조각인(Gleditsiae Semen)은 동아시아 지역에서 장 기능을 향상시키는 등의 여러 가지 민간요법으로 사용되는 한약재이다. 본 연구에서는 조각인의 항암활성을 검색하기 위한 목적으로 methanol, ethanol, acetone으로 추출한 뒤, 인간 유래의 대장암 세포주 HT-29에 처리하여 각 추출물의 암세포 성장 억제능을 확인하기 위하여 MTT-dye reduction assay를 이용하여 실험하였다. 그 결과, methanol 추출물에서 가장 높은 세포독성을 확인할 수 있었고, ethanol 추출물에서도 비교적 높은 암세포 성장 억제능을 볼 수 있었으나, acetone 추출물에서는 거의 세포독성이 나타나지 않았다. 그리고 추출물들을 $25\;{\mu}g/ml$의 농도로 암세포에 처리하여 위상차 현미경으로 세포주의 형태학적 변화를 관찰한 결과에서도 methanol 추출물에서의 활성이 가장 강력하게 나타남을 알 수 있었다. 조각인의 항암활성물질들의 용매특성을 알아보기 위하여 methanol 추출물을 극성도에 따라 용매분획 하여 분리한 각 분획물의 세포독성을 확인한 결과, water층 분획물에서 농도 의존적으로 세포독성을 나타냄을 확인하였다. 또한 조각인의 water층 분획물은 또 다른 대장암 세포주인 SW620에 대해서도 대조군에 비해 $25\;{\mu}g/ml$의 농도에서 2배 정도 높은 항암활성을 나타내고 있음을 MTT reduction assay와 LDHrelease assay를 통하여 확인 할 수 있었다.
조각인(Gleditsiae Semen)은 동아시아 지역에서 장 기능을 향상시키는 등의 여러 가지 민간요법으로 사용되는 한약재이다. 본 연구에서는 조각인의 항암활성을 검색하기 위한 목적으로 methanol, ethanol, acetone으로 추출한 뒤, 인간 유래의 대장암 세포주 HT-29에 처리하여 각 추출물의 암세포 성장 억제능을 확인하기 위하여 MTT-dye reduction assay를 이용하여 실험하였다. 그 결과, methanol 추출물에서 가장 높은 세포독성을 확인할 수 있었고, ethanol 추출물에서도 비교적 높은 암세포 성장 억제능을 볼 수 있었으나, acetone 추출물에서는 거의 세포독성이 나타나지 않았다. 그리고 추출물들을 $25\;{\mu}g/ml$의 농도로 암세포에 처리하여 위상차 현미경으로 세포주의 형태학적 변화를 관찰한 결과에서도 methanol 추출물에서의 활성이 가장 강력하게 나타남을 알 수 있었다. 조각인의 항암활성물질들의 용매특성을 알아보기 위하여 methanol 추출물을 극성도에 따라 용매분획 하여 분리한 각 분획물의 세포독성을 확인한 결과, water층 분획물에서 농도 의존적으로 세포독성을 나타냄을 확인하였다. 또한 조각인의 water층 분획물은 또 다른 대장암 세포주인 SW620에 대해서도 대조군에 비해 $25\;{\mu}g/ml$의 농도에서 2배 정도 높은 항암활성을 나타내고 있음을 MTT reduction assay와 LDH release assay를 통하여 확인 할 수 있었다.
The present study describes the preliminary evaluation of the cytotoxicity from Gleditsiae Semen extracts. G. Semen was extracted with methanol, ethanol, and acetone, and then cytotoxic effect of these extracts was measured by the MTT reduction assay and phase-contrast microscopy on the HT-29 human ...
The present study describes the preliminary evaluation of the cytotoxicity from Gleditsiae Semen extracts. G. Semen was extracted with methanol, ethanol, and acetone, and then cytotoxic effect of these extracts was measured by the MTT reduction assay and phase-contrast microscopy on the HT-29 human colon carcinoma cells. Among these extracts, methanol extract showed the highest cytotoxic activity on the HT-29 cells. The methanol extract was further fractionated with n-hexane, diethyl ether, ethyl acetate, and water layer according to the degree of polarity. The water layer showed the highest inhibitory activity on the growth of HT-29 cells, but the other fractions indicated the low cytotoxic activity. In addition, water layer also showed the cytotoxic activity against SW620 human colon carcinoma cells. Based on these results, we suggest that extracts of G. Semen may contain bioactive materials and are potential candidates as chemotherapeutic agents against human colon carcinoma cells.
