To investigate the possible mechanism of Drynariae Rhizoma extracts as a candidate of anti-cancer drug, I examined the effects of Drynariae Rhizoma extracts on the apoptosis of U937 cell line. MTT assay, flow cytometric analysis, SDS-polyacrylamide gel electrophoresis, Western blot analysis, and RT-...
To investigate the possible mechanism of Drynariae Rhizoma extracts as a candidate of anti-cancer drug, I examined the effects of Drynariae Rhizoma extracts on the apoptosis of U937 cell line. MTT assay, flow cytometric analysis, SDS-polyacrylamide gel electrophoresis, Western blot analysis, and RT-PCR were performed. Drynariae Rhizoma extracts treatment reduced the cell viablilty of U937 cells in a dose-dependent manner, which was associated with induction of apoptotic cell death. Drynariae Rhizoma extracts treatment also reduced the levels of Bcl-xL anti-apoptotic protein expression and increased the levels of caspase-3, p53, pro-apoptotic protein, in U937 cells. RT-PCR data revealed that the level of bcl-2, bcl-xL mRNA expressions decreased in a dose-dependent manner. These findings suggest that Drynariae Rhizoma extracts may have induction of apoptotic cell death via regulation of several growth regulatory gene products. The abbreviations used are: FBS, fetal bovine serum; PBS, phosphate buffered saline; PI, propidium iodide; OD, optical density; DiOC6, 3,3-dihexyloxa carbcyanine iodide; MTT, 3 [4-5-dimethylthiazol-2-yl] -2-diphenyltetrazolium bromide.
To investigate the possible mechanism of Drynariae Rhizoma extracts as a candidate of anti-cancer drug, I examined the effects of Drynariae Rhizoma extracts on the apoptosis of U937 cell line. MTT assay, flow cytometric analysis, SDS-polyacrylamide gel electrophoresis, Western blot analysis, and RT-PCR were performed. Drynariae Rhizoma extracts treatment reduced the cell viablilty of U937 cells in a dose-dependent manner, which was associated with induction of apoptotic cell death. Drynariae Rhizoma extracts treatment also reduced the levels of Bcl-xL anti-apoptotic protein expression and increased the levels of caspase-3, p53, pro-apoptotic protein, in U937 cells. RT-PCR data revealed that the level of bcl-2, bcl-xL mRNA expressions decreased in a dose-dependent manner. These findings suggest that Drynariae Rhizoma extracts may have induction of apoptotic cell death via regulation of several growth regulatory gene products. The abbreviations used are: FBS, fetal bovine serum; PBS, phosphate buffered saline; PI, propidium iodide; OD, optical density; DiOC6, 3,3-dihexyloxa carbcyanine iodide; MTT, 3 [4-5-dimethylthiazol-2-yl] -2-diphenyltetrazolium bromide.
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문제 정의
또 Wangle은 骨碎補 가 streptomycin으로 인한 골독성을 감소시킨다고, 趙⑰ 등은 골성관절염에 있어서 연골세포기능을 개선시키고 세포의 퇴행성변화를 지연시킴으로 관절병의 병변을 저하시키는 것으로, 王珂 등은 동맥경화의 죽종형성을 예방하는 것으로 보고하였다. 본 연구에서는 골의 파괴를 예방하고 형성을 촉진시키며, 뼈의 퇴행성 변화를 지연시키고 항염증 기능이 있는 것으로 알려져 왔던 骨碎補가 U937 백혈병세포주의 세포자멸사에 어떠한 영향을 미치는지 보기 위하여 용매분획을 한 후 클로로포름층, 에탄올층, 부탄올층을 주출하여 여러 가지 apotosis기전을 관찰한 결과 부탄올 층에서 유의성 있는 결과를 얻었기에 이에 보고하는 바이다.
제안 방법
배양된 U937 세포에 骨碎補 부탄올 추출물을 1, 10, 100 陽/ "의 농도로 24 시간 동안 처리한 후 수집하여 PBS로 세정하고 lysis buffer(50 mM Tris-Cl, 150 mM NaClz 100 “g/圳 PMSF, 10 qg/i圳 leupeptin, l%NP-40)를 사용하여 30 분 가량 얼음에 둔 다음 pipetting으토 용해시켰다. 원심분리 후 상층액을 얻어서 Bradford reagent를 이용하여 단백질을 정량하였고邳, 전체 lysate 30 陽/lane을 기준으로 12% SDS PAGE gel에 loading 하였다.
1차 항체는 anti-rabbit caspase 3 monoclonal antibody, anti-rabbit bcl-xL antibody, anti-rabbit p53 antibody# 각각 1: 1000, 1: 1000, 1: 500으로 3% BSA in PBS에 희석, 4°C에서 overnight 하여 반응시켰다. 2차 항체는 horseradish peroxidase(HRP)가 결합된 anti-goat IgG틀 1: 10000으로 5% skim milk에 희석하여, 실온에서 1 시간 동안 반응시키고 ECL을 이용하여 band를 확인하였다.
