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제안 방법
- 3% H2O2가 들어있는 PBS로 30분간 반응시킨 후 세척하여 1% normal horse serum을 처리하였다. 1 차 항체 반응은 monoclonal anti-insulin(Sigma, USA)을 사용하여 4℃에서 overnight 수행하였으며, 2차 항체 반응은 biotinylated anti-mouse TgG(Vector Laboratory, USA)을 사용하여 90분간 수행하였다. 항체 반응이 끝난 조직은 avidin-biotin-horseradish peroxi dase complex(Vector Laboratory, US A)를 첨가하여 1시간 동안 반응시킨 후 DAB 용액으로 발색하여 Polymount(Polymount, USA)로 mount 하여 현미경하에서 관찰하였다.
- 각 실험군에서 적출한 췌장섬의 조직학적 형태와 인슐린의 분비 능력을 면역조직화학 분석법으로 비교 관찰하였다(Fig. 4). 정상 대조군(Fig.
- 저11형 당뇨모델 생쥐는 streptozotocin(STZ, Sigma, USA)을 투여하여 유도하였다 (18, 19). 각 실험군은 정상군(Normal group), 당뇨 대조군(STZ treatment group), 구아바 잎 추출물 투여 당뇨군(Guava A + STZ treatment group), 발효 주출물 투여 당뇨군(Guava B + STZ treat ment group)으로 구분하였고 각 실험군 당 5마리씩 체중이 비슷하도록 고려하여 무작위로 배열하였다. 추출물 투여 당뇨군은 STZ 투여 1주일 전부터 구아바 잎 추출물 혹은 발효 구아바 잎 추출물을 각각 500mg/kg의 용량으로 매일 1회씩 총 5주 동안 경구 투여하였다.
- 배양이 끝난 후 배양 혼합물은 100℃에서 30 분간 열처리한 후 동결 건조하였다. 건조 및 발효 구아바 잎 에탄올 추출물은 각 시료분말 100 g씩 70% 에탄올 용액 2L에 넣어 상온에서 5일간 추출한 후 여과 하였고, 농축한 후 동결 건조하여 제조하였다.
- 4)에 24시간 동안 고정하였다. 고정된 췌장을 흐르는 물에 5시간 이상 세척한 후 자동조직 처리기(BAVIMED, Germany)를 이용하여 탈수하였고, 파라핀을 침투 시킨 조직을 파라핀 포매기 (BAVIMED, Germany)를 이용하여 파라핀 블럭을 제작하였다. 마이크로톰(RMC products, USA)을 이용하여 5 jim 두께로 절편을 제작한 후 hematoxylin- eosin 염색하여 현미경하에서 조직을 관찰하였다.
- ) 잎은 제주도에 소재한 농장에서 구입 하였다. 구아나 잎 100 g을 직경 0.5 mm 크기로 세절하여 5 L 배양용기에 넣은 다음YM 액체배지 2L을 넣어 멸균(12VC, 20분) 한 후 상황버섯 균사체 (Phellinus lintens)를 접종하여 15일간 25℃에서 배양하였다. 이 배양 혼합액에 당밀 3%(v/v)을 첨가하여 멸균(120℃, 20분)하였고, 젖산균 배양액(Lactobacillus plan- tarum, 1.
- 잎을 발효하였다. 그리고 streptozotocin(STZ)으로 유도된 제1형 당뇨모델 생쥐에서 구아바 잎과 발효 구아나 잎 추출물이 혈당 억제 및 췌장 베티세포의 손상에 미치는 효과를 비교하였다.
- 같은 시간대에 꼬리 정맥혈에서 혈액을 채취하여 글루코닥터strip(Allmedicus, Korea)으로 측정하였다. 내당능(glucose tolerance)을 측정하기 위해서 실험이 끝난 실험동물을 16시간 이상 절식시킨 후, 포도당(2g/kg)을 복강으로 주사하였다. 복강주사 후 0, 30, 60, 120, 180 분 간격으로 꼬리 정맥에서 채혈하여 혈당을 측정하였다.
- 추출물 투여 당뇨군은 STZ 투여 1주일 전부터 구아바 잎 추출물 혹은 발효 구아바 잎 추출물을 각각 500mg/kg의 용량으로 매일 1회씩 총 5주 동안 경구 투여하였다. 당뇨 대조군은 추출물 희석에 사용된 0.9% NaCl 용액을 투여하였으며 STZ 투여 시작 일을 실험 1일로 정하였다. 당뇨군과 추출물 투여 당뇨군은 STZ을 40mg/kg의 용량으로 0.
