2량이 첨가되도록 희석하고 25℃로 설정한 program 동결기(FHK, ETIN, Japan)에 넣어 냉각준비를 하였다.
- 천안 연암대학 유전자원센터에서 액상 정액 공급을 목적으로 사육하고 있는 종모 돈을 이용하여 수압법으로 농후정액을 분리 채취하여 30℃로 유지시켰다. 채취한 정액을 전처리용액(증류수리터당 glucose 60g, sodium citrate 3.
데이터처리
- 통계처리는 결과를 종합하여 분산 분석(ANOVA)과 Fisher의 protected least significant difference (PLSD) test로 실시하였다.
이론/모형
- 첨체검사는 Maxwell과 Johnson(1997)의 방법에 준하여, 융해하여 희석한 정액 30㎕를 무형광 slide glass에 올리고 cover glass를 이용하여 도말하고 상온에서 건조시킨 후, 0℃의 methyl alcohol에 침지시켜 2분간 고정하고, 다시 상온에 건조하였다. 건조시킨 slide glass에 150 M 의 FITC-PSA(Sigma, L-0770)와 2.
성능/효과
- 1. 25 ℃에서 5 ℃까지의 냉각 속도에서는 LEY 희석액에서 분당 0.17~0.22℃로 냉각하는 것이 생존율과 정상 첨체율에서 가장 높은 결과를 얻었다.
- 2. LEY 희석액이 BF5와 M-Soejima 희석액보다 정자를 동해로부터 보호하는 능력이 우수하 였다.
- 25℃에 5℃까지의 냉각 속도를 20분으로 하였을 때, 다른 냉각 속도에 비하여 생존율이 유위하게 낮았으며, 희석액 중, M·Soejima의 경우는 생존율이 10%에 지나지 않아서 유위하게 낮았다 (p<0.01).반면에 냉각 속도를 120분으로 서서히 냉각한 경우는 생존율이 증가되었으나 180분으로 분당 0.
- 3. LEY 희석액에 첨가하는 glycerol의 농도는 3또는 4%가 2%의 glycerol을 첨가한 것보다
- 4. LEY 희석액에 15mM의 fructose와 3% 또는 4%의 glycerol 첨가구가 가장 높은 생존율과 정상 첨체율을 나나냈다 3<0.001).
- LEY희석액을 이용하여 glycerol의 농도 또는 glycerol 농도와 당(fructose)의 농도와의 관계를 검토한 결과는 Table 3과 4이다. Glycerol의 농도에 있어서는 3%의 첨가구가 가장 높은 생존율을 보였고(62.1±1.5%, p<0.001), 정상 첨체율은 4%의 glycerol를 첨가한 구에서 75.0±2.4%로 가장 높았다(p<0.001). 반면에 2%의 glycerol 첨가구는 다른 첨가구에 비하여 생존율과 정상 첨체율에서 가장 낮게 나타났다.
- 9%로 가장 높게 나타났다. 따라서 생존율과 정상 첨체율을 고려해 볼 때, 90분에서 120분간으로 5℃까지 냉각하는 것(0.1~0.22℃/분)이 가장 좋은 결과를 나타냈다.
- 5mM구에서 가장 높았다. 따라서 정자의 생존율을 향상시키기 위해서는 3또는 4%의 glycerol 첨가와 함께 15.0 mM의 fluctose의 첨가(66.1±2.6%, 65.3±5.0%)가 좋으며, 융해 후의 정상 첨체율을 위해서는 glycerol를 4%에 62.5mM의 fructose 첨가(84.6±1.2%)가 가장 좋은 것으로 판단되었다. 이러한 결과는 Salamon 등(1973a)이, 돼지 정액의 동결에 이용될 수 있는 당류로는 glucose, fructose 및 lactose가 있으며, 이러한 당류는 삼투압 조절 효과에 의해 정자 외부를 보호하고 glycerol과 상호작용에 의해 정자를 동해로부터 보호한다고 하는 보고를 재확인하는 결과라고 생각되며, 앞으로 그 외의 당류와 glycerol의 조합을 검토하여 돼지정자의 동결 융해 시 생존율과 정상 첨체율을 향상시킬 수 있는 당의 종류와 농도 및 이에 따른 glycerol의 농도를 결정할 필요가 있다고 판단되며 또한 이렇게 동결한 정자의 수정 능력을 검토해야 할 것이다.