계대배양한 U937 세포의 세포부유액을 조제(IxloWeiis/well) 하고 骨碎補 부탄올 추출물을 농도별로(1〜100 俸/n粉 처리하여 48 시간 동안 37 'C의 CO2 배양기(5%-COz 95%-air) 내에서 배양하였다. 배양 종료 4 시간 전에 5 ing/M농도로 DPBS-A(pH 7.
1 N HC1 에녹인 10% SDS 100 以로 용해시켜 18 시간 동안 은박지로 빛을 차단하였다. 발색된 각 well의 흡광도를 ELISA reader를 이용해서 570 nm에서 측정한 후 대조군의 흡광도와 비교하여 세포 생존율을 백분율로 환산하였다. /
배양 종료 4 시간 전에 5 ing/M농도로 DPBS-A(pH 7.4) 에 희석된 MTT용액 20 成를 각 well에 첨가하고, 0.1 N HC1 에녹인 10% SDS 100 以로 용해시켜 18 시간 동안 은박지로 빛을 차단하였다. 발색된 각 well의 흡광도를 ELISA reader를 이용해서 570 nm에서 측정한 후 대조군의 흡광도와 비교하여 세포 생존율을 백분율로 환산하였다.
본 연구에서 세포자멸사는 MIT assay를 통한 생존율 측정, 세포자멸사 유도 단백질에 대한 Western blott, DNA의 분절화분석을 위한 sub G1 peak 관찰, mitochondria의 transmembrane potential 측정, RT-PCR을 통한 세포자멸사와 연관된 유전자의 mRNA 발현 측정을 통해 관찰하였다. 본 실험에서는 계대 배양한 백혈병세포주인 U937 세포에 1, 10 및 100 題/被 농도의 骨碎 補 부탄올 추출물을 첨가해서 48 시간 동안 배양하고, MTT assay로 세포증식반응을 측정한 결과, 대조군을 100%로 하였을 < 1, 10 및 100 座/戒 의 농도투여군에서는 각각 85.
대상 데이터
본 실험에 사용한 骨碎補는 우석대학교 한방병원에서 정선하였고, 추출방법은 다음과 같다(Fig. 1).
, Piscataway, USA), prestained SDS-PAGE standard, sodium dodecyl sulfatefBio-Rad, Hercules, USA), 기타 시약은 특급시약 및 세포배양용 시약을 사용하였다. 사용한 항체는 Monoclonal human anti-Bcl-xL antibody, Monoclonal Anti-human Caspase 3 antibody(이상 R&D system, Minneapolis, USA), anti-rabbit p53 antibody(Cell Signaling, Beverly, USA)를 사용하였다.
실험에 사용한 시약은 RPMI 1640 media, FBS(GIBCOBRL, Grand island, USA), PBS, PI, TEMED, Trizol(Life Technonogies Grand island, USA), Taq DNA polymerase, M-MLV reverse transcriptase, Oligo(dT)z PCR markerfPromega, Madison, USA), dNTP set(Amersham pharmarcia Biotech Inc., Piscataway, USA), prestained SDS-PAGE standard, sodium dodecyl sulfatefBio-Rad, Hercules, USA), 기타 시약은 특급시약 및 세포배양용 시약을 사용하였다. 사용한 항체는 Monoclonal human anti-Bcl-xL antibody, Monoclonal Anti-human Caspase 3 antibody(이상 R&D system, Minneapolis, USA), anti-rabbit p53 antibody(Cell Signaling, Beverly, USA)를 사용하였다.
데이터처리
통계처리는 Studenfs t-test로 하였으며, p<0.05이하를 유의성이 있는 것으로 판정하였다功
성능/효과
骨碎補 부탄올 추출물을 농도별(L 10 妈/n粉로 24시간 동안 처리한 U937 세포를 DiOC6로 염색하여 flow cytometer로 mitochondria의 membrane potential을 분석한 결과 미처리 군에 비해 1 卩g/niE의 농도에서 현저한 membrane potential의 감소를보였고 10 題/畝의 농도에서도 미처리군에 비해 감소를 보였으나 1 俸仙의 농도보다는 덜하였다(Fig. 3).
骨碎補 부탄올 추출물을 농도별로 투여(1〜100 座/n粉하고 24 시간 동안 배양한 U937 세포에서 RNA를 추출한 후 cDNA를 합성하여 PCR을 시행하였고, 1% agarose g이에서 전기영동한 결과, 미처리군 (lan 언 1)에 비하여 실험군 (lane 2, 3, 4)에서 apoptosis 억제유전자인 bcl-2z bd-xL의 mRNA 발현이 전반적으로 감소하고 있음을 관찰하였다(Fig. 4).
