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문제 정의
- 따라서, 본 연구에서는 Aga2 단백질의 C 말단에 B. stearo- thermophilus NO. 2 CGTase를 유전적으로 융합시켜 효모 S. cereaisiae의 세포 표면에 CGTase 효소가 고정 부착된 새로운 생체촉매제(biocatalyst)를 개발하여 전분으로부터 CD를 생산함으로써, 유용 산업효소를 S. cerevisiae 세포 표면에서 발현하는 표면 발현 시스템을 구축하고자 한다.
제안 방법
- Sense primer 부위에는 EcoRI 제한효소 인식부위를 가지며, anti-sense primer에는 Xhol 제한효소 인식부위를 가지고 있다. 주형 DNA로 B. stewothermophilus의 cgt 유전자를 함유한 pCGTS[18]을 사용하여 Perkin-Elmer GeneAmp PCR System 2400(USA)에서 kb의 유전자 단편(c"S)만을 대량 증폭하였다. 증폭된 cgtS 단편은 pYDl에 EcoRI/XhoI으로 연결하여 E.
- Plasmid 안정성은 배양액을 적당히 희석하여 YPD 평판배 지에 도말한 후 자란 100개의 colony를 SD 선별배지로 tooth- picking한 다음 형성된 colony 수의비(백분율)로 측정하였다.
- Galactose로 유도되는 표면발현 vector*?] pYDl (GALI promoter) 에 cgtS 유전자를 subcloning하여 pYDCGTS (7.2 kb)를 구축하였다(Fig. 1). 구축된 plasmid는 우선 E.
- 1 kb)의 경우 효율적인 발현을 위해서 cgt 유전자 ORF 부위만 PCR로 증폭하였다. primers는 SeAACTGAGAATTCATGAGAAGAT- GGCTTTCG-3' (sense primer) 와 5'-GCCTCGAGGTCGACG- TTCTGCCAATCCACTAT-3' (anti-sense primer)로 제작하였다. Sense primer 부위에는 EcoRI 제한효소 인식부위를 가지며, anti-sense primer에는 Xhol 제한효소 인식부위를 가지고 있다.
- 1). 구축된 plasmid는 우선 E. coli DH5a 에 형질전환하여 증폭, 추출한 후 S. cerevisiae EBY100에 형 질전환시켜 uracil 결핍 최소 배지(SD)에서 형질전환체를 1차 선별하였다(EBYlOO/pYDCGTS). Fig.
- 균체 침전물과 배양 상등액을 사용하여 각 분획에서의 CGTase 활성을 측정하였다. CGTase의 활성은 Fujiwara 등[5]에 의해 제안된 methyl orange 법으로 측정하였다.
- 3). 또한 재조합 균주 S. cerevisiae EBYlOO/pYDCGTS를 YPDG 배지에서 플라스크 배양하여 균체 증식과 CGTase 발현량을 조사하였다. 그 결과 Fig.
- cerevisiae EBY100/pYDCGTS와 함께 활성염색하였다. 또한, 형질전환체 세포와 2% soluble starch를 반응한 후 명확한 CD 결정을 보기 위해 요오드를 첨가하여 건조시키고 현미경으로 검경하여 CD 결정의 생성 여부를 확인하였다기.
- 효소활성은 위와 같은 조건에서 분당 1 nmole의 a-CD를 생성하는 효소량을 1 unit로 정의하였다. 비활성도(specific activity)는 각 효소 활성을 건조균체농도(g-DCW/1) 값으로 나누어서 계산하였다.
- )로 정제하였다. 얻어진 cgtS 단편을 GALI promoter 와 AGA2 gene를 함유한 E. coli-S, cerevisiae shuttle vector인 pYDl (각각 EcoRI/XhoI으로 미리 절단)에 재조합하여 재조합 plasmid pYDCGTS을 구축하였다. 구축된 재조합 plasmid는 E.
- 이전에 구축된 episomal 발현계인 S. cerevisiae SEY2102/ pYES-CGTS (GALI promoter에 의한 유도성 발현계)와 S. cerevisiae SEY2102/pVT-CGTS (ADH1 promote!.에 의한 구성적 발현계)[18]를 대조구로 하여 표면 발현계와 활성 비교 등에 사용하였다.
