Human periodontal ligament fibroblast(hPDLF) is very important to cure periodontal tissue because it can be diverged into various cells. This study examined the expression of MMP-1, TIMP-1, periodontal ligament specific PDLs22, Type I collagen, Fibronectin, TIMP-2, telomerase mRNA in a replicative s...
Human periodontal ligament fibroblast(hPDLF) is very important to cure periodontal tissue because it can be diverged into various cells. This study examined the expression of MMP-1, TIMP-1, periodontal ligament specific PDLs22, Type I collagen, Fibronectin, TIMP-2, telomerase mRNA in a replicative senescence of hPDLF. The periodontal ligament tissue was obtained from periodontally healthy and non-carious human teeth extracted for orthodontic reasons at the Chosun University Hospital of Dentistry with the donors' informed consent. The hPDLF cells were cultured in a medium containing Dulbecco's modified Eagle medium(DMEM, Gibco BRL, USA) supplemented with 10% fetal bovine serum(FBS, Gibco BRL, USA) at 37C in humidified air with 5% $CO_2$. For the reverse transcription-polymerase chain reaction(RT-PCR) analysis, the total RNA of the 2, 4, 8, 16, 18, and 21 passage cells was extracted using a Trizol Reagent(Invitrogen, USA) in replicative hPDL cells. Two passage cells, i.e. young cells, served as the control, and ${\beta}-actin$ served as the internal control for RT-PCR The results of this study about cell morphology and gene expression according to aging of hPDLF using RT-PCR method are as follows: 1. The size of hPDLF was increased with aging and it was showed that the hPDLF was dying in the final passage. 2. PDLs22 mRNA was expressed in young hPDLF of the two, four, and six passage. 3. TIMP-1 mRNA was expressed in young hPDLF of the two and four passage. 4. There was a tendency that MMP-1 mRNA was weakly expressed over eighteen. 5. Type 1 collagen mRNA was expressed in almost all passages, but it was not expressed in the final passage. 6. Fibronectin mRNA was observed in all passages and it was weakly expressed in the final passage. 7. TIMP-2 and telomerase mRNA were not expressed in this study. Based on above results, it was observed that PDLs22, Type 1 collagen, Fibronectin, MMP-1. and TIMP-1 mRNA in hPDLF were expressed differently with aging. The study using the hPDLF that is collected from healthy patients and periodontitis patients needs in further study.
Human periodontal ligament fibroblast(hPDLF) is very important to cure periodontal tissue because it can be diverged into various cells. This study examined the expression of MMP-1, TIMP-1, periodontal ligament specific PDLs22, Type I collagen, Fibronectin, TIMP-2, telomerase mRNA in a replicative senescence of hPDLF. The periodontal ligament tissue was obtained from periodontally healthy and non-carious human teeth extracted for orthodontic reasons at the Chosun University Hospital of Dentistry with the donors' informed consent. The hPDLF cells were cultured in a medium containing Dulbecco's modified Eagle medium(DMEM, Gibco BRL, USA) supplemented with 10% fetal bovine serum(FBS, Gibco BRL, USA) at 37C in humidified air with 5% $CO_2$. For the reverse transcription-polymerase chain reaction(RT-PCR) analysis, the total RNA of the 2, 4, 8, 16, 18, and 21 passage cells was extracted using a Trizol Reagent(Invitrogen, USA) in replicative hPDL cells. Two passage cells, i.e. young cells, served as the control, and ${\beta}-actin$ served as the internal control for RT-PCR The results of this study about cell morphology and gene expression according to aging of hPDLF using RT-PCR method are as follows: 1. The size of hPDLF was increased with aging and it was showed that the hPDLF was dying in the final passage. 2. PDLs22 mRNA was expressed in young hPDLF of the two, four, and six passage. 3. TIMP-1 mRNA was expressed in young hPDLF of the two and four passage. 4. There was a tendency that MMP-1 mRNA was weakly expressed over eighteen. 5. Type 1 collagen mRNA was expressed in almost all passages, but it was not expressed in the final passage. 6. Fibronectin mRNA was observed in all passages and it was weakly expressed in the final passage. 7. TIMP-2 and telomerase mRNA were not expressed in this study. Based on above results, it was observed that PDLs22, Type 1 collagen, Fibronectin, MMP-1. and TIMP-1 mRNA in hPDLF were expressed differently with aging. The study using the hPDLF that is collected from healthy patients and periodontitis patients needs in further study.
