차에 함유된 methylxanthin류, catechin류 및 theaflavin류의 HPLC에 의한 동시분석법 Analytical Method for Methylxanthin, Catechin, and Theaflavin Determinations in Korean Commercial Teas by HPLC원문보기
본 연구는 차에 함유되어 있는 특유의 정미성분으로 methylxantin류, catechin류 및 theaflavin류의 총 13종의 화합물을 HPLC를 이용한 동시분석법을 확립함과 동시에 이 분석법을 이용하여 한국에서 사판되고 있는 녹차, 홍차 및 우롱차에 함유되어 있는 주요 성분을 분석하였으며 그 결과는 다음과 같다. HPLC분석조건은 역상(ODS)column을 이용하여 acetonitrile: 20 mM 인산완충액의 solvent 중 acetonitrile의 농도를 처음 단계 7%에서 최종 40%까지 단계적으로 변화시켜 분당 1mL씩 용출시켜 분석하였다. Column 온도는 효과적으로 각 성분을 분리시키기 위하여 정확하게 $30^{\circ}C$로 설정하였으며 파장은 270 nm에서 분석하였다. 또한 차에 함유되어 있는 methylxantin류, catechin류 및 theaflavin류의 총 13종의 화합물을 분석한 결과, 한 시료당 90분이 소요되었으며 재현성과 정량성이 뛰어나 13종의 화합물이 완전하게 분리되었다. 시판 녹차, 홍차, 우롱차를 분석한 결과, 녹차와 우롱차는 2종류의 methylxantin류와 7종류의 catechin류는 검출되었으나 홍차에서 검출된 4종류의 theaflavin류는 전혀 나타나지 않았다. 이러한 결과는 차의 품질 관리 및 소비자의 차 선택에 있어 중요한 기초자료가 될 것으로 사료된다.
본 연구는 차에 함유되어 있는 특유의 정미성분으로 methylxantin류, catechin류 및 theaflavin류의 총 13종의 화합물을 HPLC를 이용한 동시분석법을 확립함과 동시에 이 분석법을 이용하여 한국에서 사판되고 있는 녹차, 홍차 및 우롱차에 함유되어 있는 주요 성분을 분석하였으며 그 결과는 다음과 같다. HPLC분석조건은 역상(ODS)column을 이용하여 acetonitrile: 20 mM 인산완충액의 solvent 중 acetonitrile의 농도를 처음 단계 7%에서 최종 40%까지 단계적으로 변화시켜 분당 1mL씩 용출시켜 분석하였다. Column 온도는 효과적으로 각 성분을 분리시키기 위하여 정확하게 $30^{\circ}C$로 설정하였으며 파장은 270 nm에서 분석하였다. 또한 차에 함유되어 있는 methylxantin류, catechin류 및 theaflavin류의 총 13종의 화합물을 분석한 결과, 한 시료당 90분이 소요되었으며 재현성과 정량성이 뛰어나 13종의 화합물이 완전하게 분리되었다. 시판 녹차, 홍차, 우롱차를 분석한 결과, 녹차와 우롱차는 2종류의 methylxantin류와 7종류의 catechin류는 검출되었으나 홍차에서 검출된 4종류의 theaflavin류는 전혀 나타나지 않았다. 이러한 결과는 차의 품질 관리 및 소비자의 차 선택에 있어 중요한 기초자료가 될 것으로 사료된다.
Method for separation and quantification of methylxanthins, catechins, and theaflavins in Korean commercial teas (green, oolong, and black teas) was developed using reversed phase high-performance liquid chromatography (HPLC). After extraction with hot water, tea compounds were separated on Inertsil...
Method for separation and quantification of methylxanthins, catechins, and theaflavins in Korean commercial teas (green, oolong, and black teas) was developed using reversed phase high-performance liquid chromatography (HPLC). After extraction with hot water, tea compounds were separated on Inertsil ODS-3v $(5\;{\mu}m)$ column, eluted with gradient of 7% acetonitrile and 93% of 20 mM phosphate buffer mixture for 7 min. Column effluent was monitored at 270 nm. This technique was effective for analyses of m methylxanthins, catechins, and theaflavins in teas and biological samples. In green and oolong teas, two kinds of methylxanthins and 7 of catechins were identified, whereas 4 theaflavins were only identified in black tea. Among seven catechins in green and oolong teas, EGCG showed highest amount, whereas ECG was highest in black tea. (theaflavins were found only in black teas) In all teas, theobromine content was lower than that of caffeine.
