[논문]캡슐 고정화 전세포 CGTase를 이용한 Glucosyl-xylitol 생산

박중곤; 박형우; 이용현

문제 정의

川acesg의 랩슐 고정회. 배양이 어립기때문에 B. 川如"血$가 생산한 CGTase를 흡착제에 흡착시키고 이를 캡슐에 고정화하고자 하였다. 횔-성탄, Amberite IRA 900, DEAE-Sephadex를 이욕하이 효소의 흡착을 시도하였다 0.
B. macerans 균주를 캡슐내에 접종하여 베양하기 어려우므료, 캡슐 고정화 전세포 효소쁠 제圣하기 위하여 베양액에서 이미 배양된 미생물을 원심분리하여 캡슡내부에 고정화하고자 하였다. 고농도로.
Xylit이을 담수용채로하여 당알콜 올리고당 gliicaSyl-xylitol4 셍산하기 위하이 캡슐고정화 전세포 CGTase를 제조하고자 하였다. CGTase를 생산하기 위하여 Bacillus 地acmms를 배양하는 겅우 organic form의 질소원을 사용하는 경우가 inorganic form의 질소원을 사용히는 경우보다 더 많은 CGTase를 생산하였고 배양도 줌 탄소원인 sfarch가 분해되는 동안 CGTase가 생성되었다.
지 않고 시용할 수 있어 생산원가를 줄일 수 있다는 장점이 있다. 群만 아니라 캡슐내무에 전 세포 효소를 고정화하는 경우 보통의 고징화 방빔에서와는 달리 고정화 전세포효소의 최고 반응속도 矶, 이 지유세포의 값을 유지한다는 장점이 있다(16) 본 연구에서는 CGTase를 생신하는 Bacillus tuaceraus IFO 3490의 비양 뜩성 및 배지 성분에 띠른효소 활성 특성을 조사하였다' 또한 미생물로부터 효소를 분리 정제하는 과정을 생략하고 전세포효소를 고정화하는 인구는 많이 이루어지고 있지만 미생물로부터 생산되는 효소가 세포외 효소인 경우의 효과적인 전세포효소 고정화 방법은 거의 알려져있지 않*로, 상당 부분이 세포외 효소로 존재하는 CGTase를전세포효소 형태로 캐슐 내부에 고정화하여 dcxhin읖 당공여체로 하고 xylitol을 당수용체로 하여 glucosyl-xylitol을 생산할 수 있는 방법을 조사하고자 하였다
베양액중의 미생물이나 CGTase를 흡착시켜 캡슐내부에 고정화하이 당전이 반음을 수행하려는 시도가 쉽게 이루어질 수 잆있으므로 cell이 포함되어 있는 배양액을 농축하여 캡슐 내부에 가둠으로써 캡슐고정화 진세포를 제초하고자 하였다. 이러한 방빔은 가장 간펀한 방법이기도 하지만 농축 베양액을 이욤한 전 세포 효소의 고정화에 대한 보고는 알려져 있기 않다.

