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문제 정의
- 따라서 본 논문은 새로운 항암소재를 검색하기 위하여 식품으로부터 곰팡이를 분리하고 그 대사산물을 이용하여 수종의 암세포 주의 생육에 대한 억제 물질을 탐색하고자 하며, 이를 바탕으로 새로운 항생물질 연구의 기초자료를 확보하고 결과물의 응용도를 모색하고자 실험을 수행하였다.
- 본 논문은 새로운 항암소재를 검색하기 위하여 식품으로부터 곰팡이를 분리하고 그 대사산물을 이용하여 수종의 암세포주의 생육을 대한 억제 물질을 탐색하고자 하며, 이를 바탕으로 새로운 항생물질 연구의 기초자료를 확보하고 결과물의 응용도를 모 색하고자 실험을 수행하였다. 식품으로부터 총 72종의 곰팡이를 분리 하였고, 전면 및 후면의 색, 모양, 성장속도에 따라 4가지 group로 나누어 실험에 사용하였다.
제안 방법
- 식품으로부터 총 72종의 곰팡이를 분리 하였고, 전면 및 후면의 색, 모양, 성장속도에 따라 4가지 group로 나누어 실험에 사용하였다. 그리고 그 대사산물(배양물, 균체)을 ethyl acetate로 추출하여, 총 6종의 암세포주에 대하여 MTT assay을 실험하였다. 그 결과 A, B, C, D group 중 D group에서 가장 높은 증식 억제를 확인 하였으며, D4의 증식억 제 효과가 가장 높음을 확인하였다.
- 이때 측정이 가능한 자색의 formazan 결정이 형성되는데 이는 항암제 선별이나 암 기초 연구에 널리 사용되는 방법이다. 먼저 식품 재료에 혼재 되어있는 곰팡이를 순수 분리한 다음 이들 곰팡이를 SLS 배지에 7일(30P, 250rpm)간 배양하여 배양액과 균체를 얻었고 이를 다시 ethyl acetate 추출(24 hr, 30℃, 250rpm)하여 얻은 주줄물로 암세포 증식 억제 실험에 사용하였다.
- 분리된 곰팡이를 배양하기 위해서는 SLS(synthetic low salts) 배지를 사용하였다. SLS배지를 1 L의 증류수에 녹이고 pH를 4.
- 분리되었다. 이들 곰팡이는 Fungi and Food Spoilage(14) 를 참고하여 전, 후면의 색, 성상, 성장 속도 등의 기준으로 4종으로 다시 분류하였다(Table 3, Fig. 1). 분리된 곰팡이의 색(전면 /후면)은 green(ivory), greenish yellow(yellow), white(white), black (black) 등의 4가지 색으로 나타났으며, 그 중 greenish yellow(yel- low)를 가지는 B group이 가장 많은 수를 나타내었다.
- 이들 세포들은 각각의 배지에 10% FBS(feta) bovine serum)와 1% antibiotics(penicillin/streptomycin)을 첨가하여 5% CO2가 존재하는 37℃ 배양기에서 2-3일에 한번 씩 계대 배양하여 실험에 사용하였다.
- 그 후 MTT 시약(50mg/mL)을 lOeL/well씩 넣어 4시간 더 배양한 후 1,000 rpm에서 10분간 원심분리하여 상등액을 제거한 다음, DMSO를 100μL/well씩 첨가하여 섞어준 후 micro plate reader로 550nm에서 흡광도를 측정하였다. 이때 대조군 세포수를 100%로 정하고 상대적인 세포성장 억제율을 구하였다.
- 자연계로부터 식품 유래 곰팡이를 분리하기 위하여 전국 각지에서 콩을 비롯한 된장, 메주, 사과, 맥아 등의 식품재료를 균원시료로 광범위하게 채취하였고, 이때 발효 과정 중에 생성되는 균 뿐만 아니라, 다양한 균원을 수집하기 위해 식품에서 발생한 모든 곰팡이를 수집하였다. 그리고 실험실에 보관중인 식품 발효에 관여하는 곰팡이를 실험에 사용하였으며 그 종류는 Table.
- 천연 곰팡이가 생성하는 대사산물의 항균 활성을 검토하기 위해서 배양액 10mL을 여과지(Waterman No. 1, England)로 여과하였고, 동량의 ethyl acetate를 첨가한 다음 24시간 동안 shaking incubator(30℃, 250rpm)에서 추출하고, ethyl acetate 층을 추출하여 진공농축기로 건조시켜 -2CTC에 보관하면서 필요에 따라 소량의 methanol에 녹여 수 종의 암세포주에 대한 생육억제 실험을 수행하기 위한 실험재료로 사용하였다. 이때 여과된 균체 또한 배양액과 같은 방법으로 추출하여 실험에 사용하였다.
