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문제 정의
- 본 연구는 설치류인 ICR 마우스의 골수 세포에 있어서 소핵 유발성 여부를 지표로 하여 산삼배양추출물의 소핵생성 여부를 조사하고자 식품의약품안전청 고시 제 2000-63호 "비임상시험관리기준"과 제 1999-61호 "의약품등의 독성시험기준"에 따라 수행하였다.
가설 설정
- 05 경우에 통계학적으로 유의한 것으로 판정하였다. 소핵 유발 빈도와 PCE/(PCE+NCE)는 비율데이터(X)로써 일반적으로 arcsin[sqrt(x)] 변환을 통해 정규성을 가정한다. 소핵 유발 빈도는 정규성 검정을 실시한 결과 만족되지 않아, 비모수 방법인 Kruskal-Wallis test를 실시하고 다중비교 검정하였다.
제안 방법
- 각 투여군의 동물로부터 제작한 검체 중 염색 상태가 양호한 1매를 선택하여 무작위로 코드화한 후 검경하였다. 시험 결과는 개체 당 2,000개의 PCE 중에 나타나는 MNPCE 를 계수하여 mean士 S.
- 야생 산삼으로부터 유도한 산삼 배양근을 영양배지에서 4주간 배양한 후 배양근을 수거하여 물로 3회 수세하고 45℃ 건조기에서 12시간 건조하였다. 건조된 산삼 배양근 1 kg에 대하여 1차 증류수 150 L(l:10)를 첨가하고 85℃의 수조에서 4시간 동안 추출하고 회전진공농축기를 사용하여 brix 60 이상으로 농축하여 산삼배양 추출물을 조제하였으며, 냉장 보관하면서 실험에 사용하였다.
- 로 표시하였으며 이를 소핵 유발 빈도로 하였다. 계수시 서)포 직경의 1/5-1/20의 크기로 주 변 유핵세포의 핵과 동이한 염색상을 나타내는 원형-타원형 소체를 소핵으로 계수하였으며, 소핵과 이물질의 구별에 주의하였다. 소핵 계수 후에 소핵 유무에 상관없이 합계 500개의 PCE와 normochromatic erythrocyte(NCE)를 계수하여 PCE/(PCE+NCE)의 비율을 산출, 세포독성의 지표로 삼았다.
- 상징액을 제거한 후 침전된 골수 세포를 슬라이드글라스에 도말, 실온에서 충분히 건조한 후 메틸알콜에 5분간 침지하여 세포를 고정하였다. 고정 및 건조가 끝난 검체는 May- Grunwald 염색액 원액 3분, May-Grunwald 염색액 1:1 희석액(증류수) 2분, Giemsa 염색액(5% in PBS, pH 6.8)의 순서로 염색하여 1,000배의 배율로 검경하였다.7)
- 계수시 서)포 직경의 1/5-1/20의 크기로 주 변 유핵세포의 핵과 동이한 염색상을 나타내는 원형-타원형 소체를 소핵으로 계수하였으며, 소핵과 이물질의 구별에 주의하였다. 소핵 계수 후에 소핵 유무에 상관없이 합계 500개의 PCE와 normochromatic erythrocyte(NCE)를 계수하여 PCE/(PCE+NCE)의 비율을 산출, 세포독성의 지표로 삼았다.
- 시험 물질 산삼배 양추출물의 유전독성을 평가하고자 마우스 골수세포를 이용한 소핵시험을 실시하였다. 약 7주령의 마우스에 시험물질을 1일 1회 2일간 복강 내 투여하고, 최종 투여로부터 약 24시간 후에 골수세포를 수거하여 소핵 유발과 세포독성을 평가하였다.
- 시험물질 요구량을 산출한 후 칭량하여 주사용 멸균 생리식염수로 최고용량군의 농도가 되도록 용해하여 조제하였다. 조제는 투여 당일 실시하며 여과 과정은 시험물질의 용해성에 따라 생략하며 시험물질의 균질성을 기하기 위하여 현탁물을 초음파 세척조에서 10-20분간 처리하였다.
- 시험물질을 투여한 동물에 대하여 투여 당일 및 부검시 각 1회 관찰을 실시해 사망 동물 및 이상 징후의 발생 여부를 관찰하였다.
- 입수일을 포함한 7일간의 검역 및 순화 기간을 두어 일반 증상을 관찰한 후, 건강한 동물만을 시험에 사용하였다. 실험군 분리 시에는 체중에 따른 무작위법을 실시하였으며, 식이는 자유 식이를 행하였다. 사육장 내의 온도는 23±3℃를 유지하였으며, 상대습도 55±15%, 환기 횟수 10~20회/hr, 조명시간 12시간, 조도 150-300 Lux로 관리하였다.
