선택한 단어 수는 입니다.
최소 단어 이상 선택하여야 합니다.
최소 단어 이상 선택하여야 합니다.
선택한 단어 수는 30입니다.
최대 10 단어까지만 선택 가능합니다.
최대 10 단어까지만 선택 가능합니다.
문제 정의
- 본 연구에서는 대장암 세포주에 대해서 항암활성을 가지는 천연 항암물질을 탐색하기 위한 목적으로 지금까지 연구된 바 없는 조각인의 추출물을 이용하여 대장암 세포주에 대한 항암 활성 효과를 밝히고자 하였다.
제안 방법
- Methanol 추출물에서 다음 단계의 분획물을 얻기 위하여 용매의 극성을 달리하여 순차적으로 용매분획 하였다. 즉, ”-hexane과 물을 같은 비율로 분획 추출하여 "-hexane층을 분리하였고, 동일한 방법으로 diethyl ether, ethyl acetate 및 물층으로 분획하여 얻어진 각각의 용매 분획물을 감압 농축시켜용매를 제거한 분획물을 얻었다. 각 추출물 및 분획물은 5 mg/ mlS.
- The cells were treated with various concentrations of each extracts of G Semen (A: methanol extract, B: ethanol extract, C: acetone extract). After MTT assay, the MTT reduction rate (means ± S.D. of triplicate determination) were calculated by setting each of control survivals in the absence of G. Semen extracts. ***significant vs.
- A: hexane layer, B: diethyl ether layer, C: ethyl acetate layer, D: water layer. After MTT assay, the MTT reduction rate (means ± S.D. of triplicate determination) were calculated by setting each of control survivals in the absence of extracts. ***signiflcant vs.
- Cytotoxic effect was determined using MTT reduction assay and LDH release assay (A: MTT assay, B: LDH assay). After MTT assay, the MTT reduction rate (means ± S.D. of triplicate determination) were calculated by setting each of control survivals in the absence of water extracts. Data were normalized to the activity of LDH release from vehicle-treated cells (100%) and expressed as percentage of the control (obtained separate plating).
- 24시간 동안 배양한 후, 각 well에 PBS 완충액에 녹인 MTT(5 mg/m/) 용액을 10B씩 첨가하여 다시 1시간 동안 배양 시킨다. Fonnazan 형성을 확인한 후, 배지를 완전히 제거하고, well 바닥에 형성된 t&mazan을 녹이기 위해 100 의 DMSO를 첨가한 후, ELISA reader(Model 680, BioRad, USA)를 이용하여 540nm에서 흡광도를 측정하여 조각인 추출물을 처리하지 않고 배양시킨 대조군 세포를 100%로 하였을 때의 상대적인 세포 성장 억제율로 나타내었다.
-
LDH 측정에 의한 세포독성 확인.
- 5% Triton X-100용액을 50 B 첨가하여 40rpm으로 10분 동안 shaking시켜 의도적으로 세포벽을 깨트린 다음, 같은 방법으로 LDH reagent 50 μ/를 첨가하여 반응 시키고, 반응이 끝나면 반응 정지액을 넣은 뒤, 540 nm에서 흡광도를 측정하였다. LDH에 의한 세포독성의 백분율은 배양액과 살아있는 세포에서 유리된 총 LDH에 대한 배양액으로 부터 유리된 LDH의 값으로 계산하여 무처리 대조구와 비교한 값을 나타내었다.
-
MTT 분석을 통한 세포 생존율 측정.
- 여과된 추출 여액은 회전 감압농축기(EYELA N-1000, Tokyo Rikakikai Co, Tokyo, Japan)# 이용하여 4(TC에서 감압 농축하여 각 용매 추출물을 얻었다. Methanol 추출물에서 다음 단계의 분획물을 얻기 위하여 용매의 극성을 달리하여 순차적으로 용매분획 하였다. 즉, ”-hexane과 물을 같은 비율로 분획 추출하여 "-hexane층을 분리하였고, 동일한 방법으로 diethyl ether, ethyl acetate 및 물층으로 분획하여 얻어진 각각의 용매 분획물을 감압 농축시켜용매를 제거한 분획물을 얻었다.
