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문제 정의
- 이 중 IGFBP-1 은 IGF-1 의 반감기를 조절하여 세포증식 억제 및 세포사멸 뿐 아니라 당뇨를 비롯한 생체 이화학적 반응에 관여하고 있으며 [8, 9], 알콜을쥐에게 투여했을때에도 혈액과 간장의 IGFBPs 발현과 분비에 영향을 미치는 것으로 나타났다[16, 17]. 그러므로, 본 연구에서 사염화탄소 투여로 간손상을 유도하면서 매생이를 급이했을 때 혈중 IGFBP-1의 발현에 미치는 영향을 살펴보았다. 그 결과, Fig.
- 이와같이 고지방식이로 유도된 간 손상을 회복시키는 기능성을 고려할 때, 매생이 중에는 간 보호 또는 기능을 회복시키는 성분이 함유되어 있을 것으로 예상되며, 이를 우선 확인하고자 간장해를 일으키는 약물 중 하나인 사염화탄소를 투여하면서 동시에 5% 매생이를 급이하여, 혈청 및 간에서의 지질함량과 효소 활성도를 측정함으로써 매생이의 간기능 회복 정도를 살펴보았다. 그리고, 내분비계 호르몬 IGF-I의 작용을 조절하는 IGFBP-1 의 발현 정도를 측정, 사염화탄소 투여와 매생이 급이에 의한 변화를 통해간 독성 및 간손상 정도를 파악하는 지표로 사용가능함도 함께 검토하였다.
- 본 연구에서는 매생이 급이가 사염화탄소로 유발된 흰쥐의 간손상에 대한 보호효과를 나타내는지 살펴보고자 하였다. 사염화탄소 투여에 의해 혈중 GOT, GPT 및 LDH 활성이 정상군과 비교하여 각각 5배, 3.
제안 방법
- Insulin-like growth factor(IGF) binding protein-1 (IGFBP-1) 을 분석하기 위하여 혈청 1.5 ㎕를 12.5% SD&PAGE에 전기영동한 다음, semi transblot (Bio-rad, USA)로 멤브레인에 옮겼다. 그 멤브레 인을 3% BSA + IX TBS로 실온에서 2시간 반응시킨 후, rabbit IGFBP-11차 항체 (1:1000)로 4°C에서 하룻밤 반응시켰다.
- 그 후 alka line phosphatase를 발색시키는 용액(NBT/BCIP, Promega)을이용하여 발색시켰다. 각각의 밴드는 스캐닝 덴시토미터(SHARP SCAN JX-330, Pharmacia Biotech)로 정량분석하였다.
- 그리고 간장은 별도로 적출하여 생리식염수로 씻은 후, 그 무게를 칭량하고 혈청과 마찬가지로 저온(-70°C)에 보관하면서 실험하였다. 간장 내 지질함량을 측정하기 위하여 간 조직 0.5 g 을 조직균질기로 마쇄한 후 hexane : isopropanol 혼액 (3 : 1, v/v)으로 지질을 추출하였다. 지질추출기를 질소가스로 농축한 다음, chloroform : methanol 혼액 (2 : 1, v/v) 1 ㎖에 용해하여 지질 농도를 측정하였다.
- 5% SD&PAGE에 전기영동한 다음, semi transblot (Bio-rad, USA)로 멤브레인에 옮겼다. 그 멤브레 인을 3% BSA + IX TBS로 실온에서 2시간 반응시킨 후, rabbit IGFBP-11차 항체 (1:1000)로 4°C에서 하룻밤 반응시켰다. 다음 날, 멤브레인을 세척한 후 2차 항체(1:1000, an ti-rabbit IgG conjugated alkaline phosphatase)를 처리하여 실온에서 3시간동안 반응시킨 뒤, TBS로 세척하였다.
- 그리고 간장은 별도로 적출하여 생리식염수로 씻은 후, 그 무게를 칭량하고 혈청과 마찬가지로 저온(-70°C)에 보관하면서 실험하였다. 간장 내 지질함량을 측정하기 위하여 간 조직 0.
