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문제 정의
- 본 연구에서는 해양생물자원으로부터 항암 활성을 가지는 물질을 탐색하기 위한 목적으로 미더덕의 동결건조물을 이용하여 여러 용매별로 추출물을 제조하고 인간 유래의 다양한 암세포에 처리하여 세포독성을 확인함으로 해서 미더덕 추출물이 가지는 항암활성을 조사하였다.
- , Tokyo, Japan)로 37℃에서 농축하였다. 이 중 가장 강력한 활성을 가지는 ethanol 추출물을 이용하여 정제수율을 높여 암세포 성장억제효과를 확인하기 위한 목적으로 용매의 극성에 따라 순차적으로 용매 분획하였다. 즉, n-hexane과 물을 같은 비율로 하여 분획하여 분획여두에서 ahexane 층을 분획하고, 동일한 방법으로 남은 수용액 층에 diethyl ether, ethyl acetate, water 층으로 분획하여 각각의 용매 분획물을 얻어 감압농축하였다(Fig.
제안 방법
- 세포주를 1×105 cells/well의 농도로 맞추고 96 well plate에 각각 100 mL씩 첨가하여 24시간 동안 37℃, 5% CO2 incubator 에서 배양한 후(20), DMSO에 녹인 미더덕 용매별 추출 분획물 시료를 각각 10, 50, 100, 500 μg/mL의 농도로 처리하였다. 24시간동안 배양한 후 각 well에 PSB 완충액에 녹인 MTT(5 mg/mL) 용액을 10 μ1.씩 첨가하여 1시간동안 다시 배양시 킨 후, well 바닥에 형성된 formazan이 흩어지지 않게 상등액을 제거하고 DMSO 100 μL 첨가하여 녹인 후 ELISA reader(Model 680, BioRad, USA)를 이용하여 540 nm에서 흡광도를 측정하여 대조 구세 포수를 100%로 하였을 때 상대적 인 세포성장 억제율을 구하였다.
- 미더덕 용매추출물에 대한 HT-29 세포주의 형태학적 인 관찰을 위해 6 well plate에 1×105 cells/well로 24시간동안 37℃, 5% CO2 incubator에서 배양한 후, DMSO에 녹인 미더덕 용매별 추출물을 각각 500 μg/mL의 농도로 처리하여 24 시간 후에 inverted microscope(TS 100-F, Nikon, Tokyo, Japan)로 각 well의 세포형태를 관찰하고, 100배로 사진을 촬영하였다.
- 조사하였다. 세포주를 1×105 cells/well의 농도로 맞추고 96 well plate에 각각 100 mL씩 첨가하여 24시간 동안 37℃, 5% CO2 incubator 에서 배양한 후(20), DMSO에 녹인 미더덕 용매별 추출 분획물 시료를 각각 10, 50, 100, 500 μg/mL의 농도로 처리하였다. 24시간동안 배양한 후 각 well에 PSB 완충액에 녹인 MTT(5 mg/mL) 용액을 10 μ1.
- 건조된 시료는 다시 분쇄기를 이용하여 분말로 만들어 27 mesh의 체로 걸러 분말의 크기를 일정하게 하였다. 시료 5g을 100 mL의 water, methanol, ethanol, acetone 용매를 가하여 진탕배양기 (HB-201S, (주)한백, 한국)에서 25℃, 100 rpm의 조건으로 48시간 추출하였다. 각각의 추출물은 여과지 (Whatman No.
- 신선한 미더덕을 동결건조하여 분말로 만들어 water, MeOH, EtOH 및 acetone의 용매로 추출하여 항암활성을 조사하였다. 대장암 세포주 HT-29에 대한 미더덕 추출물의 암세포증식 억제효과는 ethanol 추출물이 500 pg/mL 농도에서 45.
- 신선한 미더덕을 믹서기(Mixer MC 811C, (주)노비 타, 한국)로 분쇄한 후, 심온동결기 (Upright Deep freezer VX 530, 한국)로 -70℃에서 하룻밤 저장하고, 동결건조기(Freeze Dryer FD 5512, (주)일신랩, 한국)로 4일동안 완전히 건조시켰다. 건조된 시료는 다시 분쇄기를 이용하여 분말로 만들어 27 mesh의 체로 걸러 분말의 크기를 일정하게 하였다.
- 용매 분획물 중에서 가장 높은 항암활성을 보인 diethyl ether 분획물의 항암활성 스펙트럼을 확인하기 위하여 HT-29와 같은 인간대장암 유래의 세포주 SW620, 자궁경부암 세포 HeLa 및 유방암 세포 MCF-7에 처리하여 항암 활성을 확인하였다(Fig. 5). HeLa세포에서는 50 μg/mL 농도에서도 26.
