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문제 정의
- 확립하였다. 본 연구에서 확립한 ELISA system이 혈청 내 VTG 정량에 사용 가능한지 그 타당성을 조사하였다.
- 본 연구에서는 낙동강, 시화호 등 공업단지를 낀 연안해역에 널리 서식하는 망둑어류에 대하여 환경성 화학물질들에 대한 생식 내분비계에 대한 영향을 조사하기 위하여, 우리나라 연안에 정착하여 서식하는 꾹저구(Chaenogobius)에 대한 VTG 정량법을 개발하고 이를 이용하여이들 해역에 서식하는 풀망둑 (Acanthogobius hasta)과 문절망둑(Acanthogobius flavimanus)의 VTG에 대해서도 정 량할수 있는지를 조사하였다.
제안 방법
- 7일 전에 500 juL pristane을 주사한 2마리 Balb/C mice에 5×106 hybridoma cell을 수확하여 0.5ml PBS에 현탁하여각각 복강 내 주사하였다. 복강 주사 후 7〜15일 뒤 복수가 최대로 생성되면 경추 탈골시킨 후 복부로부터 복수를 채취하였다.
- ELISA용 plate의 well내에 혈청 단백질들을 흡착시킬 때와 항원 항체 반응이 일어날 때 시료의 혈청 중에 존재하는 항원 이외의 단백질이나 지방 성분 등에 의한 영향을 파악하고, 혈중 VTG 농도를 정량할 때 적당한 혈청의 희석 범위를 조사하기 위하여 수컷 혈청 농도가 0%, 0.0001%, 0.001%가 되도록 3가지의 0.1M sodium carbonate buffer# 만들었으며, 이들 각각의 완충액을 사용하여 VTG standard를 만들었다. VTG stamdard는 8단계로 나누고 1에서 8까지 standard 농도를 각각 l, OOOng/mL, 500ng/mL, 250ng/mL, 125ng/mL, 62.
- 1M sodium carbonate buffer# 만들었으며, 이들 각각의 완충액을 사용하여 VTG standard를 만들었다. VTG stamdard는 8단계로 나누고 1에서 8까지 standard 농도를 각각 l, OOOng/mL, 500ng/mL, 250ng/mL, 125ng/mL, 62.5ng/mL, 31.3ng/mL, 15.6ng/mL, 7.9ng/mL로 제작하였다. 이들 각 3종류의 표준곡선을 비교하여 Fig.
- 난황단백질을 분리하기 위하여 성숙한 난소 1g을 0.15MNaCl이 첨가된 TBS(0.02M Tris-HCl pH 8.0, 0.1% NaN3, 0.01% EDTA, ImM PMSF) buffer를 첨가하여 homoge- nizer로 마쇄 한 후 원심분리(10, 000rpm, 30min, 4℃)하여 상층액을 취하였다. 이 상층액에 70%가 되도록 ammoniumsulfhte를 넣고 4℃에서 완전히 녹인 후 12, 000rpm에 30분간 4℃에서 원심분리하였다.
- 단클론 항체 (Monoclonal antibodies, Mabs)는 Harlow &Lane(1988) 방법을 변형하여 제작하였다. 분리된 꾹저구 난황단백질을 mice에 주사하여 면역시킨 mice의 비장세포를분리한 후 myeloma cell(sp2/0-Agl4)과 약 7:1의 비율로 polyethylene glycol 1500(Boehringer Mannheim, germany,75mM Hepes 50% PEG w/v)을 이용하여 융합시 켰다.
- 유무를 확인해야 한다. 따라서 먼저 수컷 혈청을 0배 1, 000배, 10, 000배의 희석 농도가 되도록 standard에 첨가 후 본 system으로 측정하여 표준곡선을 비교하여 결정하였고, 수컷 혈청과 E2 처리된 수컷 혈청을 결정된 희석 농도로 희석하여 본 assay로 측정하여 확인하였다.
- 마지막 주사 후 면역 확인을 위해 mice 혈액으로 immno- blotting하였고, 면역 확인 후 hybridoma cell 제작 3일 전에 50㎍ VTG로 booster하였다.
- 주사하여 면역시킨 후, 일주일 간격으로 분리된 꾹저구난황단백질을 Freunds incomplete adjuvant와 섞어 피하에 2회 주사하였다. 마지막 주사 후 면역 확인을 위해 토끼 혈액으로 immmoblotting하였고, 전채혈 3일 전에 분리된 난황단백질로 booster하였다.
- 5ml PBS에 현탁하여각각 복강 내 주사하였다. 복강 주사 후 7〜15일 뒤 복수가 최대로 생성되면 경추 탈골시킨 후 복부로부터 복수를 채취하였다. 채취된 복수는 원심분리(3, 000g, 30min, 4℃)한 후상층을 취한 후 포화 ammonium sulfhte와 1:1의 비율로 첨가하여 4C에서 12시간 정치시켜 IgG를 침전하였다.