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문제 정의
이에 본 연구에서는 다른 섬유모세포들에서 노화될 경우 발현의 변화양상을 보였던 유전자들을 대상으로 치주인대섬유모세포의 노화과정에 따른 변화를 비교하였다. 본 연구에서는 MMP-1 mlWA는 복제 노화의 마지막 단계에서만 아주 미세하게 발현되는 경향을 나타내었고, TIMP-1 mRNA는 2세대와 4세대의 젊은 세대에서만 발현되었다.
이에 본 연구의 목적은 치주조직 치유에 필수적인 사람 치주인대섬유모세포의 노화과정에 따른 세포 의형태학적 변화를 관찰하고, 노화와 관련된다고 보고된 여러 유전자들의 발현 양상을 비교하고자 한다.
제안 방법
60 mm 배양접시에서 배양된 치주 인대 섬유 모세포가 80-90%의 밀생이 될 때까지 5% CO2> 37℃, 100% 습도의 배양기에서 2일 간격으로 10% FBS 가 함유된 DMEM 세포 배양액을 교체하면서 세포를 배양하였다. 80-90%의 밀생이 되었을 때 Trizol Reagent(Invitrogen, USA)를 이용하여 제조회사의 지시에 따라 total RNA를 추출하였다.
배양하였다. 80-90%의 밀생이 되었을 때 Trizol Reagent(Invitrogen, USA)를 이용하여 제조회사의 지시에 따라 total RNA를 추출하였다. 배양된 치주인대 섬유모세포의 total RNA 1 座당 25U의 oligo-d(T) primer와 premix(Bioneer, Korea) 를 이용하여 first-strand cDNA를 합성하였다.
MMP-1, TIMP-1, PDLs22, Type I collagen, Fibronectin, mTR, GAPDH 및 0-actin의 유전자의 염기 서열에 대한 sense와 anti-sense oligonucleotide primer는 주문 제작하였다(Table 1). Reverse transcription(RT) 과정을 통하여 합성한 cDNA를 templates.
A)이 사용되었다. PCR 산물을 1.5% agarose gel에 전기영동하여 유전자 발현을 확인하였다.
Reverse transcription(RT) 과정을 통하여 합성한 cDNA를 templates. 각각의 20 pmols의 primer, 1 “g의 cDNA, AccuPower Premix (Bioneer, Korea)와 멸균 증류수로 20 以의 PCR 혼합용액을 만들었다.
80-90%의 밀생이 되었을 때 Trizol Reagent(Invitrogen, USA)를 이용하여 제조회사의 지시에 따라 total RNA를 추출하였다. 배양된 치주인대 섬유모세포의 total RNA 1 座당 25U의 oligo-d(T) primer와 premix(Bioneer, Korea) 를 이용하여 first-strand cDNA를 합성하였다.
일차배양 후 순차적으로 복제노화된 사람 치주 인대 섬유 모세포의 형태학적 변화를 위상차현미 경하에서 관찰하였다(Figure 1-3). hPDLF의 복제노하는 19세 환자에서는 21세대, 27세 환자에서는 18세대에서 정기되었다.
대상 데이터
19세 환자는 2, 4, 8, 16, 18, 21세대 세포를, 27세 환자는 2, 4, 8, 16, 18 세대 세포를 10% fetal bovine serum(FBS) 이 함유된 Dulbecco's Modified Eagles Medium(DMEM, Gibco BRL, USA)을 이용하여 5% CO2, 37℃, 100% 습도 조건에서 배양한 후 세포가 증식함에 따라 실험에 이용하였다.
유도하였다. 19세 환자는 21세대에서, 27세 환자는 18세대에서 세포의 사멸 소견이 관찰되어 마지막 세대로 설정하였다.
