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문제 정의
- 특히 여러가지 신질환이 산화적 스트레스에 의해 유발된다는 보고가 많다. 따라서 토끼 신장에서 tert butylhydroperoxide (fBHP) 에 의한 지질 과산화와 세포 독성에 이들의 보호 효과를 확인하였다.
- 본 연구에서는 한국에서 자생하는 호도의 분획분에 대해 활성산소의 제 거능을 DPPH radical 소거활성법과, 활성산소 종 생성억제활성법 그리고 ONOCI 소거활성법으로 검색하 고, 그것이 세포 상해에 보호 효과가 있는지 확인하였다. 특히 여러가지 신질환이 산화적 스트레스에 의해 유발된다는 보고가 많다.
제안 방법
- Louis, MO, USA)로 부터 구입하였고, 2', 7'- dichlorodihydrofluorescein diacetate (DXFH-DA) 와 DHR 123 (dihydrorhodamine 123)은 Molecular Probes (Eugene, OR, US시로부터 구입하였으며, ONO-는 Cayman Chemical Company (Ann Arbor, MI, USA)으로부터 구입하여 항산화 활성 실험을 시행하였다. LDH는 LDH-Lq kit (아산제약, 국 내)로 측정하였다.
- ONOO' 소거 활성은 dihydrorhodamine 123(DHR123) 의 산화되는 정도를 측정하여 검색하였다. DHR 123(5 mM)은 dimethyformamidefh 녹여서 stock 용액은 질소로 purge하여 -80℃에 보관하고, DHR123용액의 희석은 암실의 얼음 위에서, 사용하기 전에 조제하였다.
- 지질 산화는 신장에서 산화적 세포 손상의 증거로 알려져 있다. 따라서 그 지질과산화의 부산물인 MDA를 측정하여 호두박 추출물의 효과를 확인하였다.
- 배양된 신피질 절편을 2 ml의 증류수에서 분쇄하여 원심 분리한 후 얻은 상층액과 배양한 배지를 LDH kit를 사용하여 LDH의 활성을 490 nm에서 흡광도 UV-visible spectrometer (hp8453, Germany)로 측정하였다.
- 활성산소량을 형광물질 dichlorofluorescine diacetate (DCF- DA)를 사용하여 fluorescence microplate상에서 직접 측정 할 수 있게 되었다. 본 연구에서는 사람의 간세포주인 AC2F 세 포주를 fluorescence microplate에 배양하여 DCF-DA를 처리한 후 호두박의 추출물을 처리하고 활성산소 변화량을 Em. 485, Ex.
- 본 연구에서는 호두박 분획층의 항산화 활성을 검색하기 위해 MeOH, CH2CI2, EtOAc, BuOH 그리고 H2O 분획으로 추출하여 수행하였고, 각 분획층의 산화적 세포손상과 지질 과산화의 방지 효과를 in에서 확인하였다. 그 결과 호두박 의 free radical (DPPH radical) 소거활성은 EtOAc층에서 가 장높게 나타났고, 활성산소종 억제율과 peroxynitrite (ONOO) 소거 활성은 CH2CI2층을 제외한 모든 분획층에서 높게 나타났다.
- 생체 내에서 생성되는 활성산소종을 직접적으로 정량 측정하는 방법으로 간세포주(AC2F)에서 생성된 활성산소종에 의해 비형광 probe인 DCFH-DA가 강한 형광성을 띄는 DCF 로 전환되는 기전을 이용하였다.
- 전체 3 ml 내에서 시료의 농도는 100 /ml에서 1000 Jig/ml까지 되도록 제조하였다. 시료를 첨가하지 않은 대조구의 흡광도를 1/2로 감소시키는데 필요한 시료의 농도를 ICs;으로 나타내었고 흡광도는 microplate reader spectrophotometer VERSAmax (Molecular Devices, CA, USA)로 측정하였다.
- 지질과산화는 조직의 malondialdehyde (MDA)의 양으로 측정하였다. 신피질을 0.
