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제안 방법
- 치주질환의 주요 병인균주인 Prevotella izitenraed"에 의하여 생성된 Bacterial lipopolysaccharise (LPS)를 대식세포에 처리하여 NO를 유도시킨 다음 청각추출물을 대식세포에 처리하여 NO 활성 및 iNOS합성에 미치는 영향을 조사하였다. Fig.
- Plate에 MTT 2 mg/ml 3-(4, 5-dimethylthiazol-2-yl)- 2, 5-diphenyl -tetrazolium bro mide (MTT, Sigma) 용액을 20 pl 씩 첨가하여 4시간 동안 배양시키고 formazan을 형성시키 후 조심스럽게 상등액을 제거하였다. DMSO 150 ul를 첨가하여 formazan을 녹인 후 570 nm에서 흡광도를 측정하였다, 추출물의 농도는 10, 20, 50, 100, 200 iil/well로 하였다.
- 1% N-(l-naphthyl) ethylenediamine dihydrochloride (60%acetic acid) 혼합액] 을 가하여 상온에서 20분간 반응시켰다. NO의 활성 정도는 ELISA 판독기를 사용하여 800 pg/ml 농도 범위에서 540 ran 홉광도를 측정하였다.
- 김치의 부재료로 사용되는 청각추출물이 젖산균의 생육에 미치는 영향을 조사하였다(Fig. 1). Fig.
- 측정하였다. 대식세포를 세포 배양판에 5 X 105 celis/ml의 세포가 되도록 재부유하여 LPS의 자극하에 24시간 배양하고 그 배양 상층액 내의 NO를 Griess 시약과 반응 시 켜 측정하였다[21]. 100ul 의 세포배양 상층액을 취하여 동량의 Griess 시약 [1% sulfanilamide (30% acetic acid) 와 0.
- Nice 등은 SOD 정제시 열안정성이 높고 SOD와 유사한 활성을 나타내는 물질을 함께 정제하였는데 이것은 SOD 와 결합된 phenol 계 물질인 것으로 보고하였다[28]. 따라서 항산화 및 항노화와 밀접한 관계가 있는 것으로 알려진 SOD 유사활성 측정을 pyrogallol의 자동산화 반응을 이용하여 분석하였다. 청각 ethyl acetate 추출물의 SOD 유사활성 측정결과를 Fig.
- 사용하였다. 시료의 메탄올 추출물을 얻기 위하여 건조시료 일정 량에 20배의 methanol (Hayman, England) 가하여 65C°에서 2회 반복 추출하여 Whatman 여과지로 여과한 후 여과액을 rotary vacuum evaporator (EYELA, Japan) 로감압 농축하여 사용하였다. 추출물 5 g 을 80%의 methanol 에 녹여 hexane, ether, ethyl acetate, n-butan이을 이용하여순차적으로 분획 하였으며 각 분획물의 항산화 실험결과 ethyl acetate에서 가장 높은 활성을 나타내어 모든 항산화실험은 ethyl acetate추출물로 하였다.
- 5 X 104 M DPPH용액 160 ul를 섞은 후, 37°C 에서 30분 동안 반응시킨 다음 ELISA reader를 이용하여 520 nm에서 흡광도를 측정하였다. 전자공여능(Electron donating ability, EDA)은 EDA(%) = (대조구흡광도-시료첨가구흡광도)/대조구흡광도 X 100으로 계산하였다. 시료를 첨가하지 않은 대조그룹과 흡광도차를 비교하여 프리라디칼의 제거활성을 백분율로 나타내었다.
- 청각의 주요 항산화 물질를 확인하기 위하여 ethyl acetate 추출물을 TLC로 분리하였다(data not shown). 청각에 존재하는 polyphenol계 화합물은 극성이 비교적 높은 것으로 나타났다.