Method for separation and quantification of methylxanthins, catechins, and theaflavins in Korean commercial teas (green, oolong, and black teas) was developed using reversed phase high-performance liquid chromatography (HPLC). After extraction with hot water, tea compounds were separated on Inertsil ODS-3v $(5\;{\mu}m)$ column, eluted with gradient of 7% acetonitrile and 93% of 20 mM phosphate buffer mixture for 7 min. Column effluent was monitored at 270 nm. This technique was effective for analyses of m methylxanthins, catechins, and theaflavins in teas and biological samples. In green and oolong teas, two kinds of methylxanthins and 7 of catechins were identified, whereas 4 theaflavins were only identified in black tea. Among seven catechins in green and oolong teas, EGCG showed highest amount, whereas ECG was highest in black tea. (theaflavins were found only in black teas) In all teas, theobromine content was lower than that of caffeine.
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문제 정의
따라서 본 연구는 차에 함유되어 있는 2종류의 methylxanthin 류로 theobromine과 caffeine, 7종류으] catechin류로 (-)-epigallocat- echin(EGC), (-)-catechin (C), (+)-epicatechin(EC), (-)-epigallocatechin gallate(EGCG), (-)-gallocatechin(GC), (-)-epicatechin gallte(ECG) 및 (-)-catechin gallate(CG)와 4종류의 theaflavin류, theaflavin(TF), theaflavin-3-gallate(TF3G), theaflavin-3-gallate (TF3'G) 및 theafla- vin-3, 3Ldigallte(TF33G)를 HPLC로 동시에 분석하는 방법을 확립하였기에 이 방법을 이용하여 한국에서 시판되고 있는 녹차, 홍차 및 우롱차에 함유되어 있는 methylxanthin류, catechin류 및 thoaflavin류를 분석한 결과를 보고하고자 한다.
따라서 본 연구는 차의 주요 성분인 methylxanthin류, catechin 류, theaflavin류의 HPLC에 의한 동시분석법을 보고한 것으로 그 의의가 크다고 사료되며 이러한 성분이 차의 종류와 제조방법, 추출온도 및 시간 등에 따라 어떠한 영향을 미치는지에 대하여추후에 보고하고자 한다.
제안 방법
13종류의 표준 화합물을 HPLC로 분석하여 얻어진 각각의 peak 면적과 그 절대량으로부터 검량선을 작성하여 13종의 화합물을 정량하였다. 동정은 먼저 각각의 표준물질로 차 시료에서 얻어진 각 peak의 retention time비교한 후 PDA detector로 표준물질과 시료 peak의 spectrum을 해석하였다.
Column 온도는 효과적으로 각 성분을 분리시키기 위하여 정확하게 3CTC로 설정하였으며 파장은 270nm에서 분석하였다. 또한 차에 함유되어 있는 methylxantin류, catechin류 및 theaflavin류의 총 13종의 화합물을 분석한 결과, 한 시료당 90분이 소요되었으며 재현성과 정량성이 뛰어나 13종의 화합물이 완전하게 분리되었다.
HPLC분석조건은 역상(ODS)column을 이용하여 acetonitrile: 20 mM 인산완충액의 solvent 중 acetonitrile의 농도를 처음 단계 7% 에서 최종 40%까지 단계적으로 변화시켜 분당 1mL씩 용출시켜 분석하였다. Column 온도는 효과적으로 각 성분을 분리시키기 위하여 정확하게 3CTC로 설정하였으며 파장은 270nm에서 분석하였다.
동정은 먼저 각각의 표준물질로 차 시료에서 얻어진 각 peak의 retention time비교한 후 PDA detector로 표준물질과 시료 peak의 spectrum을 해석하였다. 그 후 차의 추출액에 일정량의 표준물질을 혼합하여 검출한 peak의 단일성 유무(spike법)를 확인하여 실행하였다.
동정은 먼저 각각의 표준물질로 차 시료에서 얻어진 각 peak의 retention time비교한 후 PDA detector로 표준물질과 시료 peak의 spectrum을 해석하였다. 그 후 차의 추출액에 일정량의 표준물질을 혼합하여 검출한 peak의 단일성 유무(spike법)를 확인하여 실행하였다.
따라서 methylxanthin류 및 catechin류를 양호하게 분리분석하는 데에는 colurrm의 온도가 중요한 역할을 하며 최적의 분석 columi 온도는 30-45℃이라는 것을 알았다. 따라서 본 연구에서는 column 온도를 3CTC로 설정하였으며 이는 Wang 등(29)의 연구 결과와 같았다.
본 연구에 실험한 sovent는 처음 7분간은 ace- tonitrile과 20 mM KH, PO4> 7 : 93의 비율로 일정하게 유지하여 용출(isocratic법)시키다가 그 이후부터 20분까지는 10:90, 25분까지는 15:85, 30분까지는 20:80, 45분까지는 25 : 75의 비율로 aceto- nitrile의 양을 점점 증가시키면서 용줄(linear gradient법)되도록 하였다. 또한 마지막 45-70분 동안은 acetonitrile과 20mM KHJQ를 25:75의 비율로 일정하게 유지하여 용출(isocratic법)시켰다.