- 약 7주령의 마우스에 시험물질 0, 500, 1,000 및 2,000㎎/㎏의 용량을 1일 1회 2일간 복강 내 투여하고, cyclophosphamide monohydrate(CPA)는 시험물질 2회차 투여일에만 1회 투여하였다.
- 시험 물질 산삼배 양추출물의 유전독성을 평가하고자 마우스 골수세포를 이용한 소핵시험을 실시하였다. 약 7주령의 마우스에 시험물질을 1일 1회 2일간 복강 내 투여하고, 최종 투여로부터 약 24시간 후에 골수세포를 수거하여 소핵 유발과 세포독성을 평가하였다.
- 시험물질 요구량을 산출한 후 칭량하여 주사용 멸균 생리식염수로 최고용량군의 농도가 되도록 용해하여 조제하였다. 조제는 투여 당일 실시하며 여과 과정은 시험물질의 용해성에 따라 생략하며 시험물질의 균질성을 기하기 위하여 현탁물을 초음파 세척조에서 10-20분간 처리하였다. 조제된 최고용량 시험물질 용액을 주사용 멸균 식염수로 부형제로 투여량에 따라 단계별 희석 조제한 것을 사용하였다(Table 1).
- 최종 투여로부터 약 24시간 후에 골수 세포를 수거하여 소핵 유발과 세포독성을 평가하였다. 각 동물체로부터 적출한 대퇴골로부터 23게이지 주사침을 사용, 3 ml의 FBS(우 태아 혈청, GIBCOBRL #26140-079)으로 골수를 씻어내려 현탁시킨 다음 100 rpm으로 5분간 원심분리하였다.
대상 데이터
- 마우스는 소핵 시험에 널리 사용되며 시험 기초자료가 풍부하므로 본 실험에서는 ICR 계통 특정병원균 부재(SPF)마우스를 선택하였다. 공급원은 대한 바이오링크로 입수 시 동물은 약 6주령의 마우스로 입수 시 체중 범위는 28.
- 야생 산삼으로부터 유도한 산삼 배양근을 영양배지에서 4주간 배양한 후 배양근을 수거하여 물로 3회 수세하고 45℃ 건조기에서 12시간 건조하였다. 건조된 산삼 배양근 1 kg에 대하여 1차 증류수 150 L(l:10)를 첨가하고 85℃의 수조에서 4시간 동안 추출하고 회전진공농축기를 사용하여 brix 60 이상으로 농축하여 산삼배양 추출물을 조제하였으며, 냉장 보관하면서 실험에 사용하였다.
- 17g 이었다. 입수일을 포함한 7일간의 검역 및 순화 기간을 두어 일반 증상을 관찰한 후, 건강한 동물만을 시험에 사용하였다. 실험군 분리 시에는 체중에 따른 무작위법을 실시하였으며, 식이는 자유 식이를 행하였다.
- 조제는 투여 당일 실시하며 여과 과정은 시험물질의 용해성에 따라 생략하며 시험물질의 균질성을 기하기 위하여 현탁물을 초음파 세척조에서 10-20분간 처리하였다. 조제된 최고용량 시험물질 용액을 주사용 멸균 식염수로 부형제로 투여량에 따라 단계별 희석 조제한 것을 사용하였다(Table 1).
데이터처리
- PCE/(PCE+NCE)는 정규성 검사 결과 만족되어, 일원배치 분산분석을 실시하였으며, 다중비교 검정을 실시하였다. 모든 동물에서 PCE/(PCE+NCE) 비율이 0.
- SAS 통계법8~10)을 이용하여 다음의 방법으로 통계처리를 실시하고, 그 결과 P<0.05 경우에 통계학적으로 유의한 것으로 판정하였다. 소핵 유발 빈도와 PCE/(PCE+NCE)는 비율데이터(X)로써 일반적으로 arcsin[sqrt(x)] 변환을 통해 정규성을 가정한다.
- PCE/(PCE+NCE)는 정규성 검사 결과 만족되어, 일원배치 분산분석을 실시하였으며, 다중비교 검정을 실시하였다. 모든 동물에서 PCE/(PCE+NCE) 비율이 0.1 이상일 때 시험이 타당한 것으로 하고11,12) MNPCE의 빈도가 통계학적으로 유의하며 용량 의존적으로 증가하거나 하나 이상의 용량에서 재현성 있는 양성 반응을 나타날 때 양성으로 판정하였으며, 실험동물의 체중에 대해서는 ANOVA's test를 실시하고 다중비교 검정하여 유의성을 검정하였다.
- 소핵 유발 빈도와 PCE/(PCE+NCE)는 비율데이터(X)로써 일반적으로 arcsin[sqrt(x)] 변환을 통해 정규성을 가정한다. 소핵 유발 빈도는 정규성 검정을 실시한 결과 만족되지 않아, 비모수 방법인 Kruskal-Wallis test를 실시하고 다중비교 검정하였다.
