B형 간염 바이러스(HBV)에 의한 감염은 인류의 보건에 대단히 중요한 문제이며, 따라서 HBV에 대한 많은 연구가 수행되어져 왔다. 그러나 HBV 연구에 있어서의 주된 장애요인은 그 감염이 사람과 일부 영장류에 국한된다는 점이다. 본 연구에서는 마우스 간암 세포주인 Hepa-1c1c7 세포를 이용하여 HBV의 감염성 및 그에 따른 염증성 사이토카인인 TNF-a의 발현의 변화를 측정하였다. HBV의 표면항원(HBsAg)분비는 microparticle enzyme immunoassay를 사용하여 측정하였고, TNF-a mRNA 발현 측정에는 quantitative competitive RT-PCR 방법을 사용하였다. HBV 발현 벡터를 Hepa-1clc7 세포에 도입시켰을 경우뿐만 아니라 HBV 비리온을 갖고 있는 혈청을 사용하여 Hepa-lc1c7 세포를 감염시켰을 때에도 HBV mRNA 발현 및 HBsAg 분비가 측정되었다. 또한 두 상황 모두에서 TNF-a mRNA발현이 증가됨을 알 수 있었다. 이러한 결과는 사람과 영장류에 특이적인 HBV가 마우스 간암 세포주인 Hepa-lclc7 세포도 감염시킬 수 있다는 가능성을 제시한다. 또한 마우스 기원의 Hepa-lclc7 세포에서도 HBV의 유전자 발현에 필요한 여러 인자들이 존재하며, TNF-a와 같은 사이토카인 유전자 발현을 조절하는 세포 내 기전에 HBV가 영향을 미친다고 할 수 있다. 따라서 마우스 간암 세포주인 Hepa-lclc7 세포는 HBV 연구를 위한 시험 관내 모델로서 사용되어질 수 있을 것으로 보인다.
B형 간염 바이러스(HBV)에 의한 감염은 인류의 보건에 대단히 중요한 문제이며, 따라서 HBV에 대한 많은 연구가 수행되어져 왔다. 그러나 HBV 연구에 있어서의 주된 장애요인은 그 감염이 사람과 일부 영장류에 국한된다는 점이다. 본 연구에서는 마우스 간암 세포주인 Hepa-1c1c7 세포를 이용하여 HBV의 감염성 및 그에 따른 염증성 사이토카인인 TNF-a의 발현의 변화를 측정하였다. HBV의 표면항원(HBsAg)분비는 microparticle enzyme immunoassay를 사용하여 측정하였고, TNF-a mRNA 발현 측정에는 quantitative competitive RT-PCR 방법을 사용하였다. HBV 발현 벡터를 Hepa-1clc7 세포에 도입시켰을 경우뿐만 아니라 HBV 비리온을 갖고 있는 혈청을 사용하여 Hepa-lc1c7 세포를 감염시켰을 때에도 HBV mRNA 발현 및 HBsAg 분비가 측정되었다. 또한 두 상황 모두에서 TNF-a mRNA발현이 증가됨을 알 수 있었다. 이러한 결과는 사람과 영장류에 특이적인 HBV가 마우스 간암 세포주인 Hepa-lclc7 세포도 감염시킬 수 있다는 가능성을 제시한다. 또한 마우스 기원의 Hepa-lclc7 세포에서도 HBV의 유전자 발현에 필요한 여러 인자들이 존재하며, TNF-a와 같은 사이토카인 유전자 발현을 조절하는 세포 내 기전에 HBV가 영향을 미친다고 할 수 있다. 따라서 마우스 간암 세포주인 Hepa-lclc7 세포는 HBV 연구를 위한 시험 관내 모델로서 사용되어질 수 있을 것으로 보인다.
Infection with hepatitis B virus (HBV) is a major health problem worldwide. Although a tremendous amount has been known about HBV, there have been obstacles in the study of HBV due to the narrow host range of HBV limited to humans and primates. In the present study, we investigated the susceptibilit...