대상 데이터
- 균 분리를 위하여 세균과 효모의 성장을 억제하는 rose-bengal 이 약 50 mg/L 첨가된 rose-bengal agar(Difco, USA) 배지를 사용하였으며, 곰팡이의 순수 분리 및 보존을 위해서는 potatoes dextrose agar(Difco, USA) 배지를 사용하였다. 그 방법으로는 시료 1g에 멸균수 10mL를 넣은 후 tube mixer로 교반하여 200 μL를 취해 rose bengal agar plate에 도말 한 후 30℃ incubator에서 3~5일간 배양하였고 단포자 분리를 행한 후 보존 하였다.
- 곰팡이를 수집하였다. 그리고 실험실에 보관중인 식품 발효에 관여하는 곰팡이를 실험에 사용하였으며 그 종류는 Table. 1과 같다.
- 본 논문은 새로운 항암소재를 검색하기 위하여 식품으로부터 곰팡이를 분리하고 그 대사산물을 이용하여 수종의 암세포주의 생육을 대한 억제 물질을 탐색하고자 하며, 이를 바탕으로 새로운 항생물질 연구의 기초자료를 확보하고 결과물의 응용도를 모 색하고자 실험을 수행하였다. 식품으로부터 총 72종의 곰팡이를 분리 하였고, 전면 및 후면의 색, 모양, 성장속도에 따라 4가지 group로 나누어 실험에 사용하였다. 그리고 그 대사산물(배양물, 균체)을 ethyl acetate로 추출하여, 총 6종의 암세포주에 대하여 MTT assay을 실험하였다.
이론/모형
- 곰팡이 대사산물의 암 세포주에 대한 세포증식 억제효과는 MTT assay(15)로 조사하였다. 먼저 각 세포수를 1 x 105 cell/mL 이 되게 한 후 96 well plate에 100μL/well씩 넣고 시료를 lOjig/ well씩 분주하여 48시간 37℃, 5% CO2 incubator에서 배양하였다.
성능/효과
- 7과 같다. 1 mg/mL 농도에서 증식억제 효과가 20-99%로 나타나 몇종을 제외한 대부분에서 증식 억제가 확인 되었으며, 그 중 D group의 증식억제 효과가 높은 것으로 확인되었다.
- 2-4와 같다. 3종의 위암세포주에 대하여 모두 증식 억제 효과가 있는 것으로 확인 되었으며, 그 중 AGS에 대한 증식억제 효과가 가장 뛰어난 것으로 확인되었다. 각 group 별 효과를 확인한 결과 D group이 높은 증식억제를 나타내었으며 그 중 D4는 배양물 추출물(1 mg/mL)이 84, 73, 36% 의 증식억제를 균체추출물(1 mg/mL)이 91, 98, 30%의 증식억제 효과를 확인할 수 있었다.
- 두 세포주에서 증식 억제는 확인할 수 있었으며, 그 중 Hepalclc7의 경우는 그 효과가 매우 우수한 것으로 확인되었다. D group의 효과가 높은 것으로 나타났으며 D9을 제외한 대부분의 D group는 95% 이상의 증식 억제를 보였다. HepG2에 대한 증식억제 효과는 각 group 별 효과는 크게 나타나지 않았고 25-60% 정도의 억제를 확인 할 수 있었다.
- D group의 효과가 높은 것으로 나타났으며 D9을 제외한 대부분의 D group는 95% 이상의 증식 억제를 보였다. HepG2에 대한 증식억제 효과는 각 group 별 효과는 크게 나타나지 않았고 25-60% 정도의 억제를 확인 할 수 있었다.
- 3종의 위암세포주에 대하여 모두 증식 억제 효과가 있는 것으로 확인 되었으며, 그 중 AGS에 대한 증식억제 효과가 가장 뛰어난 것으로 확인되었다. 각 group 별 효과를 확인한 결과 D group이 높은 증식억제를 나타내었으며 그 중 D4는 배양물 추출물(1 mg/mL)이 84, 73, 36% 의 증식억제를 균체추출물(1 mg/mL)이 91, 98, 30%의 증식억제 효과를 확인할 수 있었다.
- 그리고 그 대사산물(배양물, 균체)을 ethyl acetate로 추출하여, 총 6종의 암세포주에 대하여 MTT assay을 실험하였다. 그 결과 A, B, C, D group 중 D group에서 가장 높은 증식 억제를 확인 하였으며, D4의 증식억 제 효과가 가장 높음을 확인하였다. 위암 세포주인 KATO Ⅲ, AGS, SUN-668에 대한 증식억제 효과는 30-98%로 나타났으며, 간암 세포주인 Hepalclc7, HepG2에는 10-98%, 유방암 세포주인 MDA-MB-231에 대해서는 25-90%의 증식억제 효과를 확인하였다.