- 본 ELISA system에 사용하는 난황단백질에 대한 항체의 반응성과 혈청내의 VTG에 대한 특이성을 나타내는지를 확인하기 위하여 수컷 혈청을 1, 000배, 2, 000배, 4, 000배, 8, 000배, 16, 000배, 32, 000배, 64, 000배 그리고 120, 000배까지 6단계로 나누어 본 VTG에 대한 ELISA system을 적용하여 흡광도를 측정한 곡선과 VTG에 대한 표준곡선과 비교하여 Fig. 7에 나타내었다.
- 본 assay에서는 first antibody I로 단일클론 항체를, first antibody II로는 polyclonal 항체를 이용하였고 sandwichELISA 각 단계에 사용될 항체의 희석 농도를 결정하기 위하여 각 항체의 희석 농도를 달리하여 상기의 assay법에 적용하여 희석 농도에 따른 standard의 반응 정도를 확인한 뒤 최적의 희석 농도를 결정하였다.
- 본 연구에서는 VTG에 대한 단일 클론 항체를 이용하여 혈청 중에 있는 VTG를 특이적으로 반응을 유도하여 반응한 후 V1G에 대한 다클론 항체를 결합 반응시켜 반응성을 증폭시키는 민감한 정량법으로 다 클론항체만을 이용한 직접법보다특이적으로 VTG에만 반응할 수 있는 sandwich ELISA system을 확립하였다. 본 연구에서 확립한 ELISA system이 혈청 내 VTG 정량에 사용 가능한지 그 타당성을 조사하였다.
- 단클론 항체 (Monoclonal antibodies, Mabs)는 Harlow &Lane(1988) 방법을 변형하여 제작하였다. 분리된 꾹저구 난황단백질을 mice에 주사하여 면역시킨 mice의 비장세포를분리한 후 myeloma cell(sp2/0-Agl4)과 약 7:1의 비율로 polyethylene glycol 1500(Boehringer Mannheim, germany,75mM Hepes 50% PEG w/v)을 이용하여 융합시 켰다. 융합된 세포들은 RPMI-1640(RPMI 1640 Gibco Laboratories), 15% fetal bovine serum, HAT(0.
- 분리된 꾹저구 난황단백질을 동량의 Freund's complete adjuvant와 섞어 두 마리의 뉴질랜드산 화이트 토끼의 임파선에 주사하여 면역시킨 후, 일주일 간격으로 분리된 꾹저구난황단백질을 Freunds incomplete adjuvant와 섞어 피하에 2회 주사하였다. 마지막 주사 후 면역 확인을 위해 토끼 혈액으로 immmoblotting하였고, 전채혈 3일 전에 분리된 난황단백질로 booster하였다.
- 분리된 꾹저구의 VTG(약 50㎍)는 동량의 Freund's complete adjuvant와 섞어 두 마리의 Balb/C mice에 복강 내 주사하여 면역시킨 후, 일주일 간격으로 정제된 VTG(약 30㎍)와 동량의 Freund's incomplete adjuvant와 섞어 2회 주사하였다. 마지막 주사 후 면역 확인을 위해 mice 혈액으로 immno- blotting하였고, 면역 확인 후 hybridoma cell 제작 3일 전에 50㎍ VTG로 booster하였다.
- 상기한 꾹저구의 난황단백질에 대한 단클론 항체와 다클론 항체를 이용한 VTG 정 량 ELISA system이 꾹저구 이외의 망둑어류의 VTG를 정량하는데 적용이 가능한지를 파악하기 위하여 문절망둑과 풀망둑의 성숙한 암컷 혈청들을10, 000배, 20, 000배, 40, 000배, 80, 000배로 희석하여 stan- dard와 동일한 희석 비율로 만들어 본 VTG assay system에 의해 흡광도를 측정하여 표준곡선과 평행선을 검정하여 Fig. 8에 나타내었다.
- 복강 주사 후 7〜15일 뒤 복수가 최대로 생성되면 경추 탈골시킨 후 복부로부터 복수를 채취하였다. 채취된 복수는 원심분리(3, 000g, 30min, 4℃)한 후상층을 취한 후 포화 ammonium sulfhte와 1:1의 비율로 첨가하여 4C에서 12시간 정치시켜 IgG를 침전하였다. 침전된 IgG는 원심분리(3000×g, 30min, 4℃)하여, PBS에 용해하여투석한 후 항체로 사용하였다.
- 15M NaCl이 첨가된 TBS를 넣고 완전히 용해한 뒤 투석막에 넣어 4°C에서 TBS buffer로 투석시켰다. 투석된 혈청 단백질 분획은 DEAE-cellulose(직경: 약 2.6cm 높이: 6cm)를 사용한 open column으로 혈청단백질을 분리하였다. 혈청 단백질 시료는 3배의 TBS buffer로 평형시킨 뒤 colunm에 흘려주었고 linear NaCl gradient(0.