Infection with hepatitis B virus (HBV) is a major health problem worldwide. Although a tremendous amount has been known about HBV, there have been obstacles in the study of HBV due to the narrow host range of HBV limited to humans and primates. In the present study, we investigated the susceptibility to HBV infection of mouse hepatoma cell line, Hepa-1c1c7. In addition, based on that human hepatocytes infected by HBV increase the expression of the pro-inflammatory cytokine TNF-a, the inducibility of TNF-a expression by HBV in the cells was determined. HBV surface antigen (HBsAg) secretion was measured by the microparticle enzyme immunoassay and steady state mRNA expression was analyzed by quantitative competitive RT-PCR. Transient transfection of Hepa-1c1c7 cells with HBV expression vector resulted in a dose-dependent induction of TNF-a expression. Infection of Hepa-1c1c7 cells with the serum of HBV carrier also increased TNF-a mRNA expression. Both in the transfected and infected cells, HBV mRNA was expressed and significant HBsAg secretion was detected. There was no significant variation in $\beta-actin$ mRNA expression by HBV. These results demonstrate that HBV is infectious to Hepa-lc1c7 in vitro and the viral infection induces TNF-a expression, which suggests that Hepa-lc1c7, a mouse hepatoma cell line, may be a possible model system for analysis of various molecular aspects of HBV infection.
Infection with hepatitis B virus (HBV) is a major health problem worldwide. Although a tremendous amount has been known about HBV, there have been obstacles in the study of HBV due to the narrow host range of HBV limited to humans and primates. In the present study, we investigated the susceptibility to HBV infection of mouse hepatoma cell line, Hepa-1c1c7. In addition, based on that human hepatocytes infected by HBV increase the expression of the pro-inflammatory cytokine TNF-a, the inducibility of TNF-a expression by HBV in the cells was determined. HBV surface antigen (HBsAg) secretion was measured by the microparticle enzyme immunoassay and steady state mRNA expression was analyzed by quantitative competitive RT-PCR. Transient transfection of Hepa-1c1c7 cells with HBV expression vector resulted in a dose-dependent induction of TNF-a expression. Infection of Hepa-1c1c7 cells with the serum of HBV carrier also increased TNF-a mRNA expression. Both in the transfected and infected cells, HBV mRNA was expressed and significant HBsAg secretion was detected. There was no significant variation in $\beta-actin$ mRNA expression by HBV. These results demonstrate that HBV is infectious to Hepa-lc1c7 in vitro and the viral infection induces TNF-a expression, which suggests that Hepa-lc1c7, a mouse hepatoma cell line, may be a possible model system for analysis of various molecular aspects of HBV infection.
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문제 정의
최근에는 HBV 유전자를 이용한 형질전환 마우스의 개발이나 HBV를 생산할 수 있는 인간 종양 세포주들의 이소성 이식술을 통한 면역결핍 마우스를 만드는 연구들이 수행되기도 하였다[5, 23]. 본 연구 또한 이러한 HBV 연구에 대한 모델 시스템으로서 마우스를 이용하려는 많은 시도의 일환으로서 수행되었다. Lipofectin 방법을 사용하여 세포내로 도입된 HBV에 의해 HBV mRNA 및 HBsAg 발현이 이루어진 것은 인간 HBV의 유전자 발현 기전이 마우스 세포인 Hepa-lclc7 세포에서도 정상적으로 이루어졌다는 사실을 의미하였다.
이러한 관점에서 우리는 HBV 연구에 대한 작은 실험동물 모델로서의 마우스에 대한 가능성 연구의 일환으로서 그에 준하는 시험관내 시스템에 대한 연구를 수행하였으며, 본 논문에서는 마우스 간암 세포주인 Hepa-lclc7 세포에서의 HBV 의 감염성을 알아보았다. 또한, 만성 B형 간염환자의 간세포 뿐만 아니라 일시적으로 또는 안정적으로 transfection 된 인간 간암 세포주인 HepG2 세포에서 염증성 사이토카인 tumor necrosis factor-a (TNF-a)가 발현된다는 사실에 근거하예 16], Hepa-lclc7세포에서의 HBV에 의한 TNF-a 유전자 발현의 유도에 대하여 알아보았다.
제안 방법
1.3-eq HBV genome을 세포 내 도입시킨 경우와 HBV 혈청으로 감염시킨 Hepa-lclc7 세포로부터 얻은 세포배양액에서 HBV의 표면항원인 HBsAg을 검출하기 위하여 Abbott IMx HBsAg assay system (Abbott Laboratories, IL, USA)을 이용하여 MEIA를 수행하였고, 신호 대 잡음비(S/N ratio)가 2.0 이상인 경우를 HBV 양성으로서 반응성이 있다고 평가하였다.