- Glycerol 3또는 4% 첨가구에서는 fructose 농도 간에 생존율이 다소 차이를 보여 15mM구가 가장 높고, 그 외의 농도에서는 비슷하였다. 정상 첨체율에 있어서는 3% glycerol구는 31.0mM구가, 4% glycerol 구는 62.5mM구에서 가장 높았다. 따라서 정자의 생존율을 향상시키기 위해서는 3또는 4%의 glycerol 첨가와 함께 15.
- 17℃로 냉각을 하면 오히려 생존율에 있어서 저하가 인정되었다. 정상 첨체율에 있어서는 생존율과 비슷한 경향을 나타냈지만 그 차이는 생존율에 비하여 낮았으며, LEY 희석액으로 분당 0.17℃를 냉각한 구에서 정상 첨체율이 51.7±1.9%로 가장 높게 나타났다. 따라서 생존율과 정상 첨체율을 고려해 볼 때, 90분에서 120분간으로 5℃까지 냉각하는 것(0.
- Foote(1988)는 돼지 정자를 급속하게 냉각하면 정자의 생존율 저하, 정자세포막내지질의 유실, 세포막투과성의 증진, 대사활동성의 감소 등을 초래하여 융해후의 첨체 및 정자세포 내의 미세구조가 손상을 받아 수정능력이 저하된다고 하였으며, Courtens 등(1988)은 급속하게 냉각을 하면 정자세포 내의 전해질 농도를 변화시켜 생존율을 저하시킨다고 하고 있고, 또한 본 실험의 결과에서도 분당 1℃로 냉각한 경우가 그 외의 냉각속도로 냉각한 경우보다 월등하게 생존율이 저하되는 것을 보면, 정자 내부로의 동해 방지제인 glycerol이 세포 내로의 평형이 이루어질 수 있는 시간이 필요한 것으로 판단된다. 지금까지 보고된 정액 동결 시험에서 얻어진 결과를 종합해보면, 일반적으로 정액의 동결 방법은 급속냉각(rapid cooling)과 완만냉각(slow cooling)으로 구분할 수 있으며, 가장 이상적인 냉각속도는 극단적으로 정자 내의 용질농도의 증가를 최소로 억제시키면서 동결 시정자 내부의 유리화(crystalliza tion) 형성을 방지하여 탈수 현상을 적당하게 이루어지도록 하는 것이 바람직한 것으로 되어 있어, 본 실험에서도 정자 내부로의 동해 방지제 평형이 이루어지기 위해 필요한 시간이 반드시 요구되며 이것을 만족하지 못하면 융해 후의 생존율 저하를 초래하는 것을 알 수 있다. 반대로 너무 늦은 냉각은 오히려 생존율에 불리한 것으로 나타나, Farrant (1980)이, 완만한 냉각은 정자 내부의 탈수현상이 가속화되어 정자 내부의 용질의 높아져 정자 세포막에 나쁜 영향을 주게 된다고 하는 결과로 설명할 수 있다.
후속연구
- 2%)가 가장 좋은 것으로 판단되었다. 이러한 결과는 Salamon 등(1973a)이, 돼지 정액의 동결에 이용될 수 있는 당류로는 glucose, fructose 및 lactose가 있으며, 이러한 당류는 삼투압 조절 효과에 의해 정자 외부를 보호하고 glycerol과 상호작용에 의해 정자를 동해로부터 보호한다고 하는 보고를 재확인하는 결과라고 생각되며, 앞으로 그 외의 당류와 glycerol의 조합을 검토하여 돼지정자의 동결 융해 시 생존율과 정상 첨체율을 향상시킬 수 있는 당의 종류와 농도 및 이에 따른 glycerol의 농도를 결정할 필요가 있다고 판단되며 또한 이렇게 동결한 정자의 수정 능력을 검토해야 할 것이다.
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