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문제 정의
- pylori (ATCC 43504)에 대한 항균활성이 확인되어 프로바이오틱스 균주로서의 기본 조건을 일부 충족하는 것으로 확인한 바 있다. 본 연구에서는 유산균의 증식 및 항균물질 생산량 증가를 위한 최적의 배지, 초기 pH, 공기 조성, 배양 온도와 시간 등의 배양 조건과 프리바이오틱스의 영향을 알아보고자 한다.
제안 방법
- Brucella broth 내에 H. pylori의 세포수를 1.0 × 105 CFU/ml으로 조정한 다음 유산균 배양 상등액 5.0% (v/v)를 첨가하고, 37℃에서 48시간 배양한 후 Brucella agar상에서 표준한천평판배양법으로 생균수를 측정하여 배양 상등액의 항균 활성을 조사하였다.
- High-pressure liquid chromatography (HPLC, Shimadzu)의 컬럼은 Aminex HPX-87H (300×7.8 mm: Bio-Rad)이며, 검출기는 refractive index (GBC Scientific Equipment Pty Ltd.), 이동상은 H2SO4 (5 mM), 유속은 0.5 ml/min이었고, 컬럼 온도 35℃하에서 분석하였다.
- 0×105 CFU/ml으로 맞추었고, 일정한 비율로 희석한 조박테리오신 용액을 혼합한 후 microtiter plate well (Falcon) 에 가한 다음 37℃에서 24시간 배양하였다. Microplate reader (BioTek, Inc.)를 통해 600 nm에서 흡광도를 측정하여 조박테리오신 용액 대신 buffer를 처리한 대조구에 비해 혼탁도가 50% 저해된 최대 희석배수의 역수를 측정하여 박테리오신 활성(arbitrary units, AU/ml)으로 환산하였다.
- 공기 조성: 실험 균주를 MRS broth (pH 6.0)에 접종하여 37℃, 24시간 동안 호기성, 미호기성(85% N2, 5% O2, 10% CO2) 및 혐기성(85% N2, 10% H2, 5% CO2) 조건 하에서 배양한 후 배양액을 채취하여 생균수, 대사산물의 생성량 및 배양상등액과 박테리오신 용액의 항균 활성을 측정하였다.
- 배양액을 무균적으로 채취하여 MRS agar (Difco) 배지 상에서 표준한천평판배양법으로 유산균의 생균수를 측정하였다. 또한 pH meter (Metrohm 744, The Netherlands)를 이용하여 배양액의 pH를 측정하였다. 적정산도는 배양액에 동량의 증류수를 가하여 1% (w/v) phenolphthalein을 첨가한 후 0.
- 배양 시간: 실험 균주는 MRS broth (pH 6.0)에 접종하여 37℃, 12–48시간 호기적 조건 하에서 배양하는 동안 일정한 시간 간격으로 배양액을 채취하여 생균수, 대사산물의 생성량 및 배양 상등액과 박테리오신 용액의 항균 활성을 측정하였다.
- 배양 온도: 실험 균주는 MRS broth (pH 6.0)에 접종하여 25, 30, 37 및 45℃, 24시간 호기적 조건 하에서 배양한 후 배양액을 채취하여 생균수, 대사산물의 생성량 및 배양 상등액과 박테리오신 용액의 항균 활성을 측정하였다.
- 배양상등액 내에 존재하는 세균의 세포를 제거하기 위해 0.45 μm membrane filter로 여과제균하였다.
- 배지 종류: 실험 균주는 BHI, MRS 및 M17 broth에 접종한 다음 37℃, 24시간 호기적 조건하에서 배양한 후 배양액을 채취하여 생균수, 대사산물의 생성량 및 배양 상등액과 박테리오신 용액의 항균 활성을 측정하였다.
- 숙성된 백김치로부터 얻은 Lactobacillus brevis BK11의 증식과 항균물질 생산에 대한 배양용 배지 종류, 공기 조성, 초기 pH, 배양온도 및 시간과 프리바이오틱스의 영향을 조사하였다. L.
- 유산균의 증식 속도와 증식에 따른 대사산물의 생성량 및 항균 활성 변화에 대한 배지 종류, 배양 조건 및 프리바이오틱스의 영향을 살펴보았다.