- 혈액 중에 난황단백전구체(vitellogenin, VTG)를 유도하기 위하여 일부 수컷 꾹저구에 대해서 어체중 kg당 2mg의 estradiol-17β을 에탄올에 녹여 3일 간격으로 3회 연속 주사하였다. 마지막 주사 후 3일 후에 척추 하동맥으로부터 주사기(23G)를 사용하여 전채혈한 후, 4℃, 10, 000×g에서 30분간 혈액을 원심분리하여 실험에 사용할 때까지 혈청을 -80℃에 보관하였다.
- 6cm 높이: 6cm)를 사용한 open column으로 혈청단백질을 분리하였다. 혈청 단백질 시료는 3배의 TBS buffer로 평형시킨 뒤 colunm에 흘려주었고 linear NaCl gradient(0.0~0.5M)로 분리 하여 280nm에서 홉광도를 측정하였다. 분리된 난황단백질 분획은 SDS.
대상 데이터
- 하였다. 분자량 측정을 위한 표준단백질은 Sigma사의 high molecular weight range marker(205, 000, 116, 000, 97, 000, 84, 000 66, 000 55, 000 45, 000 36, 000 Da)를 사용하였다.
- 산란기인 5월과 6월에 걸쳐 부산의 청사포 일대의 조간대에 서식하는 꾹저구(Fig. 1)를 채집하였다. 채집된 꾹저구는 동의대학교 어류사육시설이 되어 있는 생물생산연구실로 옮겨 수용한 후 암수에 대한 혈청과 난소란을 분리하였다.
- 0001%의 수컷 혈청이 첨가된 표준곡선은 혈청이 첨가되지 않은 표준곡선보다 전체적인 흡광도는 다소 낮게 나타났지만 두 곡선은 서로 평행하고 있었다. 이러한 결과로 조사 대상 어류의혈청은 10, 000배로 희석하여 사용하여야 하며, VTG stan- dard를 제작할 때는 0.0001%의 수컷 혈청이 첨가된 0.1M sodium carbonate buffer를 사용하였다.
이론/모형
- SDS-PAGE는 Laemmli 방법에 따라 8% acryl amide gel 을 사용하였으며 단백질 염색은 Coomassie brilliant blue R-250으로 하였다. 분자량 측정을 위한 표준단백질은 Sigma사의 high molecular weight range marker(205, 000, 116, 000, 97, 000, 84, 000 66, 000 55, 000 45, 000 36, 000 Da)를 사용하였다.
- 항체의 생성을 확인하기 위하여 배양 15일 후 colony를 형성한 well 의 상층액을 대상으로 western blotting 방법에 의하여 검사하였다.
성능/효과
- 본 연구에 이용된 꾹저구의 VTG에 대한 ELISA system 은 성숙한 암컷 혈청 내에 존재하는 VTG에 대하여 특이성을 갖고 있음을 Fig. 6과 Fig. 7에서 알 수 있었다. 그리고 혈청 내의 다른 단백질이나 지방이 항원 항체 반응에 저해하는지를 조사한 실험에서도 혈청을 10, 000배 이상 희석하였을 때는 본 assay system에 저해하지 않음을 알 수 있었다.
- 18 사이의 값을 보여 항원과 항체에 대한 반응이 거의 일어나지 않았음을 알 수 있었다. 이러한 결과는 본 VTG 정량을 위한 ELISA system에 사용되고 있는 꾹저구의 난황단백질에 대한 항체들은 수컷 혈청 단백질에 대해서는 거의 반응성이 없음을 보여주었으며, 혈청내의 VTG에 대해서 높은 특이성을 보여주었다.
- 3ng/mL에서 250ng/mL까지의 범위 내에서는 standard의 표준곡선과 희석한 암컷의 혈청 시료에 대한곡선과는 서로 평행하고 있었다. 이러한 결과로 꾹저구의 난황단백 전구체를 측정하기 위한 ELISA system을 이용하여 문절망둑과 풀망둑의 난황단백전구체의 정량에도 이용이 가능하다는 것을 보여주었다.
후속연구
- Estrogen 효과를 가지는 환경성 화학물질들 각각은 estrogen hormone보다 estrogen receptor에 결합하는 힘이 매우 낮기때문에 어류에서 내분비계 장애물질의 영향에 대한 가시적인 변화는 장기간 장애물질에 노출되었을 때 나타날 수 있다. 그러나 자연생태계에 서식하는 어류에게 내분비계 장애 물질에 대한 장애 효과가 가시적으로 나타났을 때는 이미 회복이 불가능한 상태 에 이르게 되므로 조기 에 그 장애 효과를 검사할 수 있는 방법을 개발하여 그 위해성 여부를 조사해야 한다.
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