본 연구는 전기적 세포융합방법인 electrofusion을 이용하여 우량균주의 육성을 목적으로 S. cerevisiae KCTC7904와 Z. rouxii KCTC7966 간의 전기융합을 실시하였고, 융합주의 내당성과 내염성을 확인하였으며, 융합주의 선별방법을 연구하였다. 또한 융합주의 유전안정성과 RAPD-PCR 분석을 통한 융합여부의 직접적인 증거를 확인하고자 실험하였다. S. cerevisiae KCTC7904와 Z. rouxii KCTC 7966를 각각 $12{\sim}36$시간 배양하여 분리 세척한 다음 1.5% 2-mercaptoethanol로 20분간 전 처리하여 lyticase(200 U/ml)로 $30^{\circ}C$에서 최종적으로 $60{\sim}90$분간 처리했을 때, 91% 이상의 원형질체를 얻을 수 있었다. 얻어진 원형질체를 $1.0{\sim}1.2\;M$ sorbitol 용액으로 세척 한 다음 각각 1 : 1의 비율로 혼합하여 1.5 MHz/50 pV의 고주파를 가하였을때 paired protoplast가 형성되었으며, 615 $V/256\;{\mu}sec$의 고전압을 가한 결과 약 25% 정도의 융합체를 얻을 수 있었다. 선별된 융합주의 내당성과 내염성을 각각의 모균주와 비교하여 실험한 결과 50%의 glucose와 15%의 NaCl을 함유한 배지에서 모두 생육이 가능하여 각각의 균주 특성을 가지고 있음을 확인하였고, 또한 융합주를 $4^{\circ}C$에서 5개월간 보관했을 때 약 28%정도가 모균주로 복귀되었지만, 72%의 융합안정성을 나타내므로 비교적 안정한 상태를 확인할 수 있었다. 융합의 진위 여부를 증명하기 위해 유전적인 분석방법인 RAPD-PCR 법을 사용하여 실험한 결과 각각의 균주가 agarose gel 상에서 보인 band의 패턴이 융합주에서도 모두 보여짐을 확인하였다.
본 연구는 전기적 세포융합방법인 electrofusion을 이용하여 우량균주의 육성을 목적으로 S. cerevisiae KCTC7904와 Z. rouxii KCTC7966 간의 전기융합을 실시하였고, 융합주의 내당성과 내염성을 확인하였으며, 융합주의 선별방법을 연구하였다. 또한 융합주의 유전안정성과 RAPD-PCR 분석을 통한 융합여부의 직접적인 증거를 확인하고자 실험하였다. S. cerevisiae KCTC7904와 Z. rouxii KCTC 7966를 각각 $12{\sim}36$시간 배양하여 분리 세척한 다음 1.5% 2-mercaptoethanol로 20분간 전 처리하여 lyticase(200 U/ml)로 $30^{\circ}C$에서 최종적으로 $60{\sim}90$분간 처리했을 때, 91% 이상의 원형질체를 얻을 수 있었다. 얻어진 원형질체를 $1.0{\sim}1.2\;M$ sorbitol 용액으로 세척 한 다음 각각 1 : 1의 비율로 혼합하여 1.5 MHz/50 pV의 고주파를 가하였을때 paired protoplast가 형성되었으며, 615 $V/256\;{\mu}sec$의 고전압을 가한 결과 약 25% 정도의 융합체를 얻을 수 있었다. 선별된 융합주의 내당성과 내염성을 각각의 모균주와 비교하여 실험한 결과 50%의 glucose와 15%의 NaCl을 함유한 배지에서 모두 생육이 가능하여 각각의 균주 특성을 가지고 있음을 확인하였고, 또한 융합주를 $4^{\circ}C$에서 5개월간 보관했을 때 약 28%정도가 모균주로 복귀되었지만, 72%의 융합안정성을 나타내므로 비교적 안정한 상태를 확인할 수 있었다. 융합의 진위 여부를 증명하기 위해 유전적인 분석방법인 RAPD-PCR 법을 사용하여 실험한 결과 각각의 균주가 agarose gel 상에서 보인 band의 패턴이 융합주에서도 모두 보여짐을 확인하였다.