- 9% NaCl 용액을 투여하였으며 STZ 투여 시작 일을 실험 1일로 정하였다. 당뇨군과 추출물 투여 당뇨군은 STZ을 40mg/kg의 용량으로 0.01 M citrate bufler(pH 4.5)에 용해시킨 뒤 10분 이내에 1일 1회씩 5 일간 복강 투여하였으며 정상 대조군은 STZ 대신 동량의 citrate buffer을 투여하였다.
- 고정된 췌장을 흐르는 물에 5시간 이상 세척한 후 자동조직 처리기(BAVIMED, Germany)를 이용하여 탈수하였고, 파라핀을 침투 시킨 조직을 파라핀 포매기 (BAVIMED, Germany)를 이용하여 파라핀 블럭을 제작하였다. 마이크로톰(RMC products, USA)을 이용하여 5 jim 두께로 절편을 제작한 후 hematoxylin- eosin 염색하여 현미경하에서 조직을 관찰하였다. 췌장조직의 면역화학 검사를 위해서는 고정된 조직을 20% sucrose 용액에 담근 뒤 4℃에서 24시간 보관하였다.
- 내당능(glucose tolerance)을 측정하기 위해서 실험이 끝난 실험동물을 16시간 이상 절식시킨 후, 포도당(2g/kg)을 복강으로 주사하였다. 복강주사 후 0, 30, 60, 120, 180 분 간격으로 꼬리 정맥에서 채혈하여 혈당을 측정하였다.
- 본 연구에서는 구아바 잎의 효능성 증진 및 당뇨 유발 억제 효과를 관찰하기 위해 상황버섯/ linteus) 균사체, 짖산균(Lacto- bacilus plantamm) 및 효모(Saccharomyces cerev/seae)를 사용하여 구아바 잎을 발효하였다. 그리고 streptozotocin(STZ)으로 유도된 제1형 당뇨모델 생쥐에서 구아바 잎과 발효 구아나 잎 추출물이 혈당 억제 및 췌장 베티세포의 손상에 미치는 효과를 비교하였다.
- 섭취량은 급여량에서 잔량을 감하여 계산하였다. 식이 효율(Food efficiency ratio: FER)은 실험 기간 동안 체중증가량을 같은 기간의 식이 섭취량으로 나누어 환산하였다.
- 실험동물은 온도 23 ± 2℃, 습도 50±5%, 밤과 낮을 12시간 주기로 유지시킨 배양실에서 Harlan(Harlan Teklad, USA) 사료와 물을 자유롭게 공급하며 사육하였다. 저11형 당뇨모델 생쥐는 streptozotocin(STZ, Sigma, USA)을 투여하여 유도하였다 (18, 19).
- 실험동물을 에테르로 마취시킨 후 해부하여 간과 췌장을 적출하고 4℃에서 4% paraformaldehyde(pH 7.4)에 24시간 동안 고정하였다. 고정된 췌장을 흐르는 물에 5시간 이상 세척한 후 자동조직 처리기(BAVIMED, Germany)를 이용하여 탈수하였고, 파라핀을 침투 시킨 조직을 파라핀 포매기 (BAVIMED, Germany)를 이용하여 파라핀 블럭을 제작하였다.
- 5 mm 크기로 세절하여 5 L 배양용기에 넣은 다음YM 액체배지 2L을 넣어 멸균(12VC, 20분) 한 후 상황버섯 균사체 (Phellinus lintens)를 접종하여 15일간 25℃에서 배양하였다. 이 배양 혼합액에 당밀 3%(v/v)을 첨가하여 멸균(120℃, 20분)하였고, 젖산균 배양액(Lactobacillus plan- tarum, 1.0 X 108 cells/cft)과 효모 배양액 (Saccharomyces cerevi- siae, 3.0 x 108 cells/cft)을 각각 100 mL씩 접종하여, 10일간 30℃ 에서 배양하였다. 배양이 끝난 후 배양 혼합물은 100℃에서 30 분간 열처리한 후 동결 건조하였다.
- 저 용량 Streptozotocin(STZ)으로 유도한 제 1형 당뇨 모델 생쥐에서 건조 구아바 잎과 발효 구아바 잎 에탄올 추출물의 혈당에 미치는 영향을 비교하였다. STZ로 유도된 쥐에서 발효 구아바잎 추출물(500mg/kg/day)은 투여 4주후에도 공복 혈당이 유의적으로 감소하였으며 내당능 장애도 개선되었음을 보여 주었다.
- 실험동물은 온도 23 ± 2℃, 습도 50±5%, 밤과 낮을 12시간 주기로 유지시킨 배양실에서 Harlan(Harlan Teklad, USA) 사료와 물을 자유롭게 공급하며 사육하였다. 저11형 당뇨모델 생쥐는 streptozotocin(STZ, Sigma, USA)을 투여하여 유도하였다 (18, 19). 각 실험군은 정상군(Normal group), 당뇨 대조군(STZ treatment group), 구아바 잎 추출물 투여 당뇨군(Guava A + STZ treatment group), 발효 주출물 투여 당뇨군(Guava B + STZ treat ment group)으로 구분하였고 각 실험군 당 5마리씩 체중이 비슷하도록 고려하여 무작위로 배열하였다.