- 실험식이는 기초식이군(Normal), 사염화탄소 투여군(CCI4, 5% 매생이 분 말군 (Exp-CF)으로 나누었다. 본 실험에서 사용한 기초 식이 군과 실험군의 식 이조성은 Table 1과 같이 배합하였고, 모든 식이와 음용수는 자유 섭취방법으로 급여하면서 하루에 한번 일정한 시간에 섭취량을 측정하였다. 식이효율(Feed Efficiency Ratio, FER)은 체중증가량을 식이섭취량으로 나누어 계산하였다.
- 사염화탄소 투여군을 대조군으로 하고, 사염화탄소 투여로 간손상을 유도함과 동시에 5주간 매생이를 급이한 실험군의 간손상 정도를 살펴보기 위해, GOT-GPT를 비롯하여 LDH 등 혈청중 효소활성 변화를 측정하였다. 이에 앞서 Figure 1은 5주간 사육후 흰쥐의 복부를 절개하였을때, 간 조직 상태를 육안으로 비교한 것이다.
- 실험식이 시작 전 1주일간은 고형배합사료로 적응시킨 후, 체중을 고려하여 10마리씩 3군으로 임의배치한 다음, 적정환경 (온도 20±2℃, 명암은 12시간 주기)에서 5주간 사육하였으며, 체중은 주 1회 측정하였다. 사염화탄소로 인한 간독성을 유도하기 위해서 이틀에 한번씩 체중 100 g당 100 ㎕ (CCI4 : Com col = 1 : 1)씩 복강투여를 실시하였다. 실험식이는 기초식이군(Normal), 사염화탄소 투여군(CCI4, 5% 매생이 분 말군 (Exp-CF)으로 나누었다.
- 본 실험에서 사용한 기초 식이 군과 실험군의 식 이조성은 Table 1과 같이 배합하였고, 모든 식이와 음용수는 자유 섭취방법으로 급여하면서 하루에 한번 일정한 시간에 섭취량을 측정하였다. 식이효율(Feed Efficiency Ratio, FER)은 체중증가량을 식이섭취량으로 나누어 계산하였다.
- 실험동물의 처리는 실험사육 최종일에 12시간 절식시킨 후에 단두하여 채혈하였고, 각 혈액시료는 빙수중에 1시간 방치 한 후에 원심분리(3, 000 rpm, 15 min, 400하여 취한 혈청을 저온(-7CTC)에 보관하면서 실험에 사용하였다. 그리고 간장은 별도로 적출하여 생리식염수로 씻은 후, 그 무게를 칭량하고 혈청과 마찬가지로 저온(-70°C)에 보관하면서 실험하였다.
- 실험식이 시작 전 1주일간은 고형배합사료로 적응시킨 후, 체중을 고려하여 10마리씩 3군으로 임의배치한 다음, 적정환경 (온도 20±2℃, 명암은 12시간 주기)에서 5주간 사육하였으며, 체중은 주 1회 측정하였다. 사염화탄소로 인한 간독성을 유도하기 위해서 이틀에 한번씩 체중 100 g당 100 ㎕ (CCI4 : Com col = 1 : 1)씩 복강투여를 실시하였다.
- 사염화탄소로 인한 간독성을 유도하기 위해서 이틀에 한번씩 체중 100 g당 100 ㎕ (CCI4 : Com col = 1 : 1)씩 복강투여를 실시하였다. 실험식이는 기초식이군(Normal), 사염화탄소 투여군(CCI4, 5% 매생이 분 말군 (Exp-CF)으로 나누었다. 본 실험에서 사용한 기초 식이 군과 실험군의 식 이조성은 Table 1과 같이 배합하였고, 모든 식이와 음용수는 자유 섭취방법으로 급여하면서 하루에 한번 일정한 시간에 섭취량을 측정하였다.
- 뿐만 아니라 고지방식이로 유도된 간손상으로 혈중 GOT와 GPT 함량이증가되었는데, 이는 매생이 급이를 통해 간기능을 유지시키는 것으로 나타났다. 이와같이 고지방식이로 유도된 간 손상을 회복시키는 기능성을 고려할 때, 매생이 중에는 간 보호 또는 기능을 회복시키는 성분이 함유되어 있을 것으로 예상되며, 이를 우선 확인하고자 간장해를 일으키는 약물 중 하나인 사염화탄소를 투여하면서 동시에 5% 매생이를 급이하여, 혈청 및 간에서의 지질함량과 효소 활성도를 측정함으로써 매생이의 간기능 회복 정도를 살펴보았다. 그리고, 내분비계 호르몬 IGF-I의 작용을 조절하는 IGFBP-1 의 발현 정도를 측정, 사염화탄소 투여와 매생이 급이에 의한 변화를 통해간 독성 및 간손상 정도를 파악하는 지표로 사용가능함도 함께 검토하였다.