In the present study, an attempt has been made to produce hybrid yeast strains of different useful and dominant characteristics. The hybrid yeast strains were produced by electrofusion and their genetic analysis were performed by RAPD-PCR (random amplified polymorphic DNA-polymerase chain reaction)....
In the present study, an attempt has been made to produce hybrid yeast strains of different useful and dominant characteristics. The hybrid yeast strains were produced by electrofusion and their genetic analysis were performed by RAPD-PCR (random amplified polymorphic DNA-polymerase chain reaction). The protoplast of Saccharomyces cerevisiae KCTC 7904 and Zygosaccharomyces rouxii KCTC 7966 were obtained above 92% when treated with lyticase at $30^{\circ}C$ for $60{\sim}90$ min after the pretreatment of $1{\sim}2%$ 2-mercaptoethanol at $30^{\circ}C$ for $15{\sim}20$ min. The fusant was produced from paired protoplast stage under the electric pulse at high frequency conditions (1.5 MHz/50 pV, 615 $V/256\;{\mu}sec$) within glass-platinum made electrofusion chamber. Changes in RAPD patterns in mother cells and hybrid cells proved that the fusant contains two types of yeast gene originated from its parent. Furthermore, fermentation characters exhibits by the fusant cell confirmed its genetic changes. These results suggest that genetically stable hybrid yeast strains of economic importance can be produced by electrofusion technique and these electrofused yeast cells have an enormous impact in biotechnology and biomedicine.
In the present study, an attempt has been made to produce hybrid yeast strains of different useful and dominant characteristics. The hybrid yeast strains were produced by electrofusion and their genetic analysis were performed by RAPD-PCR (random amplified polymorphic DNA-polymerase chain reaction). The protoplast of Saccharomyces cerevisiae KCTC 7904 and Zygosaccharomyces rouxii KCTC 7966 were obtained above 92% when treated with lyticase at $30^{\circ}C$ for $60{\sim}90$ min after the pretreatment of $1{\sim}2%$ 2-mercaptoethanol at $30^{\circ}C$ for $15{\sim}20$ min. The fusant was produced from paired protoplast stage under the electric pulse at high frequency conditions (1.5 MHz/50 pV, 615 $V/256\;{\mu}sec$) within glass-platinum made electrofusion chamber. Changes in RAPD patterns in mother cells and hybrid cells proved that the fusant contains two types of yeast gene originated from its parent. Furthermore, fermentation characters exhibits by the fusant cell confirmed its genetic changes. These results suggest that genetically stable hybrid yeast strains of economic importance can be produced by electrofusion technique and these electrofused yeast cells have an enormous impact in biotechnology and biomedicine.
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문제 정의
따라서 본 연구에서는 식품 및 제약분야에서 많이 사용하고 있는 건조효모의 생산수율과, 고농도기질을 발효할 수 있는 효모를 전기융합 방법으로 육성하고자 발효효모인 Saccharomyces cerevisiae(S. cegkiae)와 내삼투압성 효모인 Zygosaccharomyces rouxii(Z. rouxii 전기융합을 실시하였고, 융합된 세포의 일반적인 형태, 배양특성을 관찰하였으며, 또한 융합체를 확인하기 위한 유전적 분석실험으로 RAPD-PCR 방법'"9에 관한 연구를 수행하였다.
제안 방법
cegkiae)와 내삼투압성 효모인 Zygosaccharomyces rouxii(Z. rouxii 전기융합을 실시하였고, 융합된 세포의 일반적인 형태, 배양특성을 관찰하였으며, 또한 융합체를 확인하기 위한 유전적 분석실험으로 RAPD-PCR 방법'"9에 관한 연구를 수행하였다.
RAPD patterns. PCR 처리로 얻은 최종반응산물을 전기영동하여 각각의 균주에서 다양한 band pattern을 얻었다. 융합 주의 유전자 특성을 분석하기 위해 먼저 어떤 primer가 S.