제안 방법

캡슐 고칭화 전세포 효소를 얻기 위하여 보고된 바(7-11, 16) 와같이 B. 他就"聞s가 core에 접종된 캡슐읖 늬]지 내에서 배양하였다 배양 베지는 medium 2를 사용하였고 캡슐 제조 방비에 마라 미생물 접종 캡슐읖 제소하이 100 inL의 배지에 400-500 개씩 넣은 다음, 37己와 200 ipm의 조건으로 shaking incubator 에서 내양하였다. 그러나 E.
CGTase를 생산하기 위하여 Bacillus 地acmms를 배양하는 겅우 organic form의 질소원을 사용하는 경우가 inorganic form의 질소원을 사용히는 경우보다 더 많은 CGTase를 생산하였고 배양도 줌 탄소원인 sfarch가 분해되는 동안 CGTase가 생성되었다. B.
따라서 미생물의 배양과정 중 CGTase 활성도 및 생산된 CGTase의 존재 위치를 조사할 펄요가 있다. CGTase의 생성랑을측정하는 간접적 방법으로서 CGTase의 4가지 반응기능 중에 staich를 분해하여 8-cyclodextrin( 8-CD)을 형성하는 cyclization 반응에대한 효소활성을 측정하였다. 즉 실험 방법에서 기숨한비와 같이 미생물을 배양한 broth solution을 starch나 dextrin 용액에 투입하고 /3-CD의 생성량을 측정하였다.
Cyclodextrin glucanotraiNerase(CGTase) 는 Bacillus maeerans 균주의 배양중에 생성되므로 내지의 조성이 미생물의 싱상과 CGTase의 생산에 미치는 영향을 고찰하였다. 미생물의 배앙은 500 mL의 flask에 배지 100 mL을 투입하고 10%(v/v) 저증을 하고 37V.
고농도로. 고정회하기 위하여 배양액 I L(100 mL, 10 batch)를원심분리하여 50 mL의 1.6(w/v)% CaCl2 욤액에 넣고 显반하여잘 섞은 디음, 미리 준비한 sodium alginate 0, 6(w/v)% 용액에 방울로 쩔1어뜨려 capsule을 제조하였다. 이때 cc日의 양이 많아 캡슐이 완전 구형을 유지하기 어렵지만 sodium alginale 용액에 첨가하는 non-iordc surfactant, n이loxynol의 능도를 0.
USA)몰 이묨하였으며, 당곰여체로는 시줌에 판매되는 dextrin(신동방 dex 150)을 구입하여 사용하였다. 당 전이 만믐의 측정은 반응 전후의 당수g■체(xylitol)의 놈도를 high performance liquid chromatogiaphy(HPLC Model-305, Gilson Medical Electronics, Inc, France)를 시용하여 측정함으로써 이루어졌다. Cosmos" 5NF" packed colunm(NacaIai Tesque, Inc.
이 경우 이 균주가 생산하는 효소는 균치】내 효소가 50 血"L이고 균체외 효소는 30 两叫이었다(18). 따라서 Bacillus macerans 균주가 생산하는 CGTase의 세포 내 효소와 제 포 외 효소의 역기비를 조사하기 위히, 여 자유 베양한 베양액을원심분리한 다음, 침전된 cell믈 같믄 양의 즈芹수로 희석하고 초음파 처리기(Branson Model 8210)에서 20분간 초음파 처리하이 8-3 합성 활성 측정법으로 측정하였다. Medium 1과 medium 2에서 3일간 배양한 배망액에 대하여 조사한 결과를 Table 2에 나타내었다.
c站를 고정화 베양하여 캡슐박을 톰한 산소전달계수 虹站를 78% 증가시킬 수 있었다(出). 따라서 본 연구에서도 산소전달 항상을 목적으로 해바라기기름을 2(v/v)% 첨까한 캐슐을 제至하여 LBS(2% starch), LBG(2% glucose): LBD(dextrin 2, 5%), LB 베지를 사용하여 비〕앙하였으나 미생물을 고농도로 고정화 베양할 수 없었다. 산소전달 향상을 위한 또 다튼 방법으로 airlift leactor 니에서 B macerans를 접종한 캡슐을 베양하였디■.
R- CD 합성 활성 측정을 위한 반음용액은 5 mL의 Tris-Malate- NaOH buffer(pH 60)에 5% dextrin고} soluble sfaich를 녹인 용액 5 mL를 섞어서 각각 준비하였다. 또한 cell을 고정화할 때 staich 7.5(w/v)%, yeast extracl, tiyplojje J 25{w/v)%를 항께 고정화 한 경우에 대해서 당선이 반음에 디〕헤서도 조사하였다. 위 실 힘에서 캡슐에 고정화된 미생물은 /S-CD 합성 활성 및 당 전이 활성읖 나타내지 많았다.
막을 통한 slarch의 확산이 접종된 B. 网湛e也藍의 성장에 저해요인이 되는 가를 검토하기 위하여 medium l(LBSs LB + starch)의 s〔arch(2G 이L) 대신 glucose(2Q 이L)를 사용한 LBG(LB + glucose)와 dcxtrin(20 아L)올 사용한 LBD(LB + dextrin) 배지블 이용하여 접종한 캡슐의 배양을 종전과 돔일한 방밥으로 수행하였다. 뽄 실험에 사용한 시중에서 판매되는 dextrin의 그■기분 표는 Table 3에 나티낸 바와 같다 모든 경우에 대하여 캡슐 내부에 접종된 미생물이 어느 정도 자라먼 모두 캡슐로부터 배양액으로 새어 나와서 자라며 캡슐 내부에 미생물을 축적할 수 없었다 또、액화 전분을 사용한 경우와 LB 배지만을 사용한 경우에 대해서도 캡슐 고정화 비양을 시도하였다.