이 혼합물을 30~50% confluency의 농도로 60-mm 접시에서 배양된 Hepa-lclc7 세포에 가하여 18 시간 동안 37℃, 5% CO2 배양기에서 배양한 후, Hank's balanced salt solution (HBSS)로 5회 세척한 다음 10% 우태혈청을 함유한 Williams' E 배지 4 ml을 가하여 배양하였다. HBV 감염 실험은 HBV 비리온(virion)을 포함하고 있는 만성 B형 간염환자의 혈청을 이용하여 수행하였다. Hepa-lclc7 세포를 30-50% con- fluency의 농도로 60-mm 접시에서 배양한 후, 무혈청 배지와 주어진 농도의 환자 혈청을 섞어서 6시간 동안 37℃, 5% CO2 배양기에서 배양한 후, HBSS로 5회 세척한 다음 10% 우태혈청을 함유한 Williams, E 배지 4 ml을 가하여 배양하였다.
전체 RNA는 TRI Reagent를 사용하여 Chomczynski의 방법으로 분리하였다[7]. HBV, TNF-a, cytochrome P450 1A1 (CYP1A1), B-actin의 mRNA 발현은 reverse transcription- polymerase chain reaction (RT-PCR)을 이용하여 측정하였다. 각 유전자들에 대한 특이적인 primer로는 HBV에 대한 forward primer로 5'-CGATCCATACTGCGGAACTC-3', reverse primer로 5'-GGAGGCTTGAACAGTAGGAC-3'를 사용하였고, TNF-a에 대한 forward primer로 5'-ACTAGTGG- TGCCAGCCGATGGGTTG-3; reverse primer로 5'-GTGG- GGGCTGGGTAGAGAATGGATG3를 사용하였고, CYP1A1에 대한 forward primer로 5'-GCCAATGTCCAGCTGTCAGA- 3', reverse primerg.
HBV에 의한 TNF-a mRNA 발현을 정량적으로 분석하기 위하여 TNF-a PCR의 대상이 되는 부위에서 중간부분이 빠진 DNA internal standard를 이용하여 competitive/quantitative RT-PCR을 수행하였다. Fig.
Hepa-lclc7 세포는 재조합 HBV 발현 벡터인 1.3-eq HBV genome 5 mg을 세포 내 도입시킨 경우와 10%의 HBV 보균자의 혈청으로 감염시킨 경우, 그리고 아무것도 처리하지 않은 경우에 대하여 세포 및 세포배양액을 취하여 분석에 이용하였다. 세포로부터 RNA를 분리하여 HBV, TNF-a, CYP1A1, 그리고 b-actin 유전자에 대해 특이적인 primer들을 사용한 RT-PCR을 수행하여 각 유전자에 대한 mRNA의 발현 여부를 결정하였으며, 세포배양액은 Abbott IMx system을 이용하여 microparticle immunoassay를 수행하여 HBsAg의 발현 및 분비 양상을 측정하였다(Fig.
5'CTAT- CCTGACCCTGAAGTACCCCA-3', reverse primer로 5'-AGG ATGGCGTGAGGGAGAGCAT-3'를 사용하였다. TNF-a mRNA 를 정량하기 위하여 위의 TNF-a에 특이적인 primer 결합 부위들을 포함하는 재조합 DNA TNF-a internal standards (IS)를 만들어 quantitative/competitive RT-PCR을 수행하였다 [12, 30]. 전체 RNA는 oligo (dT)i5를 primer로 사용하여 cDNA 로 만든 후, PCR 완충액, 4 mM MgCl2, 2.
HBV, TNF-a, cytochrome P450 1A1 (CYP1A1), B-actin의 mRNA 발현은 reverse transcription- polymerase chain reaction (RT-PCR)을 이용하여 측정하였다. 각 유전자들에 대한 특이적인 primer로는 HBV에 대한 forward primer로 5'-CGATCCATACTGCGGAACTC-3', reverse primer로 5'-GGAGGCTTGAACAGTAGGAC-3'를 사용하였고, TNF-a에 대한 forward primer로 5'-ACTAGTGG- TGCCAGCCGATGGGTTG-3; reverse primer로 5'-GTGG- GGGCTGGGTAGAGAATGGATG3를 사용하였고, CYP1A1에 대한 forward primer로 5'-GCCAATGTCCAGCTGTCAGA- 3', reverse primerg. 5'-GATGGTGAAGGGGACGAAGG-3' 를 사용하였고, b-actin에 대한 forward primerg.