0 g//, glucose 200 g//)에 접종하여 실시하였다. 또한 실험 비교 균주로써 S. cerevisiae KCTC 7904, 1202, 1205, 1215 의 4가지 균주를 사용하여, 5.0 1 발효조 배양에서 비증식속도(specific growth rate:)를 계산하였다.
및 융합주 내성분석. 모균주와 융합주의 당내성 (0〜50%)과 염내성(0〜18%)을 확인하기 위해 각각의 균주를 glucose와 NaCl 함유된 YPD, YM-DS, YM 배지에서 12〜36 시간 배양한 후, 균체의 성장 여부를 660nm에서 흡광도를 측정하여 O.D. 값으로 비교 분석하였다.
모균주 및 융합주 발효특성. 모균주와 융합주의 탄소원 자화성을 확인하기 위해 glucose, fructose, galactose, maltose, sucrose, lactose, soluble starch, raffinose, dextrin, mannitol 를 각각 2%씩 유일한 탄소원으로 함유한 YPD(yeast extract 10 g, peptone 20 g//, dextrose 20 g//: KCTC 7904), YM-DS (yeast extract 3.0 g//, malt extract 3.0 g/Z, peptone 5.0 g/Z, dextrose 50 g//, sodium chloride 1.0 잉I: KCTC 7966), YM (yeast extract 3.0 g//, malt extract 3.0 g//, peptone 5.0 g//, dextrose 10 g//: Fusant)배지에 접종하여 48시간 동안 3℃에서 진탕배양 한 다음 탄소원 발효 유무를 세포성장으로 조사하였다.
성장한 균체를 다시 dextrose 200 g// 를 함유한 고체배지에 계대하여 성장이 빠른 균체를 선별하여 융합 주를 선별하였다. 선별된 융합주를 4℃에서 5개월간 보관시킨 다음, 무작위적으로 single colony를 선택하여 250 m/ flask에 50 m/의 YMG20(yeast extract 3.0 g//, malt extract 3.0 I, peptone 5.0 g//, dextrose 200 g/Q 배지를 넣고, 배양하여 빠른 성장속도(15시간)를 기준으로 성장된 flask와 성장이 되지 않은 ilask를 백분율(%)로 계산하여 융합주의 안정성을 확인하였다,
0 를 도말한 후, 30℃에서 7일간 배양하여 재생시킨다. 성장한 균체를 다시 dextrose 200 g// 를 함유한 고체배지에 계대하여 성장이 빠른 균체를 선별하여 융합 주를 선별하였다. 선별된 융합주를 4℃에서 5개월간 보관시킨 다음, 무작위적으로 single colony를 선택하여 250 m/ flask에 50 m/의 YMG20(yeast extract 3.
53 g/Z)을 첨 가하여 1 x cells/m/ 농도로 재현탁시킨 다음 3(rc에서 60〜90분간 처리하여 원형질체를 형성시킨다. 원형질체는 1.0-1.2 M sorbitol 용액으로 삼투압을 조절한 뒤 각각의 원형질체를 1 :1의 비율로 혼합한 혼합용액을 electrofusion chamber에 넣고 고주파를 발생시켜 paired protoplast(Fig. 1)를 형성시킨 상태에서 고전압 펄스를 반복적으로 가하여 융합체 형성을 유도하였다.
배양. 융합세포의 배양은 seed culture와 main culture 로 나누어 실시하였다. Seed culture는 먼저 분리한 융합체를 백금이로 취하여 12〜20시간 동안 3(TC에서 실시하였다.
융합주 회분배양. 융합주의 우수성을 확인하기 위해 사용된 비교 실험균주들의 회분배양에서는 5.01 fermenter- 이용하여 배양 시간에 따른 균체 농도의 변화를 건조 균체량으로 확인하였다. Seed culture는 YMG10 배지 (yeast extract 3.
융합주 RAPD-PCR 분석. 융합주의 유전자 분석은 RAPD- PCR 방법을 사용하여 각각의 모균주에서 확인되는 RAPD pattern이 융합체에서도 확인되는지를 조사하였다(Table 1).