- 호두박의 MeOH 추출물의 각 분획별 ONOCX 소거 활성을 측정하기 위해 직접적인 합성 ONOO- 소거 활성방법을 이용하여 측정하였다.
- 활성산소량을 형광물질 dichlorofluorescine diacetate (DCF- DA)를 사용하여 fluorescence microplate상에서 직접 측정 할 수 있게 되었다. 본 연구에서는 사람의 간세포주인 AC2F 세 포주를 fluorescence microplate에 배양하여 DCF-DA를 처리한 후 호두박의 추출물을 처리하고 활성산소 변화량을 Em.
대상 데이터
- 485, Ex. 530 nm파장에서 흡광도로 측정하였다.
- DPPH, L-ascorbic acid, DL-penicillamine (DL-2-amino-3- mercapto-3-methylbutanoic acid), TBA (Thiobarbarbituric acid), t-BHP (tert-butylhydroperoxide) 는 Sigma Chemical Company (St. Louis, MO, USA)로 부터 구입하였고, 2', 7'- dichlorodihydrofluorescein diacetate (DXFH-DA) 와 DHR 123 (dihydrorhodamine 123)은 Molecular Probes (Eugene, OR, US시로부터 구입하였으며, ONO-는 Cayman Chemical Company (Ann Arbor, MI, USA)으로부터 구입하여 항산화 활성 실험을 시행하였다. LDH는 LDH-Lq kit (아산제약, 국 내)로 측정하였다.
- 한국산 호두(Jugkms sinensis Dode)는 부산시 좌천동 소재 건재약방에서 구입하였다(2002.01.구입).
데이터처리
- )으로 측정하였다. 그리고 ONOO-의 바탕용액은 0.3 N NaOH를 사용하였고, 평균값으로 소거율을 계산하였다.
이론/모형
- 각 분획을 Fujita 등의 방법[2]에 의한 DPPH 라디칼 소거 법에 의해 항산화 활성을 측정하였다. 여러 농도의 시료를 ethanol (EtOH)에 녹여 2 ml가 되게 하고, 2x10M DPPH/ EtOH 1 ml에 첨가한 후, 30분간 실온에 방치한 후 517 nm에 서의 흡광도를 측정하였다.
성능/효과
- t-BHP를 처리시 LDH 방출 정도가 5.24±0.70%에서 25.33 ±3.20% 으로 증가하였고 호두박 추출물을 각각 0.05% 되도 록 첨가하였을 경우 MeOH, EtOAc, n-BuOH 분획에서 무처 리군 정도의 수준으로 감소함을 확인하였다(Fig. 5). 따라서 호두박 추출물이 활성산소에 의한 세포손상을 방지함을 알 수 있다.
- O 분획으로 추출하여 수행하였고, 각 분획층의 산화적 세포손상과 지질 과산화의 방지 효과를 in에서 확인하였다. 그 결과 호두박 의 free radical (DPPH radical) 소거활성은 EtOAc층에서 가 장높게 나타났고, 활성산소종 억제율과 peroxynitrite (ONOO) 소거 활성은 CH2CI2층을 제외한 모든 분획층에서 높게 나타났다. 신피질 절편에 t-BHP의 처리 시 LDH의 방출과 지질과 산화를 증가시켰고 이러한 변화는 호두의 MeOH, EtOAc, n-BuOH 분획에 의해서 완전하게 방지되었다.
- O분획 순으로 크게 나타났으며 이 결과 로서 호두박의 DPPH radical 소거활성을 지닌 성분은 대부분 EtOAc분획에 존재함을 알 수 있었다. 그리고 EtOAc분획 의 DPPH radical 소거활성은 대조구인 L-ascorbic acid의 약 2배의 활성을 뛸 정도로 강력하게 나타났다(Fig. 2).
- 본 실험에서도 EtOAc분획층의 활성이 대조군의 약 5배로 가장 높게 나타 났으며 CH2CI2 분획층을 제외한 모든 분획에서 대조군보다 2배 이상의 높은 활성을 나타냄을 알 수 있다.