- 5 g 을 조직균질기로 마쇄한 후 hexane : isopropanol 혼액 (3 : 1, v/v)으로 지질을 추출하였다. 지질추출기를 질소가스로 농축한 다음, chloroform : methanol 혼액 (2 : 1, v/v) 1 ㎖에 용해하여 지질 농도를 측정하였다.
대상 데이터
- 1. All data were calculated by MeantS.D. for 10 individuals. Significantly different in student f-test from CCI4 and Exp-CF (p<0.
- D. for 10 individuals. Significantly different in student f-test from CCI4 and Exp-CF (p<0.
- 건조하였다. 건조된 매생이는 식품분쇄기 (HANIL, FM-681)로 미세하게 분쇄하여 사용하였다.
- 본 실험에서는 4주령된 Sprague-Dawley계 수컷 흰쥐 30 마리를 (주)샘타코(Korea)에서 구입하여 사용하였다. 실험식이 시작 전 1주일간은 고형배합사료로 적응시킨 후, 체중을 고려하여 10마리씩 3군으로 임의배치한 다음, 적정환경 (온도 20±2℃, 명암은 12시간 주기)에서 5주간 사육하였으며, 체중은 주 1회 측정하였다.
- 전남 장흥군 내저리 매생이 작업장으로부터 구입한 매생이를 흐르는 물에 3번 수세한 후, 동결건조기로 건조하였다. 건조된 매생이는 식품분쇄기 (HANIL, FM-681)로 미세하게 분쇄하여 사용하였다.
데이터처리
- 실험자료는 평균土표준편차로 표시하였으며, 유의수준 p<0.05로 student f-test를 실시하였다.
이론/모형
- 간의 손상정도를 측정하기 위하여 Reitman-Frankel의 방법 에 따라 제조된 Glutamic oxaloacetic transaminase (GOT) 및 Glutamic pyruvic transaminase (GPT) 활성측정용 혈청 transaminase 측정 kit (신양화학, Korea)를 사용, 분광광도계 (Ultraspec 2001 pro. Amersham Phamacia Biotech., England) 로 505 nm에서 측정하였다.
- HDL-콜레스테롤의 농도는 혈청 및 간장조직으로부터 추출한 지질추출시료 각 100㎕를 취하여 HDL-C555 kit (신양화학, Korea)를 사용하여 phospho tungstic acid-Mg** 헤파린 . 망간 결합 침전법으로 반응 시켜 분광광도계로 측정하였다.
- 중성지질과 총콜레스테롤의 농도는 표준효소법에 의해 Triglyzyme-V와 CHOLESTEZyme-V kit (신양화학, Korea)를 사용하였는데, 혈청을 포함한 지질시료 10 ㎕에 효소시액 1.5 ㎖을 섞어 37°C 에서 5분간 반응시켜 505 nm 파장에서 그 흡광도를 측정하였다 (Ultraspec 2001 pro. Amersham Phamacia Biotech, England). HDL-콜레스테롤의 농도는 혈청 및 간장조직으로부터 추출한 지질추출시료 각 100㎕를 취하여 HDL-C555 kit (신양화학, Korea)를 사용하여 phospho tungstic acid-Mg** 헤파린 .
성능/효과
- 4 IU/L)하였으므로, 앞서 제시한 바와 같이 매생이 급이를 통한 혈중 GOT . GPT 효소활성의 저해효과와 동일한 것으로 나타나 사염화탄소의 간독성에 대한 매생이의 보호 효과를 확인할 수 있었다.
- 그러므로, 본 연구에서 사염화탄소 투여로 간손상을 유도하면서 매생이를 급이했을 때 혈중 IGFBP-1의 발현에 미치는 영향을 살펴보았다. 그 결과, Fig. 2에 나타낸 바와 같이, 사염화탄소 투여로 인한 IGFBP-1 발현증가는 매생이 급이를 통해 감소된 것을 확인할 수 있었다. 이는 알코올에 의한 간세포의 산화적 손상유도 시 혈중 IGFBP-1 발현이 처리하지 않은 대조군에 비해 약 5배 증가되었고[13], 이 외 염증이나 기아 등 생체 이화학적인 과정에서도 혈중 IGFBP-1 발현이 증가한 결과와 일치함을 알 수 있었다[19, 22, 27].