- 재조합 CGTase의 표면 발현를 위해 재조합 효모의 발효 조 배양은 유도적 promoter인 GALI promoter를 가진 pYDl vector와 재조합된 유전자의 발현를 위해 YPDG 배지(1% yeast extract, 2% polypeptone, 1% dextrose, 1% galactose)를 사용하여 배양하였다.
- 재조합 균주 S. cerevisiae EBY100/pYDCGTS를 초기 pH6.0,25℃, YPDG 배지에서 48시간 회분 배양한 후 세포를 2% soluble starch와 함께 효소 반응시킨 후 전술의 방법에 따라 TLC로 반응 생성물을 비교하였다(Fig. 6). 그 결과 배양 12시간째부터 효소활성이 나타났고, 반응 10분 이후부터 CD가 생성되어 시간이 지남에 따라 CD 및 G1 (glucose), G2 (maltose), G3 (maltotriose) 등의 생성양이 증가하는 것을 확인하였다, 또한, 반응 12시간까지도 CD의 생성량이 계속 증가하였다' a-agglutinin> 사용하여 Kim 등[8]은 B.
- 재조합 효모 균주의 전배양은 SD 배지로 하였으며 flask 배양 및 fermentor 배양시 접종양은 5~6.5%(v/v)로 하였다. Flask 배양에서는 500 ml baffled-flask (working volume; 100 ml)로 30℃, 170 rpm이에서 수행하였으며, 재조합 CGTase 의 조효소을 확보하기 위한 발효조(KoBiotech Co.
- stewothermophilus의 cgt 유전자를 함유한 pCGTS[18]을 사용하여 Perkin-Elmer GeneAmp PCR System 2400(USA)에서 kb의 유전자 단편(c"S)만을 대량 증폭하였다. 증폭된 cgtS 단편은 pYDl에 EcoRI/XhoI으로 연결하여 E. coli DH5a를 숙주세포로 CaCZ법으로 형질전환하여 cgtS 단편을 확보하였다.
- 효모 형질전환체의 선별을 위한 배지로는 SD 배치(0.67% Bacto-yeast nitrogen base without amino acids, 2% dextrose) 에 leucine를 30 mg/1 로 첨가하여 사용하였고, CGTase활성 확인을 위해 1%의 soluble starch를 첨가한 YPGS (1% yeast extract, 2% polypeptone, 1% galactose, 1% soluble starch) 고체배지 상에 도말, 배양 후 iodine 증기에 의한 전분 분해 환 의 형성을 통해 CGTase 활성을 확인하였고, 이전에 episomal 발현과 비교하기 위해 이전에 재조합된 S. cerevisiae SEY2102/ pYES-CGTS (GALI promoter)와 S. cerevisiae SEY2102/pVT- CGTS (ADH1 promoter) [10]< S. cerevisiae EBY100/pYDCGTS와 함께 활성염색하였다. 또한, 형질전환체 세포와 2% soluble starch를 반응한 후 명확한 CD 결정을 보기 위해 요오드를 첨가하여 건조시키고 현미경으로 검경하여 CD 결정의 생성 여부를 확인하였다기.
- 효모에서의 표면발현을 위한 재조합 plasmid의 구축은 PCR 를 통해 확보된 B. stearothemophilus의 cgtS 유전자와 pYDl 를 각각 EcoRI/XhoI으로 처리하여 G이 extraction kit (Biopro- gen Co.)로 정제하였다. 얻어진 cgtS 단편을 GALI promoter 와 AGA2 gene를 함유한 E.
- CGTase의 활성은 Fujiwara 등[5]에 의해 제안된 methyl orange 법으로 측정하였다. 효소 반응은 1.5 ml의 50 mM 인산 완충액(pH 6.0)에 soluble starch와 methyl orange 최종 농도가 각각 1%와 0.035 mM이 되도록 첨가하여 잘 섞고 이 혼합액에 효소 용액을 가하여 5(TC에서 3시간 반응시켰다. 반응 후 6 N HC1 을 가하여 반응을 정지시키고 반응액을 160에서 15분간 방치한 후 500 nm에서 흡광도를 측정하였다.
대상 데이터
- coli 숙주세포는 DH%를 사용하였다. CGTase 유전자 공여 plasmid는 B. stearothermophilus 의 CGTase 유전자를 cloning한 pCGTS [18]을 사용하였다. 효모 S.