이러한 관점에서 우리는 HBV 연구에 대한 작은 실험동물 모델로서의 마우스에 대한 가능성 연구의 일환으로서 그에 준하는 시험관내 시스템에 대한 연구를 수행하였으며, 본 논문에서는 마우스 간암 세포주인 Hepa-lclc7 세포에서의 HBV 의 감염성을 알아보았다. 또한, 만성 B형 간염환자의 간세포 뿐만 아니라 일시적으로 또는 안정적으로 transfection 된 인간 간암 세포주인 HepG2 세포에서 염증성 사이토카인 tumor necrosis factor-a (TNF-a)가 발현된다는 사실에 근거하예 16], Hepa-lclc7세포에서의 HBV에 의한 TNF-a 유전자 발현의 유도에 대하여 알아보았다.
Hepa-lclc7 세포를 30-50% con- fluency의 농도로 60-mm 접시에서 배양한 후, 무혈청 배지와 주어진 농도의 환자 혈청을 섞어서 6시간 동안 37℃, 5% CO2 배양기에서 배양한 후, HBSS로 5회 세척한 다음 10% 우태혈청을 함유한 Williams, E 배지 4 ml을 가하여 배양하였다. 세포 내 도입 및 감염 후의 세포와 세포배양 상충액은 기술된 시간 후에 따로 모아서 각각 mRNA와 HBsAg을 검출하는데 사용하였다.
3-eq HBV genome 5 mg을 세포 내 도입시킨 경우와 10%의 HBV 보균자의 혈청으로 감염시킨 경우, 그리고 아무것도 처리하지 않은 경우에 대하여 세포 및 세포배양액을 취하여 분석에 이용하였다. 세포로부터 RNA를 분리하여 HBV, TNF-a, CYP1A1, 그리고 b-actin 유전자에 대해 특이적인 primer들을 사용한 RT-PCR을 수행하여 각 유전자에 대한 mRNA의 발현 여부를 결정하였으며, 세포배양액은 Abbott IMx system을 이용하여 microparticle immunoassay를 수행하여 HBsAg의 발현 및 분비 양상을 측정하였다(Fig. 1). 동량의 RNA를 이용하여 RT-PCR-g- 수행한 결과 1.
5 U of Taq DNA polymerase, 재조합 DNA IS와 각각 6 pmol의 primer들로 이루어진 PCR 종합혼합물을 가하였다. 시료들은 5분간 94℃ 로 변성시킨 다음, 94℃, 30초; 59℃, 30초; 72℃, 30초의 과정을 30회 반복하였고, 마지막으로 5분간 72℃ 에서 처리하였다. PCR 결과물은 8% polyacrylamide 겔 전기영동과 ethidum bromide 염색으로 확인하였다.
야생형 B형 간염 바이러스 게놈(adw-type HBV)을 가진 pAM6 플라스미드는 ATCC에서 구입하였으며, DNA 염기서열을 확인하여 발견된 2137-nt 부위의 손실된 부분을 site- directed mutagenesis 방법을 이용하여 복원시킨 후, HBV 게놈의 1.3배 길이의 게놈(1.3-eq HBV genome)을 만들어 Invi- trogen (Carlsbad, CA, USA)에서 구입한 pcDNA3 벡터에 클로닝하여 재조합 HBV 발현 벡터를 제조하였다. 재조합 HBV 발현 벡터의 세포 내 도입(transfection)은 lipofectin 방법을 이용하여 수행하였다.
TNF-a mRNA 를 정량하기 위하여 위의 TNF-a에 특이적인 primer 결합 부위들을 포함하는 재조합 DNA TNF-a internal standards (IS)를 만들어 quantitative/competitive RT-PCR을 수행하였다 [12, 30]. 전체 RNA는 oligo (dT)i5를 primer로 사용하여 cDNA 로 만든 후, PCR 완충액, 4 mM MgCl2, 2.5 U of Taq DNA polymerase, 재조합 DNA IS와 각각 6 pmol의 primer들로 이루어진 PCR 종합혼합물을 가하였다. 시료들은 5분간 94℃ 로 변성시킨 다음, 94℃, 30초; 59℃, 30초; 72℃, 30초의 과정을 30회 반복하였고, 마지막으로 5분간 72℃ 에서 처리하였다.
대상 데이터
Louis, MO, USA) 에서 구입하였다. 마우스 간암 세포주인 Hepa-lclc7 세포는 American Type Culture Collection (ATCC; Rockville, MD, USA)에서 구입하였으며, 100 units/ml penicillin, 100 pg/ml streptomycin, 2 mM L-glutamine, 그리고 10% 우태혈청이 포함된 William's E 배지에서 37℃, 5% CO2 배양기에서 배 양하였다.