- 유산에 의한 영향을 제거하기 위해 1 N NaOH를 이용하여 배양 상등액의 pH를 6.5으로 조정하였으며, 과산화수소에 대한 영향을 배제하기 위해 카탈라아제(1 mg/ml, Sigma-Aldrich)를 처리하였다. 배양 상등액에 50% (w/v) 황산암모늄을 처리한 후 4℃ 내에서 교반한 다음 원심분리(12,000 × g, 30분, 4℃)하여 얻어진 침전물은 20 mM PBS (pH 6.
- 적정산도는 배양액에 동량의 증류수를 가하여 1% (w/v) phenolphthalein을 첨가한 후 0.1 N NaOH 용액으로 적정한 다음, 미홍색의 종말점에 도달한 소비량을 측정하여 계산식 [적정산도(%) = (0.1 N NaOH 소비량 ×0.1 N NaOH 역가 × 0.9)/ 시료양]에 대입하였다.
- 초기 pH: 실험 균주는 1 N HCl 혹은 NaOH를 이용하여 pH 5.0, 6.0, 7.0, 8.0 및 9.0으로 조정된 MRS broth에 접종하여 37℃, 24시간 호기적 조건하에서 배양한 후 배양액을 채취하여 생균수, 대사산물의 생성량 및 배양 상등액과 박테리오신 용액의 항균 활성을 측정하였다.
- 프리바이오틱스: 실험 균주는 MRS broth (pH 6.0)에 0.5, 1.0 및 2.0%의 농도로 FOS, 라피노오스 및 이뉼린 등의 프리바이오틱스를 첨가하여 제조한 배지에 접종한 다음 37℃, 24시간 호기적 조건 하에서 배양한 후 배양액을 채취하여 생균수, 대사산물의 생성량 및 배양 상등액과 박테리오신 용액의 항균활성을 측정하였다.
- 한편, 잔당의 함량 측정을 위해 배양액을 원심분리(7,000 × g, 10분, 4℃)한 후 상등액을 0.22 μm membrane filter로 여과 제균한 다음 HPLC를 이용하여 분석하였다.
대상 데이터
- 분석에 사용된 컬럼은 RS pack KC-811 (8 mm I.D. × 300 mm)을 사용하였고 이동상은 1 ml/min 유속으로 0.25% (v/v) H2SO4 용액을 사용하였다.
데이터처리
- Duncan's multiple range test를 통해 유의성을 검증하였다.
- 실험 항목별 총 3회 실시 후 얻어진 측정값은 평균±표준편차로 나타내었고, 통계처리는 Statistical Package for Social Science (SPSS)를 이용하여 유의수준 P<0.05에서 일원배치 분산분석(one-way ANOVA) 하였다.
이론/모형
- 박테리오신 용액의 활성은 H. pylori ATCC 43504를 대상으로 microtiter plate 방법(Hole et al., 1991)으로 측정하였다. H.
- 배양액을 무균적으로 채취하여 MRS agar (Difco) 배지 상에서 표준한천평판배양법으로 유산균의 생균수를 측정하였다. 또한 pH meter (Metrohm 744, The Netherlands)를 이용하여 배양액의 pH를 측정하였다.
성능/효과
- 혐기적 조건보다는 호기적 및 미호기적 조건에서 배양했을 때와 25℃ 보다는 30℃와 37℃ 온도에서 배양했을 때 균 성장과 항균물질 생산에 유리하였다. BK11 균주는 배양 24시간 만에 정지기에 도달하였고, 36시간 후부터는 생균수가 감소되었고, 배양상등액과 박테리오신 용액의 항균 활성은 37℃, 24-30시간 배양했을 때 가장 높았다. 세포수와 유산 및 박테리오신 생산은 프락토올리고당 1–2% 첨가한 경우에 가장 높았으나, 이뉼린과 라피노오스는 균 증식에 별다른 도움을 주지 못했다.
- FOS, 이뉼린 및 라피노오스를 0.5–2.0%의 농도로 첨가한 경우 최종 균수는 대조구(무첨가구)와 유의한 차이가 없었으며, 배양액 내에 잔존하는 글루코오스 성분은 검출되지 않았다.