- 6R canl GAL7)를 사용하였다[2]. 또한 plasmid 구축 및 증폭을 위한 E. coli 숙주세포는 DH%를 사용하였다. CGTase 유전자 공여 plasmid는 B.
- 본 연구에 사용된 목적단백질의 표면 발현을 위한 운반체 단백질로서 효모세포벽에 N말단이 공유결합된 형태로 존재하는 a-agglutinin을 사용하였다. 이 단백질은 Agal과 Aga2의 소단위체(subunit)로 구성되어 있으며 Agal 단백질이 P -glucan 결합으로 세포벽에 고정되고 Aga2 (69개 amino acid)는 목적 유전자(CGTase 유전자)와 융합 발현되어 Agal과 disulfide 결합을 하고 있다[4].
- 본 연구에 사용한 재조합 CGTase 발현용 S. cerevisiae 균주는 모두 uracil 영양요구성 변이주이며 haploid로 S. cerevisiae EBY100(A4ATa ura3-52 trpl Ieu2-Al his3A200 pep4::HIS3 prbl A1.6R canl GAL7)를 사용하였다[2]. 또한 plasmid 구축 및 증폭을 위한 E.
- 생성물은 methanol/sulfuric acid (95:5)로 110℃에서 10분간 가열하여 발색시켰다. 표준물질은 시판되고 있는 a-CD (Sigma Co.)를 10 mM의 농도로 사용하였다.
- stearothermophilus 의 CGTase 유전자를 cloning한 pCGTS [18]을 사용하였다. 효모 S. cerevi- siae에서 CGTase 표면발현 vector는 유도성 발현vector로써 GALI promoter를 가진 pYDl (Invitrogen Co., USA)를 사용하였다. 이 vector는 형질전환효소의 선택표지로 TRP1 (pho- sphoribosyl-anthranilate synthesis) 유전자를 가지며, 2 Jim replication origin을 이용하여 복제한다.
이론/모형
- 균체 침전물과 배양 상등액을 사용하여 각 분획에서의 CGTase 활성을 측정하였다. CGTase의 활성은 Fujiwara 등[5]에 의해 제안된 methyl orange 법으로 측정하였다. 효소 반응은 1.
- coli-S, cerevisiae shuttle vector인 pYDl (각각 EcoRI/XhoI으로 미리 절단)에 재조합하여 재조합 plasmid pYDCGTS을 구축하였다. 구축된 재조합 plasmid는 E. coli DH5ci로부터 증폭, 추출하여 LiCl 법[7]으로 효모 숙주세포 S. cerevisiae EBY100에 형질전환하였다.
성능/효과
- stearothermophilus 유래의 CGTase 유전자(cgtS)를 보유하고 있는 재조합 plasmid pCGTS (4.8 kb)을 효모 표면 발현용 vector*?1 pYDl (GALI promoter)에 subcloning 하였다, 구축된 재조합 plasmid, pYDCGT (7.2 kb)는 S. cerevisiae EBY100에 형질전환하였고, tryptophan이 결여된 SD 배지에서 1차 선별된 형질전환체들을 YPGS 배지에서 배양 후 활성 염색을 통하여 CD가 생성됨을 확인하였다. 배양시간과 효소 반응시간에 따른 반응 산물을 TLC로 분석한 결과, 배양 12시간째부터 효소활성이 나타났고, 반응 10분 이후부터 CD가 생성되어 시간이 지남에 따라 CD 생성양이 증가하는 것을 확인하였다.
- 2 B), 배양 상등액으로 분비 발현되는 CGTase 보다는 세포벽에 효소가 부착되어 분비 발현되는 표면발현 CGTase 활성이 낮아 보였으나 둘 다 CD는 효과적으로 생성하였다. 1% soluble starch와 CGTase 표면 발현 효모 세포를 반응시켜 생성물을 현미경으로 관찰한 결과, 시판 a -CD와 비슷한 육각형 결정 모양을 볼 수 있었다(Fig. 3). 또한 재조합 균주 S.
- 0이 였다(data not shown). 결론적으로 배양 온도가 낮은 데서 활성이 높게 나오는 것은 배양 온도가 높을 때는 endoplasmic reticulum (ER)에서의 정체와 단백질 접힘 효과가 떨어지기 때문으로 사료된다[3] 또한, 정지기 이후 배양 36시간 이후부터 효소 활성이 급격히 감소하였다. 이는 정지기 이후 효모의 세포 용해에 의해 표면 발 현된 효소가 함께 실활되는 것으로 사료된다.