본 연구에서는 10대의 경우 2, 4, 8. 16, 세대에서, 20대의 경우 2, 4, 8세대에서 Type I collagen의 발현 양상이 감소하는 경향으로 발현되었고, 이 이후의 세대에서는 발현되지 않았다.
사람치주인대섬유모세포를 일차 배양한 후 순차적으로 복제노화(19세, 27세 환布를 유도하였다. 19세 환자는 21세대에서, 27세 환자는 18세대에서 세포의 사멸 소견이 관찰되어 마지막 세대로 설정하였다.
성능/효과
1. 사람치 주인대 섬유모세포는 노화가 진행될수록 크기가 커지고, 마지막 세대에서는 세포가" 죽어가는 소견을 나타내었다.
19세와 27세 환자 모두는 노화과정에 따라 Type I Collagen과 Fibronectin ml正NA가 약하게 발현되는 경향을 보이다가, Type I Collagene 마지막 세대에서는 관찰되지 않았으며, Fibronectin은 마지막 세대에서도 미약하게 발현되었다(Figure 4. 5).
3. TIMP-1 mRNA는 2세대, 4세대의 젊은 사람치주인대 섬유모세포에서 발현되었다.
4. MMP-1 mRNA는 18세대 이상에서 미세하게 발현되는 경향을 나타내었다.
5. Type I collagen mRNA는 거의 모든 세대에서 발현되었으나, 마지막 세대에서는 발현되지 않았다.
6. Fibronectin m]旧NA는 모든 세대에서 발현되었다 그러나 마지막 세대에서는 미세한 발현을 나타내었다.
16, 세대에서, 20대의 경우 2, 4, 8세대에서 Type I collagen의 발현 양상이 감소하는 경향으로 발현되었고, 이 이후의 세대에서는 발현되지 않았다. Fibronectin mRNA는 본 연구의 모든 세대에서 나타났으나, 마지막 세대에서는 아주 미세하게 발현되었다. 이러한 결과들은 본 연구에서 이용한 阡actin의 경우도 10대와 20대 모두 마지막 세대에서는 거의 미약한 발현 양상을 나타낸 것과 연관될 수 있겠으며, 세포가 죽고 기능 이상을 보임을 나타냄을 보여준다고 사료된다.
본 연구에서 PDLs22 m旧NA는 복제노화가 진행될수록 그 발현양상이 감소되었는데, 10대와 20대 모두 2세대에서 강한 발현을, 4세대에서 약한 발현을 나타내었고, 10대에서는 6세대에서도 아주 미세하게 발현되었으나 그 이후의 세대에서는 발현되지 않았다. 본 연구 결과 TIMP-2와 telomerase는 발현되지 않았다.
박 등(3)은 치은섬유■아세포의 복제노화(replicative senescence) 7} 세포주기 진행을 억제한다고 보고하였다. 본 연구에서 B-actin의 발현 양상이 마지막 세대에서 매우 약하게 나타났는데, 그 이유는 세포가 죽어감으로써 숫자가 감소하고 또한 세포의 기능 이상을 동반하기 때문인 것으로 미루어 생각할 수 있었다. 이상의 결과는 노화과정에 따른 세포주기의 억제와 그 이유를 같이할 수 있을 것으로 사료된다.
이상과 같이 조직의 분화와 개조에 관련된 것으로 알려진 PDLs22 및 염증과 관련된 것으로 알려진 TIMP-2, 종양세포에서 발현되는 telomerase까지 다양한 유전자의 발현양상을 함께 분석한 이유는 향후 유전자들의 상호 발현관계를 통해 세포의 노화의 정도를 파악하고 나아가 억제할 수 있는 어떠한 요소를 찾는데 도움이 되리라 사료되었기 때문이다. 본 연구에서 PDLs22 m旧NA는 복제노화가 진행될수록 그 발현양상이 감소되었는데, 10대와 20대 모두 2세대에서 강한 발현을, 4세대에서 약한 발현을 나타내었고, 10대에서는 6세대에서도 아주 미세하게 발현되었으나 그 이후의 세대에서는 발현되지 않았다. 본 연구 결과 TIMP-2와 telomerase는 발현되지 않았다.