본 실험에서 사용된 시약들 중 Williams7 E 배지와 우태혈청 (fetal bovine serum; FBS)은 GIBCO BRL (Gaithersberg, MD, USA)에서 구입하였으며, 그 외의 특별하게 언급하지 않은 시약들은 모두 Sigma Chemical Co. (St. Louis, MO, USA) 에서 구입하였다. 마우스 간암 세포주인 Hepa-lclc7 세포는 American Type Culture Collection (ATCC; Rockville, MD, USA)에서 구입하였으며, 100 units/ml penicillin, 100 pg/ml streptomycin, 2 mM L-glutamine, 그리고 10% 우태혈청이 포함된 William's E 배지에서 37℃, 5% CO2 배양기에서 배 양하였다.
데이터처리
각각의 실험에 있어서 각각의 비교군에 대하여 평균값±표 준오차(SE)를 계산하였다. 대조군에 대한 유의성은 Dunnett 의 two-tailed t-test를 수행하여 평가하였다[9].
각각의 실험에 있어서 각각의 비교군에 대하여 평균값±표 준오차(SE)를 계산하였다. 대조군에 대한 유의성은 Dunnett 의 two-tailed t-test를 수행하여 평가하였다[9].
이론/모형
그리고 HBV의 감염 이나 복제에 대한 연구를 위한 효율적인 시험관내 시스템의 부재 또한 연구의 제약이다. 이러한 연구모델의 한계를 극복 하기 위하여 인간의 간에서 유래된 세포들을 이용한 세포배양 시스템이 이용되었다. 시험관내 HBV 감염의 연구는 주로 인간 간모세포종에서 유래된 세포주인 HepG2 세포를 이용하여 이루어졌다[2, 21].
3-eq HBV genome)을 만들어 Invi- trogen (Carlsbad, CA, USA)에서 구입한 pcDNA3 벡터에 클로닝하여 재조합 HBV 발현 벡터를 제조하였다. 재조합 HBV 발현 벡터의 세포 내 도입(transfection)은 lipofectin 방법을 이용하여 수행하였다. 기술된 농도의 재조합 HBV 발현 벡터 를 lipofectin 용액 20 pl 그리고 무혈청 배지 400 J11 와 섞어 상온에서 2시간 방치한 후, 3.
전체 RNA는 TRI Reagent를 사용하여 Chomczynski의 방법으로 분리하였다[7]. HBV, TNF-a, cytochrome P450 1A1 (CYP1A1), B-actin의 mRNA 발현은 reverse transcription- polymerase chain reaction (RT-PCR)을 이용하여 측정하였다.
성능/효과
4). HBV 감염 후 시간에 따른 변화로서, TNF-a mRNA 발현은 감염 후 2일 까지는 발현이 유도되었으며 그 후로는 원상태로 회복되었고, HBsAg 또한 초기에 분비가 이루어진 후 더 이상의 변화는 보이지 않았다 (Fig- 5).
3). HBV 혈청을 이용한 감염의 경우에도 사용 혈청의 농도와 HBsAg의 분비와의 상관관계를 측정한 결과, HBsAg의 분비는 HBV 혈청 0.1%에서는 영향이 없었으나, 1%부터 농도에 비례하여 증가하는 경향을 보여주었다(Fig. 4). HBV 감염 후 시간에 따른 변화로서, TNF-a mRNA 발현은 감염 후 2일 까지는 발현이 유도되었으며 그 후로는 원상태로 회복되었고, HBsAg 또한 초기에 분비가 이루어진 후 더 이상의 변화는 보이지 않았다 (Fig- 5).
3-eq HBV genome을 세 포내 도입시킨 경우와 HBV 혈청으로 감염시킨 경우 모두 세포 내에서의 TNF-a mRNA의 발현이 유도되었다. HBV가 처리된 경우, 세포 내부에서의 mRNA 발현과 더불어 HBsAg 을 의미 있게 분비하는 결과도 나타났다(S/N ratio>2.0).
HBV의 농도에 따른 세포 내 도입의 영향을 측정하기 위하여 HBV 발현 벡터인 1.3-eq HBV genome 1 mg과 10 jig을 H叩aJclc7 세포내로 도입시킨 결과 세포에서는 TNF-a mRNA 의 발현이 사용한 HBV DNA의 농도에 비례하여 증가하는 양상을 보였으며, 이때 HBsAg의 발현 및 분비 역시 농도 의 존적으로 증가하는 양상을 보여 주었다(Fig. 3). HBV 혈청을 이용한 감염의 경우에도 사용 혈청의 농도와 HBsAg의 분비와의 상관관계를 측정한 결과, HBsAg의 분비는 HBV 혈청 0.