- 그 연구 결과에 따르면 episomal 발현에 의한 CGTase는 d-CD, glucose, maltose 분히| 시 intermolecular transglycosy- lation에 의해 maltooligosaccharide 농도는 증가하고, 부수적으로 ci-CD는 감소하는 반면, 표면발현에 의한 CGTase는 반응 49시간까지 coupling, disproportionation에 의해 저농도 의 maltooligosaccharide로 분해되다가 감소되어져 n-CD만 남게 된다. 결론적으로 보다 순도가 높은 d-CD를 생산할 수 있는 것과 그에 따른 안정성이 높은 것으로 나타났다. 이는 목적 단백질이 효모 세포표면의 이ucan 구조와 공유결합에 의하여 결합되어 있어 반응 중 추출되지 않아 life timeo] 길어지기 때문이다.
- cerevisiae EBYlOO/pYDCGTS를 YPDG 배지에서 플라스크 배양하여 균체 증식과 CGTase 발현량을 조사하였다. 그 결과 Fig. 4와 같이 glucose가 완전히 소모되는 12시간부터 CGTase의 활성이 증가하기 시작하여 배양 30시간째 최대 활성인 6.5 unit/1 로 나타났으며, 정지기 이후 42시간 이후에는 효소활성이 감소하였다. 반면 B.
- macerans CGTase를 표면발현시켰고, 기질인 soluble starch와 CGTase가 표면 발 현된 형질전환체를 60시간이상 반응하여『CD를 생산하였다. 그 연구 결과에 따르면 episomal 발현에 의한 CGTase는 d-CD, glucose, maltose 분히| 시 intermolecular transglycosy- lation에 의해 maltooligosaccharide 농도는 증가하고, 부수적으로 ci-CD는 감소하는 반면, 표면발현에 의한 CGTase는 반응 49시간까지 coupling, disproportionation에 의해 저농도 의 maltooligosaccharide로 분해되다가 감소되어져 n-CD만 남게 된다. 결론적으로 보다 순도가 높은 d-CD를 생산할 수 있는 것과 그에 따른 안정성이 높은 것으로 나타났다.
- 첫 째, 효모는 다른 미생물에 비하여 외래단백질의 분비기구가 잘 발달하여 있으므로 표면발현의 전제조건인 목표단백질의 분비가 용이하다. 둘째, 효모는 다른 미생물에 비하여 세포벽이 매우 단단하며 표면에 부착되는 단백질들이 세포표면의 이ucan 구조와 공유결합에 의하여 결합되므로 반응 중 추출 되지 않는 장점을 있어 산업적 응용에 있어서 life-time이 길다. 셋째, 표면발현 시 단백질의 표면밀도 측면에서도 효모의 agglutinin 경우 효모 세포 1개당 104 분자수로써 원핵세포 시스템에 비하여 매우 높다.
- 2 A와 같이 대조구인 EBY100, EBYlOO/pYDlfe starch 함유 YPGS 고체 배지상에서 starch 분해 활성환을 형성하지 않았고, 형질전환체 EBY100/ pYDCGTS는 starch 분해 환을 형성하여 CGTase 활성을 나타내었다. 따라서 형질전환체 EBYlOO/pYDCGTS는 cgfS를 잘 발현함을 알 수 있었다.
- 이들은 세포벽과의 결합력이 약하거나 세포의 표면과의 거리가 먼 위치에 존재하기 때문에 이들을 매개로 하여 외래 단백질을 표면발현하였을 때 결합력이 약하거나 외래단백질이 충분히 표면에 노출되지 못하며 세포벽으로 흡수되지 못하는 기질과의 접촉할 수 없는 단점이 있다[16]. 따라서, 일반적인 episomal 발현에 비해 상대적으로 효소 활 성이 낮은 것으로 사료되었다. 또한, WasWda 등[1기의 연구 결과에서 따르면, Rhizopus orygae lipase를 a-agolutinin의 C 말단 하류에 유전적으로 융합하여 표면 발현시켰을 때와 a -agglutinin과 lipase 사이에 linker peptides를 삽입하여 표면 발현시켰을 때의 기질 친화성이 linker peptides의 수가 늘어감에 따라 증가하였다.