먼저 성장배지를 autoclave(JISTCO)에서 멸균한 후, laminar How chambei에서 100 mL의 베지에 10(v/v)%의 균주를 접종하였다. 二丄 후 shaking meubatet에서 371, 150 rpm의 조건으로 성장시킨 다음 배지 10 mL를 취한 후 3500 叩m으로 15분간 원심 분리하어 간주를 분리한다.
성탄을 시용하였다. 배양田 은 Tris-Maleic-NaOH buffer(pH 7 0. 20 mM)를 이용하어 pH를 맞추고 0.2(w/vi% succinic anhydride를 이용하이 이에서 30분간 CGTase를 succinylation시힌 디음 베앙액에 흡착제를 첨가하여 40에서 12시간 동안 효소의 흡착믈 시도하였다. 베양맥 중의 효소 흡착량을 알아보기 위하여 흡착 전과 흐의 비양액으로 J3- CD 합성활성으로 측정히였다.
2(w/vi% succinic anhydride를 이용하이 이에서 30분간 CGTase를 succinylation시힌 디음 베앙액에 흡착제를 첨가하여 40에서 12시간 동안 효소의 흡착믈 시도하였다. 베양맥 중의 효소 흡착량을 알아보기 위하여 흡착 전과 흐의 비양액으로 J3- CD 합성활성으로 측정히였다. Amberite IRA 900, DEAE- Sephadex를 이용한 흡착도 활성탄과 동일한 activation 과정을 거치 실시하뗬다.
网湛e也藍의 성장에 저해요인이 되는 가를 검토하기 위하여 medium l(LBSs LB + starch)의 s〔arch(2G 이L) 대신 glucose(2Q 이L)를 사용한 LBG(LB + glucose)와 dcxtrin(20 아L)올 사용한 LBD(LB + dextrin) 배지블 이용하여 접종한 캡슐의 배양을 종전과 돔일한 방밥으로 수행하였다. 뽄 실험에 사용한 시중에서 판매되는 dextrin의 그■기분 표는 Table 3에 나티낸 바와 같다 모든 경우에 대하여 캡슐 내부에 접종된 미생물이 어느 정도 자라먼 모두 캡슐로부터 배양액으로 새어 나와서 자라며 캡슐 내부에 미생물을 축적할 수 없었다 또、액화 전분을 사용한 경우와 LB 배지만을 사용한 경우에 대해서도 캡슐 고정화 비양을 시도하였다. 액화 전분의 孕 비는 soluble starch를 멸이] 안정한 amylase(Theraniyl, Novo)를이용하여 100 iiiL의 즘류수에 soluble s囱ch를 50 g씩 넣은 다음 amylase# 12.
뽄 실험에 사용한 시중에서 판매되는 dextrin의 그■기분 표는 Table 3에 나티낸 바와 같다 모든 경우에 대하여 캡슐 내부에 접종된 미생물이 어느 정도 자라먼 모두 캡슐로부터 배양액으로 새어 나와서 자라며 캡슐 내부에 미생물을 축적할 수 없었다 또、액화 전분을 사용한 경우와 LB 배지만을 사용한 경우에 대해서도 캡슐 고정화 비양을 시도하였다. 액화 전분의 孕 비는 soluble starch를 멸이] 안정한 amylase(Theraniyl, Novo)를이용하여 100 iiiL의 즘류수에 soluble s囱ch를 50 g씩 넣은 다음 amylase# 12.5, 25, 50 jiL 첨가하고, polato starch에는 25 #L 첨가한 다음, 에서 15분간 가열하여 액화 처리하였디..
CGTase의 생성랑을측정하는 간접적 방법으로서 CGTase의 4가지 반응기능 중에 staich를 분해하여 8-cyclodextrin( 8-CD)을 형성하는 cyclization 반응에대한 효소활성을 측정하였다. 즉 실험 방법에서 기숨한비와 같이 미생물을 배양한 broth solution을 starch나 dextrin 용액에 투입하고 /3-CD의 생성량을 측정하였다. 각각의 pH로 조정한 medium 1에서 배양한 경우에 배양액중의 CGTase가 생성한 8-CD 의 양을 Figure 4에 나타내었다 배양 1일째에도 효소의 횔.
캡슐 고정화 선세포효소를 당전이 반응에 사용하기 위하여 5 mL의 농축 배양액으로 제조한 캡슐 전체를 50f 로 이]열된 100 mL의 당신이 반음용액에 루입하였다. 캡슐 고정화 전세포 효소를 사묨하는 경무 캡슐막을 통한 확산과정이 고려되어야 하므로 반음시간을 충분히 하고자 캡슐읖 투입하고 12시긴-이 겸과한 후 sample을 취하였으며' 효소 반응은 shaking incubator에서 50V, 150 rpm의 조건으로 수행하였다 Samplee 여과를 거친 후 HPLC를 이용하여 측정하였으며 Figure 6에 그 결과가 나다나 있다. 당전이 반응이 진행되었으며 반응 전의 peak와 반응이 以시간 진행된 후의 peak 변화에서 glucosyl-xyhtol의 생성을 뚜릿이 관찰핲 수 있디〔 반응전에는 지극히 미량의 GL(glucosyl unit 1: glucose)이 존재하였지만 반응이 진행된 후 G1의 망이 증가하여 뚜렷한 peak를 형성하고 있으며 glucosyl-xylitol(Gn-X, Gn: 이ucosyl unit, X: xylitol)은 Gl-X, G2-X, G3-X가 확인되었다.
캡슐 고정화를 위하여 농축액음 같은 부피의 CaCL(3.2(w/v)%) 와 xanthan gum (0 52(w/v)%)의 혼합 용액에 녹인 다음 진술된 바의 캑술 고정회 방법에 따라 베양농축맥을 이용한 전세포효소고겅회 capsule을 제조하였다. Tris-malaie-NaOH buffer(pH 6.
먼거 베양액을 WOO mL 용기에 500 mL 담고. 항온수조의 온도를 4此로 맞춘 디음 진곰을 걸고 분당 100회 정도의 속도로 회전하먼서 농축하였다. 초기에 많이 생기는 거품을 제거하기 위하이 실리콘소포게(Dow Coining, DB-llOa)를 0」mL 넣어주었다.