이론/모형
Growth curve of fusant and other yeast strains. Specific growth rate was calculated using Sigma-plot software. Data represents the mean of five observations.
성능/효과
위의 조건보다 전압이 낮은 경우 융합이 거의 일어나지 않았고, 높은 경우는 protoplast가 융합 중에 터져버리는 경우가 발생하였다. 지금까지 전기융합에서는 pearl chain 을 만든 다음 융합을 시킨다고 Urano 등과 Zimmermann"끄)이 보고하였으나, 본 연구에서 실험한 결과 pearl 사min 상태에서는 융합이 전혀 이루어지지 않았고, 여러 개의 원형질체가 이루어진 pearl chain 보다는 두 개씩 연결된 paired protoplast 상태가 융합률이 훨씬 좋았음을 확인할 수 있었다. 융합 반응액을 electrofusion chamber로부터 세포에 손상이 가지 않게 micropipette으로 조심스럽게 회수하여, 이것을 미리 만들어 놓은 굳기 직전의 2% noble agar가 함유된 재생배지(10m/)에 0.
융합비율 및 재생. 1.5MHz/50pV의 고주파를 혼합 반응액에 가하였을 때 paired protoplast가 가장 많이 형성되었으며, 이 상태에서 615V/256|isec의 고전압을 가한 결과 약 25%의 융합 체를 얻을 수 있었다. 위의 조건보다 전압이 낮은 경우 융합이 거의 일어나지 않았고, 높은 경우는 protoplast가 융합 중에 터져버리는 경우가 발생하였다.
cerevisiae^: 약 12-16 시간 배양한 세포에서 원형질체 형성비율(91%)이 가장 높았고, Z rouxiK: 26〜30시간 배양한 세포에서 원형질체 형성비율(90% 이상)이 가장 좋았다. 2-mercaptoethanol이 원형질체 형성에 미치는 효과(Table 2)는 1.5%에서 20분간 처리하는 것이 가장 좋은 결과를 나타내었다. 실험에 사용한 lyticase의 적정농도는 lyticase 200U/mZ이었고, 반응 시간은 Park2의 실험을 토대로 각각 60~90분 동안 처리했을 때가 형성수율(Table 3)이 가장 높음을 확인할 수 있었다.
01 working volume으로 YMG20 배지에서 seed culture 배양액 50 m/을 접종하여 43시간 동안 배양하였다. 그 결과, 배양을 시작한지 15시간이 지나면서 융합주가 다른 균주들에 비해 월등한 성장률을 보여주었고, 건조균체량(Fusant 11.9g/Z, KCTC7904 93잉, KCTC1202 8.3 g/Z, KCTC1205 7.6 g//, KCTC1215 7.8 g)도 다른 균주에 비해 최대는 약 1.5(156.5%)배 정도 향상된 수치를 나타냄을 확인할 수 있었다(Fig. 4). 한편, 융합주를 모균주들과 위와 같은 조건으로 회분배양을 실시한 결과, 비교실험과 마찬가지로 15시간이 지나면서 모균주들에 비해 빠른 성장속도를 나타내었고, 건조 균체량을 기준으로 평가할 때 Fusant 11.
mzmT의 유전형질이 포함되었다는 것을 간접적으로 증명하는 것으로 판단되었으나, 55% 이상에서는 성장이 극히 미미하거나 정지되었다. 또한 융합주의 내염성은 glucose에 대한 내성과 마찬가지로 Z. rouxii^] 성질이 나타났으며, 배지 내 NaCl 농도를 측정한 결과 15% NaCl 농도에서도 생육이 가능한 것을 확인하였다(Table 6). 한편 융합 주의 NaCl에 대한 내성은 S.
5%에서 20분간 처리하는 것이 가장 좋은 결과를 나타내었다. 실험에 사용한 lyticase의 적정농도는 lyticase 200U/mZ이었고, 반응 시간은 Park2의 실험을 토대로 각각 60~90분 동안 처리했을 때가 형성수율(Table 3)이 가장 높음을 확인할 수 있었다.