- 이러한 형태학적인 변화에 따라 각 용매에 대한 추출물의 항암 효과를 조사하기 위해 MTT reduction assay방법 (18)을 이용하여 추출물을 처리하지 않은 대조구와 비교하여 암세포 성장 억제효과를 확인하였다(Fig. 3). 미더덕 용매별 추출물을 10, 50, 100, 500 μg/mL의 농도로 각각 처리하였을 때 acetone과 water 추출물은 500 μg/mL의 농도에서 52.
- 이 중 가장 강력한 활성을 가지는 ethanol 추출물을 이용하여 정제수율을 높여 암세포 성장억제효과를 확인하기 위한 목적으로 용매의 극성에 따라 순차적으로 용매 분획하였다. 즉, n-hexane과 물을 같은 비율로 하여 분획하여 분획여두에서 ahexane 층을 분획하고, 동일한 방법으로 남은 수용액 층에 diethyl ether, ethyl acetate, water 층으로 분획하여 각각의 용매 분획물을 얻어 감압농축하였다(Fig. 1). 각 추출물 및 분획 물은 50 mg/mL의 농도로 DMSO(di-methyl sulfoxide)에 녹여 적당한 농도로 희석해서 실험에 사용하였다.
대상 데이터
- 구입한 미더덕의 이물질을 제거하고 물로 깨끗이 여러 번 씻어 물기를 제거한 후, 분쇄기(Mixer MC 811C, (주)노비타, 한국)로 분쇄하여 사용하였다. 암세포 성장억제효과 실험에 사용된 시약 중 MTT(3-[4, 5-dimethylthiazol-2-yl]-2, 5-diphenyl tetrazolium bromide)는 Sigma Chemical Co.
- 본 실험에 사용한 암 세포주는 대장암 유래의 세포인 HT-29(human colon carcinoma), SW620(human colon carcinoma), 자궁경 부암 세포 HeLa(human cervices adenocarcinoma) 및 유방암 세포 MCF-7(human breast adenocarcinoma pleural effusion)로 한국세 포주은행 (KCLB, 서울)으로부터 분양받아 실험에 사용하였다. 세포배양을 위한 배지는 HT-29, SW620, MCF-7 세포주의 경우 RPMI1640 medium을 사용하였으며, HeLa 세포주는 DMEM medium 을 사용하였다.
- 본 실험에서 사용된 미더덕(&ye/a daua)은 경상남도 마산시 진동면 고현마을에서 2005년 10월에 구입하였다. 구입한 미더덕의 이물질을 제거하고 물로 깨끗이 여러 번 씻어 물기를 제거한 후, 분쇄기(Mixer MC 811C, (주)노비타, 한국)로 분쇄하여 사용하였다.
- 분양받아 실험에 사용하였다. 세포배양을 위한 배지는 HT-29, SW620, MCF-7 세포주의 경우 RPMI1640 medium을 사용하였으며, HeLa 세포주는 DMEM medium 을 사용하였다. 각 배지 에 10% FBS, 100 unit/mL의 penicillin, 100 μg/mL의 streptomycin을 처리하여 37℃, 5% CO2 incubator(MCO-18AIC, Sanyo, Osaka, Japan) 에서 배양하였다.
- 구입한 미더덕의 이물질을 제거하고 물로 깨끗이 여러 번 씻어 물기를 제거한 후, 분쇄기(Mixer MC 811C, (주)노비타, 한국)로 분쇄하여 사용하였다. 암세포 성장억제효과 실험에 사용된 시약 중 MTT(3-[4, 5-dimethylthiazol-2-yl]-2, 5-diphenyl tetrazolium bromide)는 Sigma Chemical Co. (St. Louis, MO, USA)제품을 구입하였고, 그 외 연구에 사용된 용매 및 시약은 모두 일급 이상의 등급을 사용하였다.
데이터처리
- 모든 실험은 3회 반복으로 이루어졌으며, 실험결과는 평균 ± 표준 편차로 표현하였다. 모든 처리값의 차이는 신뢰수준 95%(p<0.
이론/모형
- 부위별 미더덕 추출물의 암세포 성장억제효과는 MTT assay(19)로 조사하였다. 세포주를 1×105 cells/well의 농도로 맞추고 96 well plate에 각각 100 mL씩 첨가하여 24시간 동안 37℃, 5% CO2 incubator 에서 배양한 후(20), DMSO에 녹인 미더덕 용매별 추출 분획물 시료를 각각 10, 50, 100, 500 μg/mL의 농도로 처리하였다.