- 이상의 결과로 호두박 추출물은 강한 항산화 활성을 가지고 있으며 그 중 EtOAc분획에 항산화 활성을 가진 성분이 가장 많이 존재하고 있을 것으로 판단할 수 있고, 이들의 항 산화 활성에 의해 산화적 세포 손상과 지질과산화를 방지하는 효과를 보이고 있음을 알 수 있다. 따라서 호두박 추출물에서 항산화 활성을 가지는 물질을 분리함으로써 다양한 질 병을 일으키는 산화적 세포 손상을 방지할 수 있을 것이고 이 보고는 의학적, 약리학적으로도 중요한 자료가 될 것이다.
- 95 pmole MDA/mg protein 로 확 연히 증가시키고 따라서 지질과산화가 f-BHP에 의한 신장 세 포 손상에 중요한 역할을 함을 알 수 있다[14]. 이와는 반대 로 호두박 추출물을 각각 0.05% 되도록 함께 처리하였을 경우 MeOH, EtOAc, „-BuOH 분획에서 지질 과산화가 각각 1068.05 ±104.12, 918.22 ± 79.06, 864.35 ± 43.49 pmole MDA/mg protein 로 무처리군 정도의 수준으로 감소되는 것을 확 인하였고 CH2CI2 분획과 HQ 분획에서는 그 효과가 없음을 확인할 수 있었다(Fig. 6). 지질 과산화에 대한 호두박 추출물 의 이러한 보호효과는 앞의 항산화활성 측정 결과와 유사하 게 나타났다.
- 호두박 EtOAc분획층의 활성산소종 소거 활성율은 20 ug/ml 농도에서 74.27±1.56%로 매우 높게 나타났으며 분획과정을 통해 MeOH, n-BuOH, HQ분획 이 각각 60.76±3.45%, 59.32 ±0.88%, 41.69±2.06%로 높게 측정된 것으로 보아 CH2CI2분 획을 제외한 모든 분획에서 활성 산소종 억제 활성을 가진 성분이 포함되어 있을 것으로 사료된다(Fig. 3).
- 호두박의 DPPH radical 소거 활성은 EtOAc, n-BuOH, MeOH, CH2CI2, H2O분획 순으로 크게 나타났으며 이 결과 로서 호두박의 DPPH radical 소거활성을 지닌 성분은 대부분 EtOAc분획에 존재함을 알 수 있었다. 그리고 EtOAc분획 의 DPPH radical 소거활성은 대조구인 L-ascorbic acid의 약 2배의 활성을 뛸 정도로 강력하게 나타났다(Fig.
- 호두박의 EtOAc, MeOH, n-BuOH 분획에서 모두 75% 이상의 강력한 ONOO- 소거 활성을 나타내었는데 이는 대조 군인 penicillamine의 소거 활성이 65.98±1.94%임을 고려해 볼 때, 상당히 높은 활성을 나타냄을 알 수 있었다(Fig. 4).
후속연구
- 이상의 결과로 호두박 추출물은 강한 항산화 활성을 가지고 있으며 그 중 EtOAc분획에 항산화 활성을 가진 성분이 가장 많이 존재하고 있을 것으로 판단할 수 있고, 이들의 항 산화 활성에 의해 산화적 세포 손상과 지질과산화를 방지하는 효과를 보이고 있음을 알 수 있다. 따라서 호두박 추출물에서 항산화 활성을 가지는 물질을 분리함으로써 다양한 질 병을 일으키는 산화적 세포 손상을 방지할 수 있을 것이고 이 보고는 의학적, 약리학적으로도 중요한 자료가 될 것이다.
- 이러한 결과는 호두 추출물이 f-BHP에 의한 신장 세포 손상에 효과적이 고 이러한 효과는 항산화력에 의한 것으로 추측된다. 또한 이러한 결과는 호두 추출물에서 많은 질병의 원인이 되고 있는 산화적 스트레스를 방지할 수 있는 효과적인 약물 개발의 가능성을 시사한다.
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