원형질체 형성 수율 융합에 사용된 S. cerevisiae^: 약 12-16 시간 배양한 세포에서 원형질체 형성비율(91%)이 가장 높았고, Z rouxiK: 26〜30시간 배양한 세포에서 원형질체 형성비율(90% 이상)이 가장 좋았다. 2-mercaptoethanol이 원형질체 형성에 미치는 효과(Table 2)는 1.
PCR 처리로 얻은 최종반응산물을 전기영동하여 각각의 균주에서 다양한 band pattern을 얻었다. 융합 주의 유전자 특성을 분석하기 위해 먼저 어떤 primer가 S. cerevisiae 와 Z. rouxii 두 종류의 균주 모두에서 각각 특이적으로 반응하여 band를 형성시킬 수 있는지 확인하기 위해 대부분의 primer 가 각 균주와 반응하여 발현되는 것을 확인하였다. 합성 primer 가 S.
융협주의 glucose 내성 및 NaCl 내성. 융합주의 내딩성을 조사한 결과 탄소원 자화능력과 달리 내삼투압성 균주인 Z. rouxii 의 영향으로 glucose 농도로서 50%까지 생육이 가능하였다 (Table 5). 이것은 융합주에 Z.
융합주는 유전적으로 매우 불안정하여 배양도중에 친주로 복귀되는 경우가 많으므로 최소배지(YM agar)에서 1차 배양한 다음 일정기간의 계대배양을 통하여 유전적으로 안정화시켜야 한다. 융합주의 유전적 안정성을 검토하기 위해 5회 계대 배양한 융합주를 저온에서 5개월간 보관한 다음 조사한 결과 고농도의 기질 발효성과 배양시간을 기준으로 비교할 때 약 28% 정도가 친주로 복귀되었다. 융합주의 유전 안정성에 대하여는 보관조건 등의 차이에 따라 변동폭이 커질 수 있으나 Lee12), Seo23'24), Lin25) 등의 연구결과와 비교할 때 본 실험에서 얻은 융합주는 비교적 안정한 것으로 확인하였다.
4). 한편, 융합주를 모균주들과 위와 같은 조건으로 회분배양을 실시한 결과, 비교실험과 마찬가지로 15시간이 지나면서 모균주들에 비해 빠른 성장속도를 나타내었고, 건조 균체량을 기준으로 평가할 때 Fusant 11.0g//, S. cerevisiae 8.0 g Z. rouxii 6.0 g와 같이 평균 157.1%(최소 138.1%, 최대 176.1%)향상된 결과를 얻을 수 있었다(Fig. 5).
rouxii 두 종류의 균주 모두에서 각각 특이적으로 반응하여 band를 형성시킬 수 있는지 확인하기 위해 대부분의 primer 가 각 균주와 반응하여 발현되는 것을 확인하였다. 합성 primer 가 S. cerevis/ae와 Z 에서 특이하게 반응하여 band를 형성하였고, 두 균주에서 특이성을 보인 primer를 융합체에 적용하여 같은 조건에서 실험한 결과, 융합주는 모균주가 가진 band를 모두 발현함으로써 모균주의 band pattern 특성을 모두 가지고 있음을 Fig. 3과 같이 확인할 수 있었다. 그러나 각 모 균주에서는 band가 형성되었지만 융합주가 각 모균주의 band를 모두 가지지 못한 경우도 발생하였는데 이것은 RAPD법에 의한 polymorphism은 한 품종에서는 나타나더라도 다른 품종에서는 나타나지 않거나 동일 품종에 서도 재현성의 변이가 있을 수 있기 때문이라고 추측된다.
후속연구
tropicalis^} 융합 주가 8%의 내성을 보였다는 Se23)의 결과에 비해 약 2배 정도 높은 내성으로 내삼투압성이 요구되는 분야에서의 활용이 예상된다. 즉 일반적인 성장과 탄소원의 자화능력은 대표적인 효모균주인 S. cerevisiae의 성질을 가지면서 고농도의 당과 염에 대한 내성을 갖는 개량효모 균주를 이용하여 발효시간과 풍미를 개선시킨 양조 분야의 응용가능성이 클 것으로 사료된다.
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