성능/효과
- 5). HeLa세포에서는 50 μg/mL 농도에서도 26.7%로 다른 세포에 비해 암세포 성장억제효과가 가장 좋았으며, 다른 세포에서도 HT-29에 비해 50% 이하의 좋은 활성을 보였다. 그리고 250 μg/mL의 농도에서는 SW620, HeLa, MCF-7 세포 모두가 13.
- HT-29 세포주에 각 분획물을 처리하였을 때 형태학적으로 대조구는 암세포가 조밀하게 정상적으로 성장하는데 반해 각각의 분획물을 500 μg/mL의 농도로 처리한 세포는 결속력이 감소되어 세포주위가 흐트러지고 세포가 응축되어 사멸되었다. 그 중 diethyl ether 분획 물은 대조 구와 다른 추출물에 비교하여 크게 세포의 응축과 세포 수의 감소가 일어남으로 해서 암세포 성장억제효과에 대한 활성이 가장 높음을 확인할 수 있었다. 그리고 각 분획물을 50, 100, 250, 500 μg/mL의 농도로 처 리하여 MTT reduction assay를 해 본 결과, 여러 용매분획물중에서 diethyl ether 분획물에서 가장 높은 항암활성효과가 있었으며 250 pg/mL 을 처리했을 때 25.
- 먼저 각 용매에 대한 추출물이 HT-29세포주의 형태학적 변화에 미치는 영향을 알아보기 위해 inverted microscope로 세포 형태를 관찰한 결과, 대조구는 암세포가 조밀하게 정상적으로 성장하는데 반해 각각 추출물을 500 μg/mL의 농도로 처리한 세포는 결속력이 감소되어 세포주위가 흐트러지고 세포가 응축되어 사멸된 것을 관찰할 수 있었다. 그 중 ethanol 추출물은 대조구와 다른 추출물에 비교하여 크게 세포의 응축과 세포수의 감소가 일어남으로 해서 암세포 성장 억제효과에 대한 활성이 가장 높음을 확인할 수 있었다 (Fig. 2).
- 7%로 다른 세포에 비해 암세포 성장억제효과가 가장 좋았으며, 다른 세포에서도 HT-29에 비해 50% 이하의 좋은 활성을 보였다. 그리고 250 μg/mL의 농도에서는 SW620, HeLa, MCF-7 세포 모두가 13.1%, 9.5%, 7.5%의 높은 항암 활성을 나타내었다. 따라서 미더덕 추출물은 인간대장암 세포주뿐만 아니라 다른 여러 종류의 암 세포주에서도 강력한 항암 활성이 나타나는 것을 확인할 수 있었다.
- 용매별 추출물 중 가장 강력한 항암 활성을 가지는 ethanol 추출물을 이용하여 정제 수율을 높여 암세포 성장억제효과를 확인하기 위하여 n-hexane, diethyl ether, ethyl acetate 및 water 순으로 극성을 높여 분획한 결과 diethyl ether 분획물에서 가장 높은 항암 활성을 나타내었다. 그리고 diethyl ether 분획물을 인간대장암 유래의 세포주 SW620, 자궁경 부암 세포 HeLa 및 유방암 세포 MCF-7에 처 리하였을 때 농도 의존적으로 높은 항암활성 이 나타났으며, 가장 높은 농도 500 μg/mL 처리 시 모두 10% 이하의 세포 생존율을 나타내었다. 지금까지는 한약재를 비롯한 농산물 유래의 추출물이 항암효과를 보이는 연구가 보고된바 있으나 해양생물 유래의 추출물에서 항암효과를 보이는 결과에 대해서 구체적으로 보고된 바가 없는 실정이다.
- 그 중 diethyl ether 분획 물은 대조 구와 다른 추출물에 비교하여 크게 세포의 응축과 세포 수의 감소가 일어남으로 해서 암세포 성장억제효과에 대한 활성이 가장 높음을 확인할 수 있었다. 그리고 각 분획물을 50, 100, 250, 500 μg/mL의 농도로 처 리하여 MTT reduction assay를 해 본 결과, 여러 용매분획물중에서 diethyl ether 분획물에서 가장 높은 항암활성효과가 있었으며 250 pg/mL 을 처리했을 때 25.9%의 암세포 생존률을 보였고 500 μg/ mL에서는 11.0% 이하의 생존율을 나타내었다. 이는 형태학적 관찰과도 결과가 비슷한 것으로 판단된다.