The present study describes the preliminary evaluation of the cytotoxicity from Gleditsiae Semen extracts. G. Semen was extracted with methanol, ethanol, and acetone, and then cytotoxic effect of these extracts was measured by the MTT reduction assay and phase-contrast microscopy on the HT-29 human colon carcinoma cells. Among these extracts, methanol extract showed the highest cytotoxic activity on the HT-29 cells. The methanol extract was further fractionated with n-hexane, diethyl ether, ethyl acetate, and water layer according to the degree of polarity. The water layer showed the highest inhibitory activity on the growth of HT-29 cells, but the other fractions indicated the low cytotoxic activity. In addition, water layer also showed the cytotoxic activity against SW620 human colon carcinoma cells. Based on these results, we suggest that extracts of G. Semen may contain bioactive materials and are potential candidates as chemotherapeutic agents against human colon carcinoma cells.
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문제 정의
본 연구에서는 대장암 세포주에 대해서 항암활성을 가지는 천연 항암물질을 탐색하기 위한 목적으로 지금까지 연구된 바 없는 조각인의 추출물을 이용하여 대장암 세포주에 대한 항암 활성 효과를 밝히고자 하였다.
제안 방법
Methanol 추출물에서 다음 단계의 분획물을 얻기 위하여 용매의 극성을 달리하여 순차적으로 용매분획 하였다. 즉, ”-hexane과 물을 같은 비율로 분획 추출하여 "-hexane층을 분리하였고, 동일한 방법으로 diethyl ether, ethyl acetate 및 물층으로 분획하여 얻어진 각각의 용매 분획물을 감압 농축시켜용매를 제거한 분획물을 얻었다. 각 추출물 및 분획물은 5 mg/ mlS.
The cells were treated with various concentrations of each extracts of G Semen (A: methanol extract, B: ethanol extract, C: acetone extract). After MTT assay, the MTT reduction rate (means ± S.D. of triplicate determination) were calculated by setting each of control survivals in the absence of G. Semen extracts. ***significant vs.
A: hexane layer, B: diethyl ether layer, C: ethyl acetate layer, D: water layer. After MTT assay, the MTT reduction rate (means ± S.D. of triplicate determination) were calculated by setting each of control survivals in the absence of extracts. ***signiflcant vs.
Cytotoxic effect was determined using MTT reduction assay and LDH release assay (A: MTT assay, B: LDH assay). After MTT assay, the MTT reduction rate (means ± S.D. of triplicate determination) were calculated by setting each of control survivals in the absence of water extracts. Data were normalized to the activity of LDH release from vehicle-treated cells (100%) and expressed as percentage of the control (obtained separate plating).
24시간 동안 배양한 후, 각 well에 PBS 완충액에 녹인 MTT(5 mg/m/) 용액을 10B씩 첨가하여 다시 1시간 동안 배양 시킨다. Fonnazan 형성을 확인한 후, 배지를 완전히 제거하고, well 바닥에 형성된 t&mazan을 녹이기 위해 100 의 DMSO를 첨가한 후, ELISA reader(Model 680, BioRad, USA)를 이용하여 540nm에서 흡광도를 측정하여 조각인 추출물을 처리하지 않고 배양시킨 대조군 세포를 100%로 하였을 때의 상대적인 세포 성장 억제율로 나타내었다.
LDH 측정에 의한 세포독성 확인.
5% Triton X-100용액을 50 B 첨가하여 40rpm으로 10분 동안 shaking시켜 의도적으로 세포벽을 깨트린 다음, 같은 방법으로 LDH reagent 50 μ/를 첨가하여 반응 시키고, 반응이 끝나면 반응 정지액을 넣은 뒤, 540 nm에서 흡광도를 측정하였다. LDH에 의한 세포독성의 백분율은 배양액과 살아있는 세포에서 유리된 총 LDH에 대한 배양액으로 부터 유리된 LDH의 값으로 계산하여 무처리 대조구와 비교한 값을 나타내었다.