- 반면 사염화탄소 투여와 동시에 5% 매생이 분말을 급이한 실험군의 GOT, GPT 및 LDH 활성은 사염화탄소 투여군과 비교하여 각각 67%, 53% 및 53% 감소하였다. 그리고 사염화탄소에 의해 혈청 및 간장의 중성지질 함량이 증가하였는데, 매생이 급이는 증가한 중성지질 함량을 감소시키는 결과를 나타내었다. 또한, 사염화탄소 투여로 인한 간손상을 통해 지질 합성 및 대사이상으로 혈중 IGFBP-1 발현이 증가되었으나, 매생이 급이를 통해 혈중 IGFBP-1 이 감소되어 정상군과 비슷한 수준으로 발현되었다.
- 사염화탄소에 의해 간독성이 유발된 흰쥐군은 정상군에 비해 간 중량 백분율이 유의적으로 증가하였다고 보고와 마찬가지로(2), 사염화탄소에 의해 간조직의 손상이 유도되었음을 확인할 수 있었다. 그리고, 사염화탄소 투여군에 비해 사염화탄소 투여 후 두충잎의물추출물 투여군의 체중 증가량이 유의적으로 높게 나타난 것과는 달리[12], 본 연구에서는 5주 사육기간동안 계속적 인사 염화 탄소 투여로 인하여 매생이를 급이하였음에도 불구하고 체중 증가량에는 유의적인 차이가 나타나지 않았다.
- 즉, 본 연구에서도 사염화탄소 투여로 인한 간 손상으로 지질 합성 및 대사이상으로 혈중 IGFBP-1 발현이 증가되었으나, 매생이 급이를 통해 혈중 IGFBP-1 이 감소, 정상군과 비슷한 수준으로 발현되었음을 확인할 수 있었으며, 혈중 IGFBP-1 발현의 변화는 사염화탄소 투여를 통한 간손상 및 지질대사 이상으로 인해 조절될 수 있음을 알 수 있었다. 또한 사염화탄소 투여와 동시에 매생이 급이는 혈중 IGFBP-1 발현을 정상수준으로 회복시킴으로써, 간손상 및 간 보호의 지표로도 사용가능함을 나타내었다.
- 그리고 사염화탄소에 의해 혈청 및 간장의 중성지질 함량이 증가하였는데, 매생이 급이는 증가한 중성지질 함량을 감소시키는 결과를 나타내었다. 또한, 사염화탄소 투여로 인한 간손상을 통해 지질 합성 및 대사이상으로 혈중 IGFBP-1 발현이 증가되었으나, 매생이 급이를 통해 혈중 IGFBP-1 이 감소되어 정상군과 비슷한 수준으로 발현되었다. 이상의 결과에서, 본 실험에서 사용된 매생이는 사염화탄소의 투여로 인한 간손상을 저해하여 혈중 GOT, GPT 함량을 감소시키고, 혈청 및 간장의 지질함량을 감소시킴으로써 사염화탄소에 의한 간손상 예방효과가 있음을 나타내었다.
- 3배 증가하였다. 반면 사염화탄소 투여와 동시에 5% 매생이 분말을 급이한 실험군의 GOT, GPT 및 LDH 활성은 사염화탄소 투여군과 비교하여 각각 67%, 53% 및 53% 감소하였다. 그리고 사염화탄소에 의해 혈청 및 간장의 중성지질 함량이 증가하였는데, 매생이 급이는 증가한 중성지질 함량을 감소시키는 결과를 나타내었다.