- 숙성된 백김치로부터 얻은 Lactobacillus brevis BK11의 증식과 항균물질 생산에 대한 배양용 배지 종류, 공기 조성, 초기 pH, 배양온도 및 시간과 프리바이오틱스의 영향을 조사하였다. L. brevis BK11의 증식과 항균물질 활성은 BHI와 M17 배지 보다는 MRS 배지 상에서 더높게 나타났으며, 배지의 초기 pH 6.0에서 생산량이 최대에 이르렀다. 혐기적 조건보다는 호기적 및 미호기적 조건에서 배양했을 때와 25℃ 보다는 30℃와 37℃ 온도에서 배양했을 때 균 성장과 항균물질 생산에 유리하였다.
- lactis subsp. lactis를 미호기적 혹은 혐기적 조건 하에서 배양했을 때 세포수, 배양액의 pH 및 박테리오신 생산량에는 유의한 차이가 없었고, 이들 공기 조성은 호기적 배양 조건보다 균의 성장과 박테리오신 생산에 유리한 것으로 나타났다고 하여 본 결과와는 다소 차이가 있었다. 즉, MRS 배지 내에서 20시간 동안 호기적 조건에서 배양했을 때 생균수는 8.
- pylori에 대한 배양 상등액의 항균활성은 FOS 첨가 농도에 따라 서서히 증가하여 2% 첨가구는 대조구에 비해 유의한 증가를 보였다. 게다가 L. brevis BK11의 박테리오신 생산에 대하여 이뉼린과 라피노오스는 아무런 영향을 미치지 않았으나, FOS를 1%와 2% 첨가한 경우는 2배 증가되었음을 확인하였다. 하지만 FOS 0.
- 호기적 및 미호기적 조건 하에서 배양한 경우 유산균수에는 차이가 없었으나, 혐기적 조건에서 배양한 경우는 이보다 약 2 log cycle 낮은 최종 균수가 얻어졌다. 게다가 혐기적 조건 하에서 배양한 배양액 내에서 글루코오스가 잔존하였고, 유산의 생성량도 호기적 혹은 미호기적 조건에서 배양했을 때보다 유의하게 낮았다. 배양액의 pH는 미호기적 조건에서 배양했을 때 가장 낮았으며, 이는 호기적 조건과는 유의할만한 차이가 없었으나, 혐기적 조건에서배양했을 때보다 유의하게 낮았다.
- 세포수와 유산 및 박테리오신 생산은 프락토올리고당 1–2% 첨가한 경우에 가장 높았으나, 이뉼린과 라피노오스는 균 증식에 별다른 도움을 주지 못했다. 결과적으로 L. brevis BK11의 항균물질 생산은 세포수와 관계 있었으며, 이러한 최적 조건 하에서 배양한 경우 Helicobacter pylori ATCC 43504의 성장을 효과적으로 저해할 수 있다.
- 30℃와 37℃에서 배양한 경우는 109 CFU/ml 정도로 나타났으나, 45℃에서 배양한 경우는 108 CFU/ml이었고, 25℃에서는 106 CFU/ml 정도에 그쳤다. 또한 25℃와 45℃에서 배양한 경우 배양액 내에 글루코오스가 일부 잔존하였고, 유산 생성량과 산도는 균수가 가장 많은 30℃ 와 37℃ 배양 온도 대에서 가장 높았고, 그에 따른 배양액의 pH는 25℃와 45℃에 비해 유의하게 낮았다. 특히 배양 상등 액의 H.
- 0에서 배양하여 얻은 상등액의 항균활성이 가장 낮게 나타났다. 박테리오신 활성은 대조구와 pH 6.0와 7.0에서 512 AU/ml이었고, pH 8.0에서 얻은 박테리오신은 128 AU/ml으로 나타났지만, pH 5.0과 9.0에서는 박테리오신 활성이 측정되지 않았다. 배지 성분인 글루코오스는 배양 과정 중 pH 5.
- 배양액의 pH는 MRS (3.54±0.14)와 M17 (3.76±0.28) 배지 내에서 유의한 차이가 없었으나, BHI (4.15±0.05) 배양액의 pH 보다 유의하게 낮았고, 산도의 경우도 MRS (1.46±0.14%)와 M17 (1.34±0.13%) 배지가 BHI (0.80±0.09%) 배지 내에서 생성된 산도보다 유의하게 높았다.