MTT 분석을 통한 세포 생존율 측정.
여과된 추출 여액은 회전 감압농축기(EYELA N-1000, Tokyo Rikakikai Co, Tokyo, Japan)# 이용하여 4(TC에서 감압 농축하여 각 용매 추출물을 얻었다. Methanol 추출물에서 다음 단계의 분획물을 얻기 위하여 용매의 극성을 달리하여 순차적으로 용매분획 하였다. 즉, ”-hexane과 물을 같은 비율로 분획 추출하여 "-hexane층을 분리하였고, 동일한 방법으로 diethyl ether, ethyl acetate 및 물층으로 분획하여 얻어진 각각의 용매 분획물을 감압 농축시켜용매를 제거한 분획물을 얻었다.
SW620 세포주를 IxlV cells/m/로 맞춘 후, 100씩 96 well plate에 분주하여 C0 incubatoi에서 24시간 동안 배양한 뒤, 1, 5, 10, 25 /m/의 농도로 제조한 조각인 분획 추출물을 세포주에 처리하였다. 다시 24시간 동안 배양한 후, 배양액 을 새로운 96 well plate에 50 μ/ 분주하고, 이 배 양액 에 LDH reagent를 50 씩 첨가하여 상온에서 정 치시 킨 후, 20분간 반응하였다.
2와 같다. 각용매별 조각인 추출물을 1, 5, 10, 25 /rW의 농도로 각각 대장암 세포주에 처리하고 MTT reduction assay 방법을 통하여무처리한 대조군과 비교하여 활성을 확인하였다(Fig. 1). 그 결과, methanol 추출물에서 농도 의존적으로 아주 강력한 세포독성을 확인할 수 있었고, ethanol 추출물 역시 높은 항암 활성을 나타내었다.
세포주를 Ixlb cells/mE 맞추고 96 well plate에 각각 100 씩 첨가하여 24시간 동안 37℃, CO2 incubatoi에서배양한 후, DMSO에 녹인 각 용매별 추출물 및 분획물을 각각 1, 5, 10, 25 μg/m/의 농도로 제조하여 암세포주에 처리하였다. 24시간 동안 배양한 후, 각 well에 PBS 완충액에 녹인 MTT(5 mg/m/) 용액을 10B씩 첨가하여 다시 1시간 동안 배양 시킨다.
외에서 자생하고 있는 435가지의 약용식물 추출물을 대상으로 인간 대장암 세포주의 성장을 효과적으로 저해하는 천연추출물을 찾는 탐색을 시도하였다. 그 결과 조각인(Gleditsiae Semen) 추출물로부터 강력한 대장암 세포주에 대한 세포독성을 확인할 수 있었다.
1%로 활성이 크게 증가하지 않았고 대체적으로 낮은 암세포 증식 억제 활성을 보임을 확인하였다. 이러한 조각인의 각용 매별 추출물이 HT-29 세포주에 대해 어떠한 형태학적 변화를 일으키는지 확인하기 위하여 위상차 현미경을 이용하여 무 처리한 대조군과의 비교를 통해 세포의 형태를 관찰하였다. 각용 매별 추출물을 25 의 농도로 각각 처리한 결과, 무 처리한 대조군과 비교하였을 때 확연한 형태학적 변화가 나타났다 (Fig.
조각인 5 g에 methanol, ethanol, acetone 용매를 각각 100 tn/씩 가하여 상온에서 3일 동안 정치 시켜 주줄 한 후, 여과지(5C. 110 mm, Advantec, Tokyo Roshi Kaisha, Ltd., Tokyo, Japan)로 여과하였다. 여과된 추출 여액은 회전 감압농축기(EYELA N-1000, Tokyo Rikakikai Co, Tokyo, Japan)# 이용하여 4(TC에서 감압 농축하여 각 용매 추출물을 얻었다.
조각인 분획 추출물의 세포독성을 측정하기 위한 방법으로 LDH release assay를 실시하였다. SW620 세포주를 IxlV cells/m/로 맞춘 후, 100씩 96 well plate에 분주하여 C0 incubatoi에서 24시간 동안 배양한 뒤, 1, 5, 10, 25 /m/의 농도로 제조한 조각인 분획 추출물을 세포주에 처리하였다.