본 연구는 차에 함유되어 있는 특유의 정미성분으로 methylxan:in 류, catechin류 및 theaflavin류의 총 13종의 화합물을 HPLC를 이용한 동시분석법을 확립함과 동시에 이 분석법을 이용하여 한국에서 시판되고 있는 녹차, 홍차 및 우롱차에 함유되어 있는 주요성분을 분석하였으며 그 결과는 다음과 같다.
것을 알았다. 본 연구에 실험한 sovent는 처음 7분간은 ace- tonitrile과 20 mM KH, PO4> 7 : 93의 비율로 일정하게 유지하여 용출(isocratic법)시키다가 그 이후부터 20분까지는 10:90, 25분까지는 15:85, 30분까지는 20:80, 45분까지는 25 : 75의 비율로 aceto- nitrile의 양을 점점 증가시키면서 용줄(linear gradient법)되도록 하였다. 또한 마지막 45-70분 동안은 acetonitrile과 20mM KHJQ를 25:75의 비율로 일정하게 유지하여 용출(isocratic법)시켰다.
0 x 250 nm)을 사용하였다. 유속은 분당 1 mL였으며 column 온도는 SHIMADZU(model CTO-lOAvp, Kyoto, Japan)의 column oven을 사용하여 3(TC로 설정하였다. Peak의 면적은 HITACHI chromato integrator(model D-2500, Tokyo, Japan) 를 사용하여 측정하였으며 시료는 HITACHI auto sampler(model 655A-40, Tokyo, Japan)를 사용하여 HPLC에 직접 20 uL를 주입 하였다.
회수율은 일정량의 차 잎에 일정량의 표준시약을 첨가한 경우 (A)와 첨가하지 않은 경우(B), 표준시약만을 이용한 경우(C)를 각각 HPLC로 분석하여 얻어진 면적을 다음과 같은 계산식에 따라 산출하였다.
대상 데이터
Detector는 SH1MADZU사의 Photo diode array(model SPD-M1 OAvp, Kyoto, Japan)를 사용하여 파장 270nm로 설정하였다. Column은 GL Science사의 Inertsil ODS-3v(5 pim, 4.0 x 250 nm)을 사용하였다. 유속은 분당 1 mL였으며 column 온도는 SHIMADZU(model CTO-lOAvp, Kyoto, Japan)의 column oven을 사용하여 3(TC로 설정하였다.
HPLC기기는 gradient장치가 있는 HlTACHI(model 655A-II, Tokyo, Japan)제품을 사용하였다. Detector는 SH1MADZU사의 Photo diode array(model SPD-M1 OAvp, Kyoto, Japan)를 사용하여 파장 270nm로 설정하였다.
Friedman M(USDA, Albany, USA)으로부터 증여받아 사용하였다. Theaflavin류 4종류는 Wako사, acetonitrile은 Sigma사의 HPLC용 시약을 사용하였으며 그 밖의 시약은 특급시약을 사용하였다.
본 실험에 사용한 한국 시판 녹차(Hanla Sulloc Cha, Amorepa- cific Co.), 홍차(Lipton Black Tea, Lipton Co.) 및 우롱차(Oolong Tea, Nokchawon Co.) 3종은 대구시 수성구에 위치한 월마트에 서구입하였다.
표준 CAF 및 TB^ Sigma사(St. Louis, MO, USA)제품을 사용하였으며 7종의 catechin류는 미농무성의 Dr. Friedman M(USDA, Albany, USA)으로부터 증여받아 사용하였다. Theaflavin류 4종류는 Wako사, acetonitrile은 Sigma사의 HPLC용 시약을 사용하였으며 그 밖의 시약은 특급시약을 사용하였다.
표준 시약 TB, EGC, CAF, C, EC, EGCQ GCG, ECG CQ TF, TF3Q TF3' G 및 TF33G을 각각 0.19-1.28 mg까지 정 확히칭 량하여 2 mL의 50% acetonitrile에 용해 시 켜 표준 시 료로 이용하였다. 13종의 표준 시료를 일정량 HPLC에 주입하여 stepwise 법과 gradient법에 의하여 시료를 분석한 결과는 Fig.
성능/효과
같다. Table 1에서 나타낸 바와 같이, 검량선의 직선성은 상관계수 r=0.99 이상으로 양호한 결과를 나타내었으며 최소 검출량은 13 종 모두 1.36-14.64 ng이 검출되었다.
비발효차인 녹차는 methylxanthin류 2종류와 catechin류 7종류가 검출되었다. 각각의 peak를 동정하기 위하여 실험방법에서 언급한 3종류의 동정법으로 분석한 결과, methylxanthin류에는 TB와 CAF이, catechin류는 EGC, C, EC, EGCG GCG ECG CG의 7종류가 동정되었다. 또한 녹차에는 theaflavin류는 전혀 검출되지 않았으며 양적으로는 methylxanthin 류 중에서는 CAF이, catechin류로서는 EGCG가 가장 많았으며 다음으로는 ECG가 많았으며 EGC, C, EC 및 CG는 적게 나타났다.