- 이전 연구[29] 에서, 콜레스테롤 급이군을 대조군으로 하여 콜레스테롤과 함께 매생이를 급이하여 지질개선 효과를 살펴본 결과, 앞서 제시한 바와 같이 중성지질 및 총콜레스테롤 함량이 저하되었고, 동맥경화지수도 유의적으로 감소하였다. 뿐만 아니라 고지방식이로 유도된 간손상으로 혈중 GOT와 GPT 함량이증가되었는데, 이는 매생이 급이를 통해 간기능을 유지시키는 것으로 나타났다. 이와같이 고지방식이로 유도된 간 손상을 회복시키는 기능성을 고려할 때, 매생이 중에는 간 보호 또는 기능을 회복시키는 성분이 함유되어 있을 것으로 예상되며, 이를 우선 확인하고자 간장해를 일으키는 약물 중 하나인 사염화탄소를 투여하면서 동시에 5% 매생이를 급이하여, 혈청 및 간에서의 지질함량과 효소 활성도를 측정함으로써 매생이의 간기능 회복 정도를 살펴보았다.
- 이상의 결과에서, 본 실험에서 사용된 매생이는 사염화탄소의 투여로 인한 간손상을 저해하여 혈중 GOT, GPT 함량을 감소시키고, 혈청 및 간장의 지질함량을 감소시킴으로써 사염화탄소에 의한 간손상 예방효과가 있음을 나타내었다. 뿐만 아니라 혈중 IGFBP-1 의 변화는 사염화탄소 투여 및 매생이 급이로 인해 변화, 조절됨을 확인함에 따라 간손상 및 간보호의 지표로 사용하기에 효과적임을 나타내었다. 따라서, 앞서 서론에서 제시한 바와 같이 매생이 내에 간보호 또는 간기능을 회복시키는 성분이 함유되어 있음을 확인함에 따라, 앞으로 그 활성물질을 분리, 규명하여 간보호 및 간장질환을 목적으로 하는 식품소재로서의 활용이 가능할 것으로 생각된다.
- 사염화탄소 투여에 의해 혈중 GOT, GPT 및 LDH 활성이 정상군과 비교하여 각각 5배, 3.1 배 및 2.3배 증가하였다. 반면 사염화탄소 투여와 동시에 5% 매생이 분말을 급이한 실험군의 GOT, GPT 및 LDH 활성은 사염화탄소 투여군과 비교하여 각각 67%, 53% 및 53% 감소하였다.
- 사염화탄소는 내형 질세망의 다불포화지방산을 산화시켜 과산화지질을 형성하고, 중성지질의 축적을 유도하는데, Table 4에 나타낸 바와 같이 사염화탄소 투여군의 중성지질 함량이 정상군에 비해(76.H3.1 mg/dl) 약 1.6배 증가하여(127.1±7.8 mg/dl) 비정상적으로 축적되었음을 확인할 수 있었다. 한편 매생이 급이에 의해 중성지질의 함량이 유의적으로 감소되었는데 (85.
- 05), 매생이를 함께 급이한 실험군에서는 정상군에 미치지는 못하지만 사염화탄소 투여군에 비해 감소되었다. 사염화탄소에 의해 간독성이 유발된 흰쥐군은 정상군에 비해 간 중량 백분율이 유의적으로 증가하였다고 보고와 마찬가지로(2), 사염화탄소에 의해 간조직의 손상이 유도되었음을 확인할 수 있었다. 그리고, 사염화탄소 투여군에 비해 사염화탄소 투여 후 두충잎의물추출물 투여군의 체중 증가량이 유의적으로 높게 나타난 것과는 달리[12], 본 연구에서는 5주 사육기간동안 계속적 인사 염화 탄소 투여로 인하여 매생이를 급이하였음에도 불구하고 체중 증가량에는 유의적인 차이가 나타나지 않았다.
- 또한, 사염화탄소 투여로 인한 간손상을 통해 지질 합성 및 대사이상으로 혈중 IGFBP-1 발현이 증가되었으나, 매생이 급이를 통해 혈중 IGFBP-1 이 감소되어 정상군과 비슷한 수준으로 발현되었다. 이상의 결과에서, 본 실험에서 사용된 매생이는 사염화탄소의 투여로 인한 간손상을 저해하여 혈중 GOT, GPT 함량을 감소시키고, 혈청 및 간장의 지질함량을 감소시킴으로써 사염화탄소에 의한 간손상 예방효과가 있음을 나타내었다. 뿐만 아니라 혈중 IGFBP-1 의 변화는 사염화탄소 투여 및 매생이 급이로 인해 변화, 조절됨을 확인함에 따라 간손상 및 간보호의 지표로 사용하기에 효과적임을 나타내었다.