조각인의 각 용매별 추출물 및 분획물을 다양한 농도로 처리했을 때, HT-29 세포주의 형태학적인 변화를 관찰하기 위해 6 well plate에 1 x 105 cells/well로 2 m/씩 첨가하여 24시간 동안 배양하여, 적당한 농도로 제조 된 추출물 및 분획물을 12시간 처리한 후, phase-contrast microscope (Nikon, Japan)를 이용하여 변화된 HT-29 세포주의 형태학적 특징을 촬영하였다.
조각인의 세포독성을 나타내는 물질의 특성을 확인하기 위하여 각 용매별 추출물 중에서 세포독성 효과가 가장 좋았던 methanol 추출물을 극성도에 따라 Fig. 3과 같이 w-hexane, diethyl ether, ethyl acetate 및 water 순서로 용매 분획하여 그 분획물을 얻었다. 각 분획물 의용 매를 제거한 1, 5, 10, 25 pig/m/의 농도로 제조하여 HT- 29 세포주에 처리하였을 때의 세포독성을 나타낸 결과 Fig.
대상 데이터
(St Louis, MO, USA)로 부터 구입하였으며, LDH(Lactate Dehydrogenase) release assay kit는 Wako Pure Chemical Industries, Ltd.(Osaka, Japan)로부터 구입하였다. 그 외의 연구에 사용된 여러가지 용매 및 시약은 모두 일급 이상의 등급을 사용하였다.
각 추출물 및 분획물은 5 mg/ mlS. DMSO(dimethyl sulfoxide)에 녹여 적당한 농도로 희석하여 실험에 사용하였다.
HT-29 세포주에 대해 높은 세포독성을 보인 water 분획물이 다른 종류의 암세포에서도 이와 같은 암세포 성장억제 능을 나타내는지 확인하기 위하여 HT-29 세포주와는 다른 인간 유래의 대장암 세포주인 SW620 세포주를 이용하여 다음과 같은 실험을 실시하였다. Fig.
본 실험에 사용한 조각인은 2006년 5월경 남 마산시 (주)금강제약으로부터 제공받아 추출.분획하여 실험에 사용하였다.
그 결과 조각인(Gleditsiae Semen) 추출물로부터 강력한 대장암 세포주에 대한 세포독성을 확인할 수 있었다. 본 연구에 사용된조각인은 주엽나무(Gleditsia japonica Miquel var. koraiensis Nakai)의 씨에 해당하는 것으로써 주로 풍을 다스리고 장을 윤택하게 한다. 하여 민간에서 약용으로 사용한다.
본 연구팀에서는 국내.외에서 자생하고 있는 435가지의 약용식물 추출물을 대상으로 인간 대장암 세포주의 성장을 효과적으로 저해하는 천연추출물을 찾는 탐색을 시도하였다.
조각인의 세포독성을 실험하기 위해 한국세포주은행(KCLB, Seoul)으로부터 인간 대장암 유래의 세포주 HT-29 와 SW620을 분양받아 본 실험에 사용하였다. 세포배양을 위해 RPMI1640 medium에 10% fetal bovine serum(FBS) 및 100 unit/m/의 penicillin, 100μg/mZ의 streptomycin을 첨가하여 사용하였고, 95%의 습도가 유지되는 37℃, 5% CO2 incubator (MCO-18AIC, SANYO, Osaka, Japan)에서 배양하였다.
데이터처리
처리하였다. 각 항목에 따라 백분율과 평균치 土 표준편차(SD)를 구하고 각 추출물의 세포독성 정도를 비교하기 위해 one-way 분산분석 (ANOVA)을 시행하여 F값을 구하고 Schefife's test를 이용하여 대조군과 각 구간의 유의성 차이를 검증하였다. 통계적 유의성은 5% 수준에서 평가하였다.
각 항목에 따라 백분율과 평균치 土 표준편차(SD)를 구하고 각 추출물의 세포독성 정도를 비교하기 위해 one-way 분산분석 (ANOVA)을 시행하여 F값을 구하고 Schefife's test를 이용하여 대조군과 각 구간의 유의성 차이를 검증하였다. 통계적 유의성은 5% 수준에서 평가하였다.