- 게다가 혐기적 조건 하에서 배양한 배양액 내에서 글루코오스가 잔존하였고, 유산의 생성량도 호기적 혹은 미호기적 조건에서 배양했을 때보다 유의하게 낮았다. 배양액의 pH는 미호기적 조건에서 배양했을 때 가장 낮았으며, 이는 호기적 조건과는 유의할만한 차이가 없었으나, 혐기적 조건에서배양했을 때보다 유의하게 낮았다. 이에 따라 산도도 혐기적 조건에서 배양했을 때 가장 낮았고, 배양 상등액의 항균 활성도 혐기적 조건이 불리하게 나타났으며, 박테리오신 활성도 혐기적 조건 하에서 가장 낮게 측정되었다.
- 5%를 첨가한 경우는 대조구보다 다소 낮게 나타났으나 유의할만한 차이는 없었다. 배양액의 산도는 FOS를 1%와 2% 첨가했을 때 대조구에 비해 유의 하게 높게 나타났으며, H. pylori에 대한 배양 상등액의 항균활성은 FOS 첨가 농도에 따라 서서히 증가하여 2% 첨가구는 대조구에 비해 유의한 증가를 보였다. 게다가 L.
- 0인 경우는 이보다 낮게 나타났다. 유산 생성량에 따라 산도는 초기 pH 6.0 배지에서 가장 높았고, 배양 후 최종 pH도 초기 pH 6.0에서 가장 낮게 나타났다. 초기 pH 6.
- pylori ATCC 43504에 대한 항균활성을 측정한 결과는 Table 1과 같다. 유산균수는 MRS와 M17 배지 상에서 109 CFU/ml에 이르렀으나, BHI 배지 내에서는 이보다 낮은 108 CFU/ml로 나타났고, 모든 배지 내에 글루코오스 성분은 검출되지 않았다. 유산의 생성량도 MRS 배지 내에서 가장 높게 나타났으나(125.
- 유산의 생성량도 MRS 배지 내에서 가장 높게 나타났으나(125.9±4.5 mM), BHI (76.3±3.9 mM)와 M17 (99.1±6.2 mM) 내에서는 MRS 배지보다 유의하게 낮게 측정되었다.
- 이때 배양액의 pH는 대수증식기 동안 급격히 감소되어 정지기에 도달했을 때 일정한 수준으로 유지되었고, 박테리오신은 대수증식기 때 검출되기 시작하여 12–14시간 때 최대에 이르러 균의 성장과 비례적으로 박테리오신이 생산되어 생산 균주의 1차 대사산물임을 확인하였다.
- 이상의 결과를 요약하면, 유산균의 유산이나 박테리오신은 영양원의 종류와 농도, 공기 조성, 초기 pH 및 온도 등 배양 조건 등에 따라 생산량에 차이가 있음을 확인하였다. 특히 크로마토크래피 컬럼으로 박테리오신을 정제할 경우 생산 단가가 상승하고 처리 과정 중 일부 활성이 소실될 수도 있다.
- 배양액의 pH는 미호기적 조건에서 배양했을 때 가장 낮았으며, 이는 호기적 조건과는 유의할만한 차이가 없었으나, 혐기적 조건에서배양했을 때보다 유의하게 낮았다. 이에 따라 산도도 혐기적 조건에서 배양했을 때 가장 낮았고, 배양 상등액의 항균 활성도 혐기적 조건이 불리하게 나타났으며, 박테리오신 활성도 혐기적 조건 하에서 가장 낮게 측정되었다.
- 5% (자료 미 제시) 첨가에 의해선 박테리오신 활성 증가가 나타나지 않았다. 이와 같은 결과에서 미뤄볼 때, 일정한 농도의 FOS는 L. brevis BK11의 박테리오신 생산을 증가시켰지만, 이뉼린이나라피노오스는 영향을 미치지 않았으므로 프리바이오틱스 종류에 따라 특정한 균이 생산한 박테리오신 활성에 미치는 영향이 상이한 것으로 추정된다.
- 7%)의 배양 상등액 보다 유의하게 높았으며, MRS (512 AU/ml) 배지로부터 얻어진 박테리오신의 항균 활성도 가장 높게 나타났다. 이와 같은 결과에서 볼 때, L. brevis BK11의 균주는 MRS 배지에서 배양한 경우 증식속도가 가장 높았고, 이에 따른 대사산물 생성량도 BHI와 M17 배지에서 배양했을 때보다 유의하게 증가되었으며, 배양액 내의 유산과 박테리오신에 의해 H. pylori의 증식 억제 효과도 크게 나타난 것으로 사료된다.