- 암세포 증식 억제효과는 Fig 5-6과 같다. 두 세포주에서 증식 억제는 확인할 수 있었으며, 그 중 Hepalclc7의 경우는 그 효과가 매우 우수한 것으로 확인되었다. D group의 효과가 높은 것으로 나타났으며 D9을 제외한 대부분의 D group는 95% 이상의 증식 억제를 보였다.
- 위암 세포주인 KATO Ⅲ, AGS, SUN-668에 대한 증식억제 효과는 30-98%로 나타났으며, 간암 세포주인 Hepalclc7, HepG2에는 10-98%, 유방암 세포주인 MDA-MB-231에 대해서는 25-90%의 증식억제 효과를 확인하였다. 배양물과 균체의 항암성은 개체에 따라 약간의 차이는 있으나, 배양물이 대부분 우수한 것으로 확인되었다.
- C group 만이 생육속도가 2일 정도로 빠른 반면 다른 group 에서 7일 정도의 생육 속도를 확인할 수 있었다. 분리된 곰팡이의 균원은 Table 4와 같으며, 된장과 메주에서 35종으로 가장 많은 균원으로 나타났다.
- 1). 분리된 곰팡이의 색(전면 /후면)은 green(ivory), greenish yellow(yellow), white(white), black (black) 등의 4가지 색으로 나타났으며, 그 중 greenish yellow(yel- low)를 가지는 B group이 가장 많은 수를 나타내었다. 전체적으로 중심에서 가장자리로 펴지면서 자라는 것을 확인할 수 있었다.
- 식품 유래 곰팡이의 배양물 및 그 균체를 ethyl acetate로 추출하여 수종의 암세포주에 대한 증식 억제 실험을 한 결과 대부분의 암세포주에서 증식억제 효과가 있음을 확인할 수 있었으며, 곰팡이 배양과정에서 생성되는 항생물질이 배양물 뿐만 아니라 균체 내에서도 있음이 실험에 의해서 확인할 수 있었다. 이는 일반적인 대사산물의 연구가 배양물에만 국한되어진 것을 균 체내에서 추출할 수 있음을 시사한다.
- 식품으로부터 분리한 곰팡이를 순수 분리한 결과 총 72종의 곰팡이가 분리되었다. 이들 곰팡이는 Fungi and Food Spoilage(14) 를 참고하여 전, 후면의 색, 성상, 성장 속도 등의 기준으로 4종으로 다시 분류하였다(Table 3, Fig.
- 위암 세포주인 AGS, KATO Ⅲ, SNU 668, 간암 세포주인 HepG2, Hepalclc7, 유방암 세포주인 MDA-MB-231 을 이용하여 곰팡이 대사산물의 성장 저해 효과를 MTT assay로 살펴본 결과 17종의 효과 있는 곰팡이 대사산물이 선별되었고 Fig. 2-7와 같다. MTT assay는 살아있는 세포가 미토콘드리아의 탈수소효소를 이용하여 황색의 MTT를 환원시키는 분광광도법이다.
- 그 결과 A, B, C, D group 중 D group에서 가장 높은 증식 억제를 확인 하였으며, D4의 증식억 제 효과가 가장 높음을 확인하였다. 위암 세포주인 KATO Ⅲ, AGS, SUN-668에 대한 증식억제 효과는 30-98%로 나타났으며, 간암 세포주인 Hepalclc7, HepG2에는 10-98%, 유방암 세포주인 MDA-MB-231에 대해서는 25-90%의 증식억제 효과를 확인하였다. 배양물과 균체의 항암성은 개체에 따라 약간의 차이는 있으나, 배양물이 대부분 우수한 것으로 확인되었다.
- 8 piM로 그 효과가 우수하다고 발표하였다. 이렇듯 곰팡이 대사산물을 이용한 논문 뿐만 아니라, 식품소재 및 식물소재와 비교 시에도 세포독성효과가 높은 것을 확인할 수 있었다. 까치버섯 water 분획물이 500, 1000 gg/ mL에서 78.
- 분리된 곰팡이의 색(전면 /후면)은 green(ivory), greenish yellow(yellow), white(white), black (black) 등의 4가지 색으로 나타났으며, 그 중 greenish yellow(yel- low)를 가지는 B group이 가장 많은 수를 나타내었다. 전체적으로 중심에서 가장자리로 펴지면서 자라는 것을 확인할 수 있었다. C group 만이 생육속도가 2일 정도로 빠른 반면 다른 group 에서 7일 정도의 생육 속도를 확인할 수 있었다.
후속연구
- 이는 일반적인 대사산물의 연구가 배양물에만 국한되어진 것을 균 체내에서 추출할 수 있음을 시사한다. 그리고 다른 천연물인 즉 한약재와 과일, 야채류와 그 효과를 비교해 보았을 때 비슷하거나 더 높은 효과가 있음을 확인할 수 있어 새로운 신물질로의 연구가 가능할 것으로 생각된다.
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