이론/모형
Antiproliferation effect of water fraction from G Semen in SW620 cells. Cytotoxic effect was determined using MTT reduction assay and LDH release assay (A: MTT assay, B: LDH assay). After MTT assay, the MTT reduction rate (means ± S.
조각인 추출물 및 분획물의 세포독성을 측정하기 위하여 MTT reduction assay를 실시하였다. 세포주를 Ixlb cells/mE 맞추고 96 well plate에 각각 100 씩 첨가하여 24시간 동안 37℃, CO2 incubatoi에서배양한 후, DMSO에 녹인 각 용매별 추출물 및 분획물을 각각 1, 5, 10, 25 μg/m/의 농도로 제조하여 암세포주에 처리하였다.
성능/효과
성장을 효과적으로 억제할 수 있는 방법을 개발함으로써 대장암 세포뿐만 아니라 대부분의 암세포들의 성장을 효과적으로 억제시키기 위해서 많은 연구를 수행하고 있다.4) 암의 치료에 있어서 또 하나의 문제점으로 지적되는 것이 바로 항암제의 자체독성이다. 이러한 항암제의 자체 독성으로 암세포는 물론 정상세포까지 손상시키게 되고, 이로 인하여 오심.
실험을 실시하였다. Fig. 6A와 같이 MTT reduction assay를 통하여 water 분획물을 각각 1, 5, 10, 25 μg/m/의 농도로 처리한 후 SW620 세포주에 대한 세포독성을 확인한 결 과, 농도 의존적으로 높은 세포독성을 가짐을 확인할 수 있었고, 특히 25 m/의 농도로 처리했을 때는 42.0%로 강력한 암세포 생육저해능을 가지는 것을 알 수 있었다. 또한 LDH release assay를 통하여 세포독성을 확인한 결과, 마찬가지로 25 μg/mZ의 농도에서 세포독성을 보임을 알 수 있었다(Fig.
3과 같이 w-hexane, diethyl ether, ethyl acetate 및 water 순서로 용매 분획하여 그 분획물을 얻었다. 각 분획물 의용 매를 제거한 1, 5, 10, 25 pig/m/의 농도로 제조하여 HT- 29 세포주에 처리하였을 때의 세포독성을 나타낸 결과 Fig. 4 와 같이 water층 분획물에서 가장 높은 항암 활성을 가짐을 확인 할 수 있었다. 즉, wat&층 분획물을 처리했을 때 농도 의존적으로 암세포의 생육이 억제 되었으며, 특히 25 μg/mZ의 농도로 처리했을 때의 활성을 26.
이러한 조각인의 각용 매별 추출물이 HT-29 세포주에 대해 어떠한 형태학적 변화를 일으키는지 확인하기 위하여 위상차 현미경을 이용하여 무 처리한 대조군과의 비교를 통해 세포의 형태를 관찰하였다. 각용 매별 추출물을 25 의 농도로 각각 처리한 결과, 무 처리한 대조군과 비교하였을 때 확연한 형태학적 변화가 나타났다 (Fig. 2). Methanol과 ethanol 주출물에서 대조군과 비교하여 볼 때, 전체적인 세포의 수가 적을 뿐만 아니라 그 형태가 응축되어 있고, 불규칙적인 형태를 가지면서 세포사멸이 나타난 것을 관찰할 수 있다.
외에서 자생하고 있는 435가지의 약용식물 추출물을 대상으로 인간 대장암 세포주의 성장을 효과적으로 저해하는 천연추출물을 찾는 탐색을 시도하였다. 그 결과 조각인(Gleditsiae Semen) 추출물로부터 강력한 대장암 세포주에 대한 세포독성을 확인할 수 있었다. 본 연구에 사용된조각인은 주엽나무(Gleditsia japonica Miquel var.
1). 그 결과, methanol 추출물에서 농도 의존적으로 아주 강력한 세포독성을 확인할 수 있었고, ethanol 추출물 역시 높은 항암 활성을 나타내었다. 그러나 acetone 추출물에서는 조각인 추출물을 농도별로 처리하여도 대조군과 비교하여 활성이 크게 증가하지 않는 것으로 보아 조각인 acetone 추출물에서는 아주 낮은 세포독성을 보이는 것을 알 수 있었다.