- 청각추출물의 젖산균에 대한 생육 측정은 Lactobacillus plantarum KCTC3105 의 젖산균을 사용하였으며, MRS broth (peptone 10.0 g, beef extract 10.0 g, yeast extract 5.0 g, glu cose 20.0 g, tween 80 1.0 ml, K2HPO4 2.0 g, sodium acetate 5.0 g, triammonium citrate 2.0 g, MgSO4. THjO 0.2 g, MSO4.4H2O 0.2 g, distilled water 1.0 L)에 DMSO에 녹인청각 MeOH 추출물을 농도별로Qig/ml) 첨가하고 젖산균을 접종하여 370게서 24시간 배 양한 후 600 nm에서 흡광도를 측정하였다.
- 시료의 메탄올 추출물을 얻기 위하여 건조시료 일정 량에 20배의 methanol (Hayman, England) 가하여 65C°에서 2회 반복 추출하여 Whatman 여과지로 여과한 후 여과액을 rotary vacuum evaporator (EYELA, Japan) 로감압 농축하여 사용하였다. 추출물 5 g 을 80%의 methanol 에 녹여 hexane, ether, ethyl acetate, n-butan이을 이용하여순차적으로 분획 하였으며 각 분획물의 항산화 실험결과 ethyl acetate에서 가장 높은 활성을 나타내어 모든 항산화실험은 ethyl acetate추출물로 하였다.
대상 데이터
- 청각은 가덕도산으로 동결건조기로 건조하여 50mesh 이하로 분쇄한 것을 -20°C에서 냉동보관하면서 분석을 위한 시료로 사용하였다. 시료의 메탄올 추출물을 얻기 위하여 건조시료 일정 량에 20배의 methanol (Hayman, England) 가하여 65C°에서 2회 반복 추출하여 Whatman 여과지로 여과한 후 여과액을 rotary vacuum evaporator (EYELA, Japan) 로감압 농축하여 사용하였다.
- 이 혼합액을 1시간동안 정치한 후 ELISA reader! 이용하여 730 nm에서 흡광도를 측정하였다. 표준용액으로는 galic acid를 사용하였다.
이론/모형
- Cellulase 활성은 CMC를 기질로 하여 효소 반응 후에 유리된 환원당을 3, 5-dinitrosalicylic acid (DNS) 방법 [24]으로 측정하였다. 증류수에 현탁시킨 1.
- 7 cells were cultured for 24 h with vari ous concentration in the presence of LPS. NO release was measured using the method of Griess (nitrite). Results are expressed as means±S.
- NO의 생성은 비색법으로 세포 상등액에 축적되는 nitrite 양을 측정하였다. 대식세포를 세포 배양판에 5 X 105 celis/ml의 세포가 되도록 재부유하여 LPS의 자극하에 24시간 배양하고 그 배양 상층액 내의 NO를 Griess 시약과 반응 시 켜 측정하였다[21].
- Inhibitory effect of ethyl acetate extract of Codium fragile on cellulase activity. The enzyme assay for the CMCase was carried out by DNS method.
- 세포활성은 MTT assay에 의하여 측정하였다[21]. 96-well microtiter plate (Nunc, Vangaard, Neptune, NJ) 에 RAW 264.
- 전자공여능 측정은 Blois의 방법[기에 따라서 각 추출물의DPPH (l, l-diphenyl-2- picrylhydrazyl)에 대한 수소공여 효과로 측정 하였다. 추출시료를 DMSO에 녹여 농도별로 희석하여 시료 40 ul1와 1.
- 총 폴리페놀의 함량(total polyphenol content)은 분석방법으로 널이 사용되고 있는 Folins-Denis 방법 [3]으로 측정하였다. Ethyl acetate 추출물을 DMSO에 농도별로 녹여, 10 배로 희석한 액 50 ill에 Folin reagent 50 ul을 가하고 3분간정치한 다음 50 ul의 10% NazCCh용액을 가하였다.
- 추출물의 SOD 유사활성은 Marklund 와 Marklund의 방법[22]에 따라 과산화수소(H2O2)로 전환시키는 반응을 촉매하는 pylogallol의 생성량을 측정하여 SOD 유사활성으로 나타내었다. 각 추출시료를 DMSO에 녹여 농도별로 희석하여,시 료 10 ul1에 pH 8.
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