骨碎補 부탄올 추출물을 농도별로(1 〜10。Wm£) 24 시간 동안 처리한 U937 세포를 PI로 염색하여 flow cytometer로 세포주기의 분포도를 분석한 결과 미처리군과 비교하여 L 10 및 100 陽/[旭 의 처리군에서 각각 34.7±2.0%, 36.2+3.3%, 38.9±0.9%로 세포자멸사를 나타내는 sub G1 peak가 유의성 있게 증가하였다 (Table 3).
계대배양한 U937 세포에 骨碎補 부탄올 추출물을 농도별 (1-100 您/被)로 24 시간동안 처리한 후 단백질을 추출하여 western blotting을 통해 세포자멸사를 유도하거나 억제하는 단백질의 발현을 관찰한 결과 세포자멸사를 억제하는 단백질로 알려진 Bcl-xL의 발현은 농도의존적으로 점차 감소하는 것을 확인할 수 있었으며, 세포자멸사를 유발하는 중요한 단백질인 caspase-3와 p53 단백질의 발현은 농도의존적으로 증가하는 것을 관찰할 수 있었다(Fig. 2).
또한 DNA 저이배체 유도틀 보고자 骨碎 補의 부탄올 추출물을 농도별로 처리하여 PI로 염색한 후 flow cytometer로 세포주기의 분포도를 분석한 결과 미처리군과 비교하여 각 농도처리 군에서 세포자멸사를 나타내는 sub G1 peak 가 증가하였으며, 1, 10, 100 昭梅 모든 농도에서 유의성 있는 증가를 보였다. 농도별로 처리한 후 24 시간 동안 배양한 U937 세포에서 RNA를 주출하고 cDNA를 합성하여 PCR을 시행한 결과 세포자멸사 억제유전자인 bcl-2 및 bcl-xL의 mRNA 발현이 전반적으로 감소하고 있음을 관찰하였다.
8%로 유의성 있는 억제를 보임으로 세포 생존율 감소를 관찰할 수 있었고, 이것이 세포자멸사의 기전에 의한 것인지를 확인하기 위하여 western blotting을 실시한 결과 세포자멸사를 억제하는 단백질인 Bcl-xL의 발현은 농도 의존적으로 점차 감소했으며, 세포자멸사를 유발하는 중요한 단백질인 caspase-3와 p53 단백질의 발현은 농도의존적으로 증가하는 것을 관찰할 수 있었다. 또한 DNA 저이배체 유도틀 보고자 骨碎 補의 부탄올 추출물을 농도별로 처리하여 PI로 염색한 후 flow cytometer로 세포주기의 분포도를 분석한 결과 미처리군과 비교하여 각 농도처리 군에서 세포자멸사를 나타내는 sub G1 peak 가 증가하였으며, 1, 10, 100 昭梅 모든 농도에서 유의성 있는 증가를 보였다. 농도별로 처리한 후 24 시간 동안 배양한 U937 세포에서 RNA를 주출하고 cDNA를 합성하여 PCR을 시행한 결과 세포자멸사 억제유전자인 bcl-2 및 bcl-xL의 mRNA 발현이 전반적으로 감소하고 있음을 관찰하였다.
발현 측정을 통해 관찰하였다. 본 실험에서는 계대 배양한 백혈병세포주인 U937 세포에 1, 10 및 100 題/被 농도의 骨碎 補 부탄올 추출물을 첨가해서 48 시간 동안 배양하고, MTT assay로 세포증식반응을 측정한 결과, 대조군을 100%로 하였을 < 1, 10 및 100 座/戒 의 농도투여군에서는 각각 85.5+3.7%, 66.7±3.9%, 59.8±3.8%로 유의성 있는 억제를 보임으로 세포 생존율 감소를 관찰할 수 있었고, 이것이 세포자멸사의 기전에 의한 것인지를 확인하기 위하여 western blotting을 실시한 결과 세포자멸사를 억제하는 단백질인 Bcl-xL의 발현은 농도 의존적으로 점차 감소했으며, 세포자멸사를 유발하는 중요한 단백질인 caspase-3와 p53 단백질의 발현은 농도의존적으로 증가하는 것을 관찰할 수 있었다. 또한 DNA 저이배체 유도틀 보고자 骨碎 補의 부탄올 추출물을 농도별로 처리하여 PI로 염색한 후 flow cytometer로 세포주기의 분포도를 분석한 결과 미처리군과 비교하여 각 농도처리 군에서 세포자멸사를 나타내는 sub G1 peak 가 증가하였으며, 1, 10, 100 昭梅 모든 농도에서 유의성 있는 증가를 보였다.
이상의 실험 결과, 骨碎補 부탄올 추출물은 U937 백혈병 세포주에 대해 유의성 있게 세포자멸사를 유도하였다.
후속연구
이러한 실험결과 骨碎補 부탄올 추출물은 U937 세포에서 세포자멸사의 과정을 진행시킴으로써 암세포의 증식억제 및 조절에 일정한 역할을 할 것으로 생각되며, 이에 대한 세포유전학 및 동물학적 연구가 깊이 진행되길 기대한다.
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