- cerevisiae EBY100에 형질전환하였고, tryptophan이 결여된 SD 배지에서 1차 선별된 형질전환체들을 YPGS 배지에서 배양 후 활성 염색을 통하여 CD가 생성됨을 확인하였다. 배양시간과 효소 반응시간에 따른 반응 산물을 TLC로 분석한 결과, 배양 12시간째부터 효소활성이 나타났고, 반응 10분 이후부터 CD가 생성되어 시간이 지남에 따라 CD 생성양이 증가하는 것을 확인하였다. 회분 배양한 결과 25℃와 30℃에서 CGTase의 최대 활성이 각각 21.
- 둘째, 효모는 다른 미생물에 비하여 세포벽이 매우 단단하며 표면에 부착되는 단백질들이 세포표면의 이ucan 구조와 공유결합에 의하여 결합되므로 반응 중 추출 되지 않는 장점을 있어 산업적 응용에 있어서 life-time이 길다. 셋째, 표면발현 시 단백질의 표면밀도 측면에서도 효모의 agglutinin 경우 효모 세포 1개당 104 분자수로써 원핵세포 시스템에 비하여 매우 높다.
- 재조합 균주 S. cerevisiae EBY100/pYDCGTS의 최적 배양 조건을 알아보기 위해 YPDG배지, pH4.0~10.0z 25℃와 30℃에서 회분 배양하면서 균체증식과 CGTase 발현량을 조사한 결과, Fig. 5와 같이 glucose가 완전히 소모되고, galactose에 의해 유도, 발현되는 12시간부터 CGTase의 활성이 증가하기 시작하여 배양 36시간째 최대 활성에 도달하였다. 최대 활성은 201 배 양 시 21.
- 뿐만 아니라 효모는 진핵세포로서 고등생물과 유사한 유전자 구조 및 당쇄부과이ycosy- lation)을 포함하는 번역 후 단백질 수식(post-transiational modification) 과정을 가지기 때문에 고등세포 유래의 단백 질을 활성상태로 발현할 수 있다[11] 유용 효소유전자의 표 면발현의 측면에서 효모는 다음과 같은 장점을 제공한다. 첫 째, 효모는 다른 미생물에 비하여 외래단백질의 분비기구가 잘 발달하여 있으므로 표면발현의 전제조건인 목표단백질의 분비가 용이하다. 둘째, 효모는 다른 미생물에 비하여 세포벽이 매우 단단하며 표면에 부착되는 단백질들이 세포표면의 이ucan 구조와 공유결합에 의하여 결합되므로 반응 중 추출 되지 않는 장점을 있어 산업적 응용에 있어서 life-time이 길다.
- 5와 같이 glucose가 완전히 소모되고, galactose에 의해 유도, 발현되는 12시간부터 CGTase의 활성이 증가하기 시작하여 배양 36시간째 최대 활성에 도달하였다. 최대 활성은 201 배 양 시 21.3 unit/L 30 ℃ 배 양 시 16.5 unit/1 로 나타났으며, 효소의 비활성 및 plasmid 안정성은 Table 1에서와 같이 25℃ 배양 시 1.7 unit/g-DCW와 86%로 30℃ 배양 때보다 높게 나타났다. 최적 pH는 B.
- 활성 염색 결과(Fig. 2 B), 배양 상등액으로 분비 발현되는 CGTase 보다는 세포벽에 효소가 부착되어 분비 발현되는 표면발현 CGTase 활성이 낮아 보였으나 둘 다 CD는 효과적으로 생성하였다. 1% soluble starch와 CGTase 표면 발현 효모 세포를 반응시켜 생성물을 현미경으로 관찰한 결과, 시판 a -CD와 비슷한 육각형 결정 모양을 볼 수 있었다(Fig.
- 배양시간과 효소 반응시간에 따른 반응 산물을 TLC로 분석한 결과, 배양 12시간째부터 효소활성이 나타났고, 반응 10분 이후부터 CD가 생성되어 시간이 지남에 따라 CD 생성양이 증가하는 것을 확인하였다. 회분 배양한 결과 25℃와 30℃에서 CGTase의 최대 활성이 각각 21.3 unit/1 와 16.5 unit/1 로 나타났고, plasmid 안정성은 각각 86%와 82%로 나타나 배양온도에 상관없이 plasmid는 비교적 안정하게 유지되었다.
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