- lactis를 미호기적 혹은 혐기적 조건 하에서 배양했을 때 세포수, 배양액의 pH 및 박테리오신 생산량에는 유의한 차이가 없었고, 이들 공기 조성은 호기적 배양 조건보다 균의 성장과 박테리오신 생산에 유리한 것으로 나타났다고 하여 본 결과와는 다소 차이가 있었다. 즉, MRS 배지 내에서 20시간 동안 호기적 조건에서 배양했을 때 생균수는 8.89 CFU/ml인 반면, 미호기적 조건과 혐기적 조건 하에서는 각각 9.62 CFU/ml과 9.42 CFU/ml로 나타났고, 12시간 배양했을 때 미호기적 조건과 혐기적 조건에서 박테리오신 활성은 320 AU/ml이었고, 호기적 조건 하에서는 160 AU/ml 로 나타났다. 일반적으로 유산균은 미호기성 균으로서 산화적 스트레스는 성장을 더디게 하고 대사산물인 박테리오신 생산량에도 감소시킨다고 보고되었다(Taheri et al.
- 초기 pH 6.0인 경우 H. pylori에 대한 배양 상등액의 항균 활성이 유의하게 가장 높았고(27.5±2.0), 대조구와 pH 7.0인 경우는 이보다 낮게 나타났으며, pH 9.0에서 배양하여 얻은 상등액의 항균활성이 가장 낮게 나타났다.
- 초기 pH를 조정하지 않은 MRS (6.84±0.05) 배지(대조구)와 초기 pH를 5.0–9.0로 조정한 배지에 L. brevis BK11를 접종한 후 37℃, 24시간 동안 호기적인 조건 하에서 배양한 결과, 유산균 수는 대조구와 pH 6.0와 7.0인 배지 내에서는 109 CFU/ml로 유의한 차이가 없었으나, pH 8.0인 경우는 108 CFU/ml이었으 며, pH 5.0 (107 CFU/ml)와 9.0 (106 CFU/ml)인 경우는 이보다 더 낮게 나타났다.
- 최대의 균수는 24–30시간(109 CFU/ml)배양하는 동안에 나타났고, 36시간 이후부터는 생균수가 서서히 감소하는 사멸 단계임을 확인하였다.
- 한편, H. pylori에 대한 MRS (22.4±2.1%) 배지로부터 얻은 배양 상등액(5%)의 항균 활성이 BHI (13.2±0.4%)와 M17 (17.1±0.7%)의 배양 상등액 보다 유의하게 높았으며, MRS (512 AU/ml) 배지로부터 얻어진 박테리오신의 항균 활성도 가장 높게 나타났다.
- 한편, 유산 생성량은 pH 6.0인 배지 상에서 가장 높게 나타났고, 대조구와 pH 7.0에서는 거의 비슷한 수준으로 나타났으며, pH 5.0, 8.0 및 9.0인 경우는 이보다 낮게 나타났다. 유산 생성량에 따라 산도는 초기 pH 6.
- brevis BK11의 증식과 대사산물의 생성량 및 항균 활성 변화를 살펴본 결과는 Table 3과 같다. 호기적 및 미호기적 조건 하에서 배양한 경우 유산균수에는 차이가 없었으나, 혐기적 조건에서 배양한 경우는 이보다 약 2 log cycle 낮은 최종 균수가 얻어졌다. 게다가 혐기적 조건 하에서 배양한 배양액 내에서 글루코오스가 잔존하였고, 유산의 생성량도 호기적 혹은 미호기적 조건에서 배양했을 때보다 유의하게 낮았다.
후속연구
- 특히 크로마토크래피 컬럼으로 박테리오신을 정제할 경우 생산 단가가 상승하고 처리 과정 중 일부 활성이 소실될 수도 있다. 따라서 생산량을 증가시킬 수 있는 최적의 배양 조건에서 항균물질을 생산하여 건강보조식품, 의약품이나 사료 등 산업적으로 이용하게 된다면 생산 비용을 절감시킬 수 있고 독성이 없는 안전한 천연물질로서 병원성 미생물을 제어하는데 효과적일 것으로 사료된다.
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