- 각 투여군의 동물로부터 제작한 검체 중 염색 상태가 양호한 1매를 선택하여 무작위로 코드화한 후 검경하였다. 시험 결과는 개체 당 2,000개의 PCE 중에 나타나는 MNPCE 를 계수하여 mean士 S.D.로 표시하였으며 이를 소핵 유발 빈도로 하였다. 계수시 서)포 직경의 1/5-1/20의 크기로 주 변 유핵세포의 핵과 동이한 염색상을 나타내는 원형-타원형 소체를 소핵으로 계수하였으며, 소핵과 이물질의 구별에 주의하였다.
성능/효과
- 소핵 생성 원리는 마우스 골수 내에서 erythroblast가 최종 분열한 후 탈핵 과정을 거쳐 미성숙 적혈구인 다염성적혈구(PCE, polychromatic erythrocyte)가 되고 이 PCE는 약 10시간 후 성숙적혈구가 되어 혈관으로 가게 되는데 핵이 있는 erythrocyte 상태에서 돌연변이 물질의 영향을 받으면 염색체가 깨어져 더 이상 분화하지 못하고 파편으로 남아 PCE 내에 있게 된다.6)이를 소핵이라 하며 소핵이 많이 관찰될수록 돌연변이 물질의 영향을 많이 받은 것이라 할 수 있다.
- 본 시험에서 적용한 용량범위 내에서 개체 당 2,000개의 PCE를 대상으로 소핵을 계수한 결과, 개체 당 2,000개의 PCE에서 관찰된 소핵을 가진 PCE의 빈도는 1회 투여량 기준으로 음성 대조군, 500 ㎎/㎏ 투여군(G1), 1,000 ㎎/㎏ 투여군(G2), 2,000 ㎎/㎏ 투여군(G3) 및 양성대조군의 순으로 평균 5.17, 5.50, 5.83 및 65.17 이었다(Table 5). 따라서, 시험물질을 투여한 어느 투여군에서도 음성 대조군에 비해 통계학적으로 유의한 증가를 나타내지 않았다.
- 본 시험에서는 소핵시험에 앞서 각각 24마리의 ICR 마우스 수컷과 암컷에게 시험물질인 산삼배양근 추출물을 복강 내 투여한 후 체중 변화를 관찰한 결과, 성별에 따른 독성 발현의 차이는 없는 것으로 나타났다(Table 2, 3).
- 시험물질 및 양성대조물질을 투여한 후 최종 시간까지 모든 시험군에서 투여로 인한 것으로 판단되는 특이한 임상증상은 관찰되지 않았다. 시험물질 투여 및 골수세포의 수거 직전에 측정한 각 군의 체중을 비교한 결과(Table 4), 최고 용량군에서만 통계학적으로 유의한 감소를 나타내었다(P<0.
- 시험물질 및 양성대조물질을 투여한 후 최종 시간까지 모든 시험군에서 투여로 인한 것으로 판단되는 특이한 임상증상은 관찰되지 않았다. 시험물질 투여 및 골수세포의 수거 직전에 측정한 각 군의 체중을 비교한 결과(Table 4), 최고 용량군에서만 통계학적으로 유의한 감소를 나타내었다(P<0.05).
- 38을 나타내었다(Table 5). 이렇듯 시험물질을 투여한 모든 군이 평균 0.25 이상이었고, 시험물질 투여에 의해 세포 독성 수치가 감소하는 경향이 나타났으나 모든 실험군에서 통계학적으로 유의한 차이는 나타나지 않았다.
- 이상의 결과로 볼 때 산삼배양근 추출물은 본 시험조건 하에서 마우스골수 세포에 소핵을 유발하지 않는 것으로 사료된다.
- 따라서, 시험물질을 투여한 어느 투여군에서도 음성 대조군에 비해 통계학적으로 유의한 증가를 나타내지 않았다. 한편 양성 대조군에서는 소핵 빈도에서 음성 대조군에 비해 통계학적으로 유의하며 현저한 증가가 나타났다(P<0.01).
후속연구
- 그러나 현재까지 생물반응기에서 배양된 산삼배양근의 식품 원료로서의 안전성 여부가 확인되지 않아 이를 활용한 제품 개발에 관한 연구는 미흡한 실정이다. 따라서 본 연구에서는 사람의 건강에 중요한 의미를 가질 수 있는 포유 동물계에서의 in vivo연구를 통하여 산삼배양추출물의 안전성 여부를 확인하고 나아가 건강기능식품 및 제약 원료의 안정 공급에 기여할 것이다.
- 또한 원료배양세 포주인 산삼의 특정 성분을 고스란히 담는다는 데에 그 이점이 있다. 이러한 이점을 활용하여 대량 생산 및 산삼의 특정 ginsenoside# 일시에 얻어 의약품, 건강기능식품 등에의 활용이 기대된다.
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