- SW620 세포주를 IxlV cells/m/로 맞춘 후, 100씩 96 well plate에 분주하여 C0 incubatoi에서 24시간 동안 배양한 뒤, 1, 5, 10, 25 /m/의 농도로 제조한 조각인 분획 추출물을 세포주에 처리하였다. 다시 24시간 동안 배양한 후, 배양액 을 새로운 96 well plate에 50 μ/ 분주하고, 이 배 양액 에 LDH reagent를 50 씩 첨가하여 상온에서 정 치시 킨 후, 20분간 반응하였다.
- 2와 같다. 각용매별 조각인 추출물을 1, 5, 10, 25 /rW의 농도로 각각 대장암 세포주에 처리하고 MTT reduction assay 방법을 통하여무처리한 대조군과 비교하여 활성을 확인하였다(Fig. 1). 그 결과, methanol 추출물에서 농도 의존적으로 아주 강력한 세포독성을 확인할 수 있었고, ethanol 추출물 역시 높은 항암 활성을 나타내었다.
- 세포주를 Ixlb cells/mE 맞추고 96 well plate에 각각 100 씩 첨가하여 24시간 동안 37℃, CO2 incubatoi에서배양한 후, DMSO에 녹인 각 용매별 추출물 및 분획물을 각각 1, 5, 10, 25 μg/m/의 농도로 제조하여 암세포주에 처리하였다. 24시간 동안 배양한 후, 각 well에 PBS 완충액에 녹인 MTT(5 mg/m/) 용액을 10B씩 첨가하여 다시 1시간 동안 배양 시킨다.
- 외에서 자생하고 있는 435가지의 약용식물 추출물을 대상으로 인간 대장암 세포주의 성장을 효과적으로 저해하는 천연추출물을 찾는 탐색을 시도하였다. 그 결과 조각인(Gleditsiae Semen) 추출물로부터 강력한 대장암 세포주에 대한 세포독성을 확인할 수 있었다.
- 1%로 활성이 크게 증가하지 않았고 대체적으로 낮은 암세포 증식 억제 활성을 보임을 확인하였다. 이러한 조각인의 각용 매별 추출물이 HT-29 세포주에 대해 어떠한 형태학적 변화를 일으키는지 확인하기 위하여 위상차 현미경을 이용하여 무 처리한 대조군과의 비교를 통해 세포의 형태를 관찰하였다. 각용 매별 추출물을 25 의 농도로 각각 처리한 결과, 무 처리한 대조군과 비교하였을 때 확연한 형태학적 변화가 나타났다 (Fig.
- 조각인 5 g에 methanol, ethanol, acetone 용매를 각각 100 tn/씩 가하여 상온에서 3일 동안 정치 시켜 주줄 한 후, 여과지(5C. 110 mm, Advantec, Tokyo Roshi Kaisha, Ltd., Tokyo, Japan)로 여과하였다. 여과된 추출 여액은 회전 감압농축기(EYELA N-1000, Tokyo Rikakikai Co, Tokyo, Japan)# 이용하여 4(TC에서 감압 농축하여 각 용매 추출물을 얻었다.
- 조각인 분획 추출물의 세포독성을 측정하기 위한 방법으로 LDH release assay를 실시하였다. SW620 세포주를 IxlV cells/m/로 맞춘 후, 100씩 96 well plate에 분주하여 C0 incubatoi에서 24시간 동안 배양한 뒤, 1, 5, 10, 25 /m/의 농도로 제조한 조각인 분획 추출물을 세포주에 처리하였다.