두 종류의 methylxanthin류, 7종류의 catechin류 및 4종류의 theaflavin류의 총 13종류의 화합물을 동시에 분석하기 위하여 여러 분석 조건을 검토한 결과, 용매의 농도를 단계적으로 바꾸는 stepwise법과 gradient법을 병행하여 분석하는 것이 가장 효과적이라는 것을 알았다. 본 연구에 실험한 sovent는 처음 7분간은 ace- tonitrile과 20 mM KH, PO4> 7 : 93의 비율로 일정하게 유지하여 용출(isocratic법)시키다가 그 이후부터 20분까지는 10:90, 25분까지는 15:85, 30분까지는 20:80, 45분까지는 25 : 75의 비율로 aceto- nitrile의 양을 점점 증가시키면서 용줄(linear gradient법)되도록 하였다.
본 연구에서도 column 온도를 50, 45, 40, 30, 25, 20 및 15°C 등의 7구간의 온도에서 실험한 결과, 50와 30°C 이하에서 분석하면 CAF의 peak 형태가 일그러져 불완전한 peak가 나타났다. 따라서 methylxanthin류 및 catechin류를 양호하게 분리분석하는 데에는 colurrm의 온도가 중요한 역할을 하며 최적의 분석 columi 온도는 30-45℃이라는 것을 알았다. 따라서 본 연구에서는 column 온도를 3CTC로 설정하였으며 이는 Wang 등(29)의 연구 결과와 같았다.
각각의 peak를 동정하기 위하여 실험방법에서 언급한 3종류의 동정법으로 분석한 결과, methylxanthin류에는 TB와 CAF이, catechin류는 EGC, C, EC, EGCG GCG ECG CG의 7종류가 동정되었다. 또한 녹차에는 theaflavin류는 전혀 검출되지 않았으며 양적으로는 methylxanthin 류 중에서는 CAF이, catechin류로서는 EGCG가 가장 많았으며 다음으로는 ECG가 많았으며 EGC, C, EC 및 CG는 적게 나타났다.
Column 온도는 효과적으로 각 성분을 분리시키기 위하여 정확하게 3CTC로 설정하였으며 파장은 270nm에서 분석하였다. 또한 차에 함유되어 있는 methylxantin류, catechin류 및 theaflavin류의 총 13종의 화합물을 분석한 결과, 한 시료당 90분이 소요되었으며 재현성과 정량성이 뛰어나 13종의 화합물이 완전하게 분리되었다.
또, column 온도를 30℃(2로 낮추면 C 와 CAF의 peak가 겹쳐진다고 보고하였다. 본 연구에서도 column 온도를 50, 45, 40, 30, 25, 20 및 15°C 등의 7구간의 온도에서 실험한 결과, 50와 30°C 이하에서 분석하면 CAF의 peak 형태가 일그러져 불완전한 peak가 나타났다. 따라서 methylxanthin류 및 catechin류를 양호하게 분리분석하는 데에는 colurrm의 온도가 중요한 역할을 하며 최적의 분석 columi 온도는 30-45℃이라는 것을 알았다.
시판 녹차, 홍차, 우롱차를 분석한 결과, 녹차와 우롱차는 2종류의 methylxantin류와 7종류의 catechin류는 검출되었으나 홍차게서 검출된 4종류의 theaflavin류는 전혀 나타나지 않았다. 이러한 결과는 차의 품질 관리 및 소비자의 차 선택에 있어 중요한 기초자료가 될 것으로 사료된다.
한편, 발효차인 홍차는 녹차에서 전혀 검출되지 않았던 theaflavin 류 4종류가 검출되어 methylxanthin류, catechin류를 포함한 총 13 종의 화합물이 동정되었다. Theaflavin류는 홍차 제조 시에 차 잎을 발효하는 과정 중 catechin류가 중합되어 형성되는 물질로서 홍차의 색과 품질을 결정하는 중요한 요인이 되는데(6, 7), 그 중 TF33G의 함량이 가장 많았다.
한편, 회수율은 표준 시약 13종류 중, TF의 회수율이 74.2%로 가장 낮았으며 그 외 12종은 모두 80% 이상으로 13종의 평균 회수율은 89.6%로 높은 회수율을 나타내었다. 이 회수율은 지금까지 차류에 관한 보고(28, 29)와 비교하면 상당히 높은 결과라 하겠다.
후속연구
이러한 결과는 차의 품질 관리 및 소비자의 차 선택에 있어 중요한 기초자료가 될 것으로 사료된다.
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