본 연구에서는 사람치 주인대 섬유모세포의 노화과정에 따른 세포의 형태학적 변화와 유전자의 발현양상을 비교하였는데, 노화과정이 진행될수록 세포의 형태는 커지고 납작해졌다. 본 연구에서는 10대의 경우 21세대에서, 20대의 경우 18세대에서 3주가 되도록 기다려보아도 세포의 증식은 일어나지 않아 마지막 세대로 간주하였으며, 이때의 소견은 세포가 죽어감으로서 세포수가 크게 감소함을 나타내었다. 박 등(3)은 치은섬유■아세포의 복제노화(replicative senescence) 7} 세포주기 진행을 억제한다고 보고하였다.
본 연구에서는 MMP-1 mlWA는 복제 노화의 마지막 단계에서만 아주 미세하게 발현되는 경향을 나타내었고, TIMP-1 mRNA는 2세대와 4세대의 젊은 세대에서만 발현되었다. 이상의 결과는 다른 결체조직의 섬유모세포들에서의 결과와 유사하였다.
관한 연구는 부족한 실정이다. 본 연구에서는 사람치 주인대 섬유모세포의 노화과정에 따른 세포의 형태학적 변화와 유전자의 발현양상을 비교하였는데, 노화과정이 진행될수록 세포의 형태는 커지고 납작해졌다. 본 연구에서는 10대의 경우 21세대에서, 20대의 경우 18세대에서 3주가 되도록 기다려보아도 세포의 증식은 일어나지 않아 마지막 세대로 간주하였으며, 이때의 소견은 세포가 죽어감으로서 세포수가 크게 감소함을 나타내었다.
Fibronectin mRNA는 본 연구의 모든 세대에서 나타났으나, 마지막 세대에서는 아주 미세하게 발현되었다. 이러한 결과들은 본 연구에서 이용한 阡actin의 경우도 10대와 20대 모두 마지막 세대에서는 거의 미약한 발현 양상을 나타낸 것과 연관될 수 있겠으며, 세포가 죽고 기능 이상을 보임을 나타냄을 보여준다고 사료된다.
이상의 결과, 사람치 주인대섬유모세포는 노화가 진행되면서 MMP-1, TIMP-1, PDLs22, Type I collagen, Fibronectin mRNA를 다르게 발현시킴을 관찰할 수 있었다. 향후 건강한 사람뿐만 아니라 치주염 환자들에서 채취한 사람치주 인대 섬유 모세포를 이용한 연구가 필요하리라 사료된다.
후속연구
만약 치주인대섬유모세포의 노화를 억제하여 섬유조직의 형성보다는 세포증식능력의 향상을 통한 치주 인대 섬유 모세포의 치유 능력이 호전된다면 치주치료의 발전을 기대할 수 있을 것으로 사료된다. 이에 치주 인대 섬유 모세포의 노화여부를 평가할 수 있는 지침이 요구된다고 할 것이다.
본 연구를 토대로 치주인대섬유모세포의 노화 관련 유전자들의 발현에 대한 더 많은 연구가 필요하다고 생각되며, 향후 노화를 억제시켜서 반대로 세포의 치유 능력을 상승시킬 수 있다면 치주 치료의 발전을 기대할 수 있을 것으로 사료된다.
이상의 결과를 통해 PDLs22 mRNA는 치주 인대 섬유 모세포의 특이유전자로서 이미 알려져 있기 때문에 다른 결체조직과 비교하였을때 치주인대를 표시하는 표시자로서, 또한 세포의 증식능력, 즉 노화의 정도를 파악하는 표시자로서 활용할 수도 있음을 시사한다.
관찰할 수 있었다. 향후 건강한 사람뿐만 아니라 치주염 환자들에서 채취한 사람치주 인대 섬유 모세포를 이용한 연구가 필요하리라 사료된다.
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