대상 데이터

본 연〒에 사용된 당수용체는 당알코올인 xy!itol(MW 152.1, Sigma Chemical Co.. USA)몰 이묨하였으며, 당곰여체로는 시줌에 판매되는 dextrin(신동방 dex 150)을 구입하여 사용하였다. 당 전이 만믐의 측정은 반응 전후의 당수g■체(xylitol)의 놈도를 high performance liquid chromatogiaphy(HPLC Model-305, Gilson Medical Electronics, Inc, France)를 시용하여 측정함으로써 이루어졌다.
. 띠라서 Table 1에 나타낸 바와 깉이 starch와 무기염늘로 구성된 medium 1괴 organic form의 질소원을 함유하는 LB베지에 s血ch가 첨가된 medium 2를 내지로 선정하였다. Medium 1과 medium 2를 사용하여 B.
Bacillus macerans (IFO 3490)를 사용하있다. 사용한 베지는 액체 베잉배지 2종류와 고형베지 1가지를 사욤하였으며 배지의 성분은 Table 1에 나타낸 바와 깉-으며 유기질소원을 사용한 것과 무기질소원을 사용한 것이 큰 차이점이다. 균주는 2주에 1 회 이상의 게대 배양몰 실시하였으며, agai medium에 접증하이 1일간 배양한 뒤 罕2에서 냉장 고관하였다.

이론/모형

Calciiun-alginate capsule의 제조방법은 Cheong의 방범(7)을 시- 용하였다. 먼저 성장배지를 autoclave(JISTCO)에서 멸균한 후, laminar How chambei에서 100 mL의 베지에 10(v/v)%의 균주를 접종하였다.