시료들은 5분간 94℃ 로 변성시킨 다음, 94℃, 30초; 59℃, 30초; 72℃, 30초의 과정을 30회 반복하였고, 마지막으로 5분간 72℃ 에서 처리하였다. PCR 결과물은 8% polyacrylamide 겔 전기영동과 ethidum bromide 염색으로 확인하였다. 시료의 RNA로부터 증폭된 PCR 산물은 370-bp의 길이를 가졌으며, 재조합 IS로부터 증폭된 경우에는 324-bp 길이의 PCR 산물이 얻어졌다.
1). 동량의 RNA를 이용하여 RT-PCR-g- 수행한 결과 1.3-eq HBV genome이 세포 내 도입된 Hepa-lclc7세포에서 대조군으로 사용된 b-actin mRNA 의 발현에는 영향이 없었던 반면, HBV mRNA의 발현이 이루어지고 있음을 알 수 있었다. 또한 HBV 혈청으로 감염시킨 Hepa-lclc7 세포에서도 미약하나마 HBV mRNA가 존재 한다는 사실을 알 수 있었다.
세포 외부에서 처리된 HBV에 의한 감염 시에도 세포 내부에서 HBV mRNA 발현이 이루어졌다는 결과는 인간 HBV의 자연 숙주가 아닌 마우스 세포인 Hepa- lclc7 세포에서도 HBV 감염이 가능하다는 사실을 보여주었 다. 또한 세포 내 도입과 감염을 이용한 Hepa-lclc7 세포에 대한 HBV의 처리는 결과적으로 염증성 사이토카인인 TNF-a 유전자의 발현을 유도하였다. 이러한 결과들은 마우스 간암 세포주인 Hepa-lclc7 세포가 HBV 연구에 대한 시험관내 모델로서 가능하다는 것을 보여준다.
Lipofectin 방법을 사용하여 세포내로 도입된 HBV에 의해 HBV mRNA 및 HBsAg 발현이 이루어진 것은 인간 HBV의 유전자 발현 기전이 마우스 세포인 Hepa-lclc7 세포에서도 정상적으로 이루어졌다는 사실을 의미하였다. 세포 외부에서 처리된 HBV에 의한 감염 시에도 세포 내부에서 HBV mRNA 발현이 이루어졌다는 결과는 인간 HBV의 자연 숙주가 아닌 마우스 세포인 Hepa- lclc7 세포에서도 HBV 감염이 가능하다는 사실을 보여주었 다. 또한 세포 내 도입과 감염을 이용한 Hepa-lclc7 세포에 대한 HBV의 처리는 결과적으로 염증성 사이토카인인 TNF-a 유전자의 발현을 유도하였다.
또한 세포 내 도입과 감염을 이용한 Hepa-lclc7 세포에 대한 HBV의 처리는 결과적으로 염증성 사이토카인인 TNF-a 유전자의 발현을 유도하였다. 이러한 결과들은 마우스 간암 세포주인 Hepa-lclc7 세포가 HBV 연구에 대한 시험관내 모델로서 가능하다는 것을 보여준다.
후속연구
이러한 일종의 리간드와 수용체간의 결합에 관여하는 것으로 알려진 세포의 수용체들로는 인간 annexin V와 carboxypeptidase D (gpl80) 및 asialoglycoprotein 수용체 등 여러 물질들이 제시되고 있다[26, 29, 31]. 마우스에서 유래된 세포인 Hepa-lclc7 세포에서의 HBV 감염에 의한 효과가 나타난다는 것은 이 세포에서도 이러한 수용체들이 존재 할 가능성을 시사하며, 이에 대해서는 보다 심층적인 연구가 필요하다.
그러나 HBV에 특이적인 세포의 클론 결실에 관한 자세한 연구는 아직 수행 되어져 있지 않다. HBV에 의한 TNF-a 발현의 유도는 X 단백질에 의하여 전사단계에서 조절된다는 사실이 알려져 있으며[16], X 단백질은 다른 사이토카인들의 발현 및 그에 관련된 세포 내 신호전달체계에 깊이 관여한다고 알려져 있다[1 이. 이러한 점에서 Hepa-lclc7 세포에서의 HBV에 의한 TNF-a의 발현의 변화 역시 HBx에 의해 일어날 가능성이 있으며, 이러한 점들에 대해서는 계속 연구되어져야 할 것이다.
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