그 결과, methanol 추출물에서 농도 의존적으로 아주 강력한 세포독성을 확인할 수 있었고, ethanol 추출물 역시 높은 항암 활성을 나타내었다. 그러나 acetone 추출물에서는 조각인 추출물을 농도별로 처리하여도 대조군과 비교하여 활성이 크게 증가하지 않는 것으로 보아 조각인 acetone 추출물에서는 아주 낮은 세포독성을 보이는 것을 알 수 있었다. 즉, 조각인 methanol 추출물을 25|ig/nV로 세포주에 처리했을 때 암세포 생존율은 10.
6B). 따라서 조각인은 다양한 종류의 대장암 세포주에 대해 강력한 항암 활성을 나타내는 것을 확인할 수 있었다.
3%보다 3배 정도로 세포독성 효과가 증가한 것을 알 수 있었다. 또한 Fig. 5와 같이 water층 분획물을 농도별로 처리한 후, 위상차 현미경을 이용하여 암세포 성장 억제 효과를 확인한 결과 세포응축이나 단일화와 같은 형태학적인 변화를 보임을 알 수 있었다. 따라서 조각인의 세포독성 효과를 나타내는 물질은 아주 강한 극성의 성질을 나타낸다는 것을 강력하게 시사하고 있었다.
0%로 강력한 암세포 생육저해능을 가지는 것을 알 수 있었다. 또한 LDH release assay를 통하여 세포독성을 확인한 결과, 마찬가지로 25 μg/mZ의 농도에서 세포독성을 보임을 알 수 있었다(Fig. 6B). 따라서 조각인은 다양한 종류의 대장암 세포주에 대해 강력한 항암 활성을 나타내는 것을 확인할 수 있었다.
3%로 높은 세포독성을 나타내었지만, methanol 추출물에 비해서는 상대적으로 낮은 세포독성을 보였다. 반면 acetone 추출물을 1, 5, 10, 25)의 농도로 처리했을 때, 각각 91.6, 91.2, 88.3, 85.1%로 활성이 크게 증가하지 않았고 대체적으로 낮은 암세포 증식 억제 활성을 보임을 확인하였다. 이러한 조각인의 각용 매별 추출물이 HT-29 세포주에 대해 어떠한 형태학적 변화를 일으키는지 확인하기 위하여 위상차 현미경을 이용하여 무 처리한 대조군과의 비교를 통해 세포의 형태를 관찰하였다.
4 와 같이 water층 분획물에서 가장 높은 항암 활성을 가짐을 확인 할 수 있었다. 즉, wat&층 분획물을 처리했을 때 농도 의존적으로 암세포의 생육이 억제 되었으며, 특히 25 μg/mZ의 농도로 처리했을 때의 활성을 26.4%로 1 μg/mZ로 처리했을 때인 79.3%보다 3배 정도로 세포독성 효과가 증가한 것을 알 수 있었다. 또한 Fig.
그러나 acetone 추출물에서는 조각인 추출물을 농도별로 처리하여도 대조군과 비교하여 활성이 크게 증가하지 않는 것으로 보아 조각인 acetone 추출물에서는 아주 낮은 세포독성을 보이는 것을 알 수 있었다. 즉, 조각인 methanol 추출물을 25|ig/nV로 세포주에 처리했을 때 암세포 생존율은 10.3%로 1 μg/mZ로 처리했을 때의 91.4%에 비해 약 9배 이상의 증가된 세포독성을 확인할 수 있었다. Ethanol 추출물에서도 조각인 추출물의 농도가 25 7일 때의 활성이 15.
Methanol과 ethanol 주출물에서 대조군과 비교하여 볼 때, 전체적인 세포의 수가 적을 뿐만 아니라 그 형태가 응축되어 있고, 불규칙적인 형태를 가지면서 세포사멸이 나타난 것을 관찰할 수 있다. 특히 methanol 추출물을 처리한 세포에서는 더 많은 세포사멸이 일어나는 것으로 보아 MTT reduction assay 결과와 동일한 양상으로 조각인 methanol‘추출물에서 암세포 성장 억제 능력이 가장 강함을 확인할 수 있었다. 한편 acetone 추출물을 처리했을 때는 세포사멸이 다른 추출물에 비해 적고, 세포독성을 거의 나타내지 않았다.
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