- 체중 증가량 및 식이 섭취량은 실험 개시 일을 시작으로 충분한 양의 사료와 물을 급여하면서 일주일 간격으로 측정하였으며 식이 섭취량은 급여량에서 잔량을 감하여 계산하였다. 식이 효율(Food efficiency ratio: FER)은 실험 기간 동안 체중증가량을 같은 기간의 식이 섭취량으로 나누어 환산하였다.
- 각 실험군은 정상군(Normal group), 당뇨 대조군(STZ treatment group), 구아바 잎 추출물 투여 당뇨군(Guava A + STZ treatment group), 발효 주출물 투여 당뇨군(Guava B + STZ treat ment group)으로 구분하였고 각 실험군 당 5마리씩 체중이 비슷하도록 고려하여 무작위로 배열하였다. 추출물 투여 당뇨군은 STZ 투여 1주일 전부터 구아바 잎 추출물 혹은 발효 구아바 잎 추출물을 각각 500mg/kg의 용량으로 매일 1회씩 총 5주 동안 경구 투여하였다. 당뇨 대조군은 추출물 희석에 사용된 0.
- 1 차 항체 반응은 monoclonal anti-insulin(Sigma, USA)을 사용하여 4℃에서 overnight 수행하였으며, 2차 항체 반응은 biotinylated anti-mouse TgG(Vector Laboratory, USA)을 사용하여 90분간 수행하였다. 항체 반응이 끝난 조직은 avidin-biotin-horseradish peroxi dase complex(Vector Laboratory, US A)를 첨가하여 1시간 동안 반응시킨 후 DAB 용액으로 발색하여 Polymount(Polymount, USA)로 mount 하여 현미경하에서 관찰하였다.
- 혈당은 자유롭게 물을 섭취토록 하면서 16시간 절식한 후 매주 같은 시간대에 꼬리 정맥혈에서 혈액을 채취하여 글루코닥터strip(Allmedicus, Korea)으로 측정하였다. 내당능(glucose tolerance)을 측정하기 위해서 실험이 끝난 실험동물을 16시간 이상 절식시킨 후, 포도당(2g/kg)을 복강으로 주사하였다.
대상 데이터
- 구아바(Psidium guajava L.) 잎은 제주도에 소재한 농장에서 구입 하였다. 구아나 잎 100 g을 직경 0.
- 마우스 췌장 세포인 HIT-T15 세포는 한국 세포주 은행에서 분양 받아 사용하였다. 세포는 1% penicillin-streptomycin(Gibco, USA)과 10% fetal bovine serum(FBS)이 포함된 Dublecco's Min imal Eagle's Medium(DMEM)을 이용하여 5% C02와 37℃ 조건에서 배양하였다.
- 받아 사용하였다. 세포는 1% penicillin-streptomycin(Gibco, USA)과 10% fetal bovine serum(FBS)이 포함된 Dublecco's Min imal Eagle's Medium(DMEM)을 이용하여 5% C02와 37℃ 조건에서 배양하였다. 세포 생존율을 분석하기 위해 HIT-T15 세포를 96 well plate에서 24시간 배양한 후 각 추출물을 첨가하여 72시간 동안 배양하였다.
- 실험동물로는 생후 16주된 체중 약 40g의 1CR 수컷 생쥐를 사용하였다. 실험동물은 온도 23 ± 2℃, 습도 50±5%, 밤과 낮을 12시간 주기로 유지시킨 배양실에서 Harlan(Harlan Teklad, USA) 사료와 물을 자유롭게 공급하며 사육하였다.
데이터처리
- Each of the values is expressed in terms of mean ± S.E. Statistical analyses were conducted using Duncan's multiple range test (n = 5).
- E. Statistical analyses were conducted using Duncan's multiple range test (n = 5).
- 모든 실험결과는 SPSS 통계 프로그램을 이용하여 평균 ± 표준오차로 나타내었으며 in vitro 실험 결과는 t-test, 동물실험 결과는 ANOVA test 후 Duncan's multiple range test를 이용하여 p<0.05 수준에서 유의성 검정을 수행하였다.
이론/모형
- 구아바 잎 및 그 발효 추출물의 HIT-T15 세포 증식 효과를 MTT 분석법으로 측정하였다(Fig. 1). 두 추출물 모두 농도 의존적인 세포증식 효과를 나타내었다.
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