- 대장암 세포주 HT-29에 대한 미더덕 추출물의 암세포증식 억제효과는 ethanol 추출물이 500 pg/mL 농도에서 45.0%로 가장 높은 활성을 보였으며, 대조구와 다른 추출물에 비교하여 크게 세포의 응축과 세포수의 감소를 형태학적으로 관찰할 수 있다. 용매별 추출물 중 가장 강력한 항암 활성을 가지는 ethanol 추출물을 이용하여 정제 수율을 높여 암세포 성장억제효과를 확인하기 위하여 n-hexane, diethyl ether, ethyl acetate 및 water 순으로 극성을 높여 분획한 결과 diethyl ether 분획물에서 가장 높은 항암 활성을 나타내었다.
- 5%의 높은 항암 활성을 나타내었다. 따라서 미더덕 추출물은 인간대장암 세포주뿐만 아니라 다른 여러 종류의 암 세포주에서도 강력한 항암 활성이 나타나는 것을 확인할 수 있었다.
- 지금까지는 한약재를 비롯한 농산물 유래의 추출물이 항암효과를 보이는 연구가 보고된바 있으나 해양생물 유래의 추출물에서 항암효과를 보이는 결과에 대해서 구체적으로 보고된 바가 없는 실정이다. 따라서 이번 연구결과는 생리활성 물질을 탐색함에 있어서 해양 생물이 중요한 천연자원이 될 수 있다는 가능성을 확인할 수 있었다.
- 2, 3과 같다. 먼저 각 용매에 대한 추출물이 HT-29세포주의 형태학적 변화에 미치는 영향을 알아보기 위해 inverted microscope로 세포 형태를 관찰한 결과, 대조구는 암세포가 조밀하게 정상적으로 성장하는데 반해 각각 추출물을 500 μg/mL의 농도로 처리한 세포는 결속력이 감소되어 세포주위가 흐트러지고 세포가 응축되어 사멸된 것을 관찰할 수 있었다. 그 중 ethanol 추출물은 대조구와 다른 추출물에 비교하여 크게 세포의 응축과 세포수의 감소가 일어남으로 해서 암세포 성장 억제효과에 대한 활성이 가장 높음을 확인할 수 있었다 (Fig.
- 3). 미더덕 용매별 추출물을 10, 50, 100, 500 μg/mL의 농도로 각각 처리하였을 때 acetone과 water 추출물은 500 μg/mL의 농도에서 52.6%, 66.1%의 약한 활성을 보이는 반면, ethanol과 methanol 추출물의 경우에는 45.0%, 46.3%의 강한 항암활성을 보였다. 특히 형태학적 변화의 결과와 같이 여러 용매 추줄물 중에서 ethanol 추출물이 가장 높은 항암활성을 가지고 있다는 것을 알 수 있었다.
- 즉, 수분을 함유하고있는 신선 미더덕과 동결건조 미더덕의 경우, 같은 용매를 이용하여 추출물을 제조하여도 신선 미더덕에 비해 동결건조 미더덕의 추출물이 매우 높은 암세포 증식억제 활성을 나타내며, 이는 함유된 수분으로 인한 극성의 차이에 기인한다고 보고하였다. 본 연구에 이용한 추출물도 동결 건조한 미더덕으로부터 유래하였으며, 높은 암세포 증식억제 활성을 나타내었다. 그러나 Kim 등(18)은 acetone 추출물이 약 40% 이하로 HT-29 세포주에 대한 증식억제 활성이 가장 높고, 그 다음으로 ethanol 추출물의 활성이 높다고 보고하였으나, 본 결과에서는 ethanol 추출물이 가장 활성이 높고 methanol, acetone 추줄물의 순서대로 활성이 높았다.
- 0%로 가장 높은 활성을 보였으며, 대조구와 다른 추출물에 비교하여 크게 세포의 응축과 세포수의 감소를 형태학적으로 관찰할 수 있다. 용매별 추출물 중 가장 강력한 항암 활성을 가지는 ethanol 추출물을 이용하여 정제 수율을 높여 암세포 성장억제효과를 확인하기 위하여 n-hexane, diethyl ether, ethyl acetate 및 water 순으로 극성을 높여 분획한 결과 diethyl ether 분획물에서 가장 높은 항암 활성을 나타내었다. 그리고 diethyl ether 분획물을 인간대장암 유래의 세포주 SW620, 자궁경 부암 세포 HeLa 및 유방암 세포 MCF-7에 처 리하였을 때 농도 의존적으로 높은 항암활성 이 나타났으며, 가장 높은 농도 500 μg/mL 처리 시 모두 10% 이하의 세포 생존율을 나타내었다.
- 3%의 강한 항암활성을 보였다. 특히 형태학적 변화의 결과와 같이 여러 용매 추줄물 중에서 ethanol 추출물이 가장 높은 항암활성을 가지고 있다는 것을 알 수 있었다.
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