- 혈중 IGFBP-1 의 증가는 세포 표면에서 IGF-I 수용체와의 결합을 방해하여, IGF-I의 작용을 억제시키는 것으로[9], 이는 생체 이화학적인 대사 이상을 의미한다. 즉, 본 연구에서도 사염화탄소 투여로 인한 간 손상으로 지질 합성 및 대사이상으로 혈중 IGFBP-1 발현이 증가되었으나, 매생이 급이를 통해 혈중 IGFBP-1 이 감소, 정상군과 비슷한 수준으로 발현되었음을 확인할 수 있었으며, 혈중 IGFBP-1 발현의 변화는 사염화탄소 투여를 통한 간손상 및 지질대사 이상으로 인해 조절될 수 있음을 알 수 있었다. 또한 사염화탄소 투여와 동시에 매생이 급이는 혈중 IGFBP-1 발현을 정상수준으로 회복시킴으로써, 간손상 및 간 보호의 지표로도 사용가능함을 나타내었다.
- 4 g/day로, 사염화탄소 투여와 동시에 매생이를 급이한 실험군의 체중증가량이 다소 높게 나타났다. 체중에 대한 간 중량 백분율은 정상군에 비해 사염화탄소 투여군에서 유의적인 증가를 나타내었으나(p<0.05), 매생이를 함께 급이한 실험군에서는 정상군에 미치지는 못하지만 사염화탄소 투여군에 비해 감소되었다. 사염화탄소에 의해 간독성이 유발된 흰쥐군은 정상군에 비해 간 중량 백분율이 유의적으로 증가하였다고 보고와 마찬가지로(2), 사염화탄소에 의해 간조직의 손상이 유도되었음을 확인할 수 있었다.
- 체중증가량은 정상군이 가장 높게 나타났고(6.46±1.4 g/day), 나머지 실험군인 사염화탄소 투여군은 4.72±1.3 g/day, 매생이 급이 군은 5.04±0.4 g/day로, 사염화탄소 투여와 동시에 매생이를 급이한 실험군의 체중증가량이 다소 높게 나타났다. 체중에 대한 간 중량 백분율은 정상군에 비해 사염화탄소 투여군에서 유의적인 증가를 나타내었으나(p<0.
- 3 mg/dl에 비해 높게 나타났으며, 정상군의 경우는 매생이 급이군에 비해 약간 감소하였으나 유의성은 관찰되지 않았다. 특히 매생이 급이군에서 총콜레스테롤에 대한 HDL-콜레스테롤의 백분율이 사염화탄소 투여군(9.3±2.5%) 에 비해 유의적으로 높게 나타난 반면(18.8±2.1%), 동맥경화증을 일으킬 수 있는 위험인자의 지표인 동맥경화지수(A.I.) 의 비율은 사염화탄소 투여군(9.7±0.2)에 비해 현저히 낮게 나타났다(4.3±0.2). 즉, 사염화탄소 투여로 간조직에 손상을 입으면 cytochrome P-450에 의한 CCh기 생성을 통해 간 세포기 능을 저하시킴으로써 콜레스테롤과 중성지질의 함량이증가되는데[1, 10].
- 5 mg/dl)를 나타내었으며, LDL-콜레스테롤의 함량도 이와 같은 경향을 나타내었다. 한편 매생이 급이군의 혈청 HDL-콜레스테롤의 함량은 16.8±5.3 mg/dl로, 정상군의 13.9±1.3 mg/dl에 비해 높게 나타났으며, 정상군의 경우는 매생이 급이군에 비해 약간 감소하였으나 유의성은 관찰되지 않았다. 특히 매생이 급이군에서 총콜레스테롤에 대한 HDL-콜레스테롤의 백분율이 사염화탄소 투여군(9.
후속연구
- 뿐만 아니라 혈중 IGFBP-1 의 변화는 사염화탄소 투여 및 매생이 급이로 인해 변화, 조절됨을 확인함에 따라 간손상 및 간보호의 지표로 사용하기에 효과적임을 나타내었다. 따라서, 앞서 서론에서 제시한 바와 같이 매생이 내에 간보호 또는 간기능을 회복시키는 성분이 함유되어 있음을 확인함에 따라, 앞으로 그 활성물질을 분리, 규명하여 간보호 및 간장질환을 목적으로 하는 식품소재로서의 활용이 가능할 것으로 생각된다.
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