성능/효과

CGTase를 생산하기 위하여 Bacillus 地acmms를 배양하는 겅우 organic form의 질소원을 사용하는 경우가 inorganic form의 질소원을 사용히는 경우보다 더 많은 CGTase를 생산하였고 배양도 줌 탄소원인 sfarch가 분해되는 동안 CGTase가 생성되었다. B. Diacerans0^ 의하이 생산되는 CGTase는 80% 이상이 extracel- luhit enzyme이며 intracellular enzymee 20% 이내이었다. E.
배양백 중에 남아 있는 CGTase의 /3-CD 합성 활성을 흡착 실시 전후에 각각 측정하여 Table 4에 나타내었다. 二L 결괴를 보먼, 효소의 succiuylation 과정 중 활성 저하는 거의잆는 것으로 보이며 흡착제에 의한 효소의 선택적 흡착도 거의 이루어지지 않았다. 다만 Amberue IRA 900의 경우에만 20% 정도의 CGTase가 흡착되는 것으로 나타났다.
g血zawnc必1(15)의 졍우에는 낮은 yeast extract 농도에서도 홰바라기기름을 이용하여 산소전달을 향상시켜 약 45 g/L 정도까지 내부 건조중링辎 엍읖 수 있었다. 또한 물보다 산소와의 결합력이 우수한 해바라기기름을 사욤히여 E. c站를 고정화 베양하여 캡슐박을 톰한 산소전달계수 虹站를 78% 증가시킬 수 있었다(出). 따라서 본 연구에서도 산소전달 항상을 목적으로 해바라기기름을 2(v/v)% 첨까한 캐슐을 제至하여 LBS(2% starch), LBG(2% glucose): LBD(dextrin 2, 5%), LB 베지를 사용하여 비〕앙하였으나 미생물을 고농도로 고정화 베양할 수 없었다.
다. 본 연구실에시의 앞선 연구에서 E. c湖(10)나 S. cerevis旗(7)의 경우、이 두 미생믈은 facuUative 미생물로서 호기성 조건이나 혐기성 조건 모두에서 성장할 수 있는 능력을 가지고 있어 산소가 부족한 환경에서도 직응하여 자랄 수 있기 때문에 내무 건조중량이 100 - 300 g/L에까지 이블수 以었고, C. g血zawnc必1(15)의 졍우에는 낮은 yeast extract 농도에서도 홰바라기기름을 이용하여 산소전달을 향상시켜 약 45 g/L 정도까지 내부 건조중링辎 엍읖 수 있었다. 또한 물보다 산소와의 결합력이 우수한 해바라기기름을 사욤히여 E.
각각의 pH로 조정한 medium 1에서 배양한 경우에 배양액중의 CGTase가 생성한 8-CD 의 양을 Figure 4에 나타내었다 배양 1일째에도 효소의 횔.성이 측정 기능하기는 하였으나 2일째가 되어야 뚜렷하게 나타나며 배양 3일께의 효소활성은 배양 2일째보다 약간 증가하였다. 이는 Figiuc 3에서 비양 2~3일 동안 미생물의 성장은 없지만 starch가 꾸준히 감소하는 결과를 감안하면 starch가 감소되는 동안 CGTase도 합성이 계속되고 있다고 추론 가늠하다.
6% 전환된 것을 알 수 있었다. 이로써 배앙농축액을 이용한 캡슐고정화 전세포 CGTase가 hydrolysis와 coupling, dispropai tion 등의 htcnnoleculai- tiansglycosylation 반응을 원활히 수행함을 확인할 수 있었다. 추후 반응액의 농도나 반응시간의 변화, 햅슐고정화 전세포효소의 재사용 및 캡슐막을 통한 물질전달 저항의 영향 등이 연구되어아 할 필요가 있으며 현지 본 연구실에서 계속 연구가 되고 있다.
gc海■游이 CGTase를 생산하는 양이 크게 차이가 나는 것을 알 수 있다. 즉 pH 5의 배지에서 배양된 경우 占-CD 합성 활성이 측정되지 않았으며 pH 6-7의 경우에 최대 활성을 보였으며 배지의 pH가 더 이상 증가할수록 呂-CD 합성 활성이 감소하였다. Medium 2에서 배양되는 경우 생성되는 CGTase의 /3-CD 셍산능믄 Figure 5에 나티내있으며 이는 medium.

후속연구

이로써 배앙농축액을 이용한 캡슐고정화 전세포 CGTase가 hydrolysis와 coupling, dispropai tion 등의 htcnnoleculai- tiansglycosylation 반응을 원활히 수행함을 확인할 수 있었다. 추후 반응액의 농도나 반응시간의 변화, 햅슐고정화 전세포효소의 재사용 및 캡슐막을 통한 물질전달 저항의 영향 등이 연구되어아 할 필요가 있으며 현지 본 연구실에서 계속 연구가 되고 있다.

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