- 조각인의 각 용매별 추출물 및 분획물을 다양한 농도로 처리했을 때, HT-29 세포주의 형태학적인 변화를 관찰하기 위해 6 well plate에 1 x 105 cells/well로 2 m/씩 첨가하여 24시간 동안 배양하여, 적당한 농도로 제조 된 추출물 및 분획물을 12시간 처리한 후, phase-contrast microscope (Nikon, Japan)를 이용하여 변화된 HT-29 세포주의 형태학적 특징을 촬영하였다.
- 조각인의 세포독성을 나타내는 물질의 특성을 확인하기 위하여 각 용매별 추출물 중에서 세포독성 효과가 가장 좋았던 methanol 추출물을 극성도에 따라 Fig. 3과 같이 w-hexane, diethyl ether, ethyl acetate 및 water 순서로 용매 분획하여 그 분획물을 얻었다. 각 분획물 의용 매를 제거한 1, 5, 10, 25 pig/m/의 농도로 제조하여 HT- 29 세포주에 처리하였을 때의 세포독성을 나타낸 결과 Fig.
대상 데이터
- (St Louis, MO, USA)로 부터 구입하였으며, LDH(Lactate Dehydrogenase) release assay kit는 Wako Pure Chemical Industries, Ltd.(Osaka, Japan)로부터 구입하였다. 그 외의 연구에 사용된 여러가지 용매 및 시약은 모두 일급 이상의 등급을 사용하였다.
- 각 추출물 및 분획물은 5 mg/ mlS. DMSO(dimethyl sulfoxide)에 녹여 적당한 농도로 희석하여 실험에 사용하였다.
- HT-29 세포주에 대해 높은 세포독성을 보인 water 분획물이 다른 종류의 암세포에서도 이와 같은 암세포 성장억제 능을 나타내는지 확인하기 위하여 HT-29 세포주와는 다른 인간 유래의 대장암 세포주인 SW620 세포주를 이용하여 다음과 같은 실험을 실시하였다. Fig.
- 본 실험에 사용한 조각인은 2006년 5월경 남 마산시 (주)금강제약으로부터 제공받아 추출.분획하여 실험에 사용하였다.
- 그 결과 조각인(Gleditsiae Semen) 추출물로부터 강력한 대장암 세포주에 대한 세포독성을 확인할 수 있었다. 본 연구에 사용된조각인은 주엽나무(Gleditsia japonica Miquel var. koraiensis Nakai)의 씨에 해당하는 것으로써 주로 풍을 다스리고 장을 윤택하게 한다. 하여 민간에서 약용으로 사용한다.
- 본 연구팀에서는 국내.외에서 자생하고 있는 435가지의 약용식물 추출물을 대상으로 인간 대장암 세포주의 성장을 효과적으로 저해하는 천연추출물을 찾는 탐색을 시도하였다.
- 조각인의 세포독성을 실험하기 위해 한국세포주은행(KCLB, Seoul)으로부터 인간 대장암 유래의 세포주 HT-29 와 SW620을 분양받아 본 실험에 사용하였다. 세포배양을 위해 RPMI1640 medium에 10% fetal bovine serum(FBS) 및 100 unit/m/의 penicillin, 100μg/mZ의 streptomycin을 첨가하여 사용하였고, 95%의 습도가 유지되는 37℃, 5% CO2 incubator (MCO-18AIC, SANYO, Osaka, Japan)에서 배양하였다.
데이터처리
- 처리하였다. 각 항목에 따라 백분율과 평균치 土 표준편차(SD)를 구하고 각 추출물의 세포독성 정도를 비교하기 위해 one-way 분산분석 (ANOVA)을 시행하여 F값을 구하고 Schefife's test를 이용하여 대조군과 각 구간의 유의성 차이를 검증하였다. 통계적 유의성은 5% 수준에서 평가하였다.
- 각 항목에 따라 백분율과 평균치 土 표준편차(SD)를 구하고 각 추출물의 세포독성 정도를 비교하기 위해 one-way 분산분석 (ANOVA)을 시행하여 F값을 구하고 Schefife's test를 이용하여 대조군과 각 구간의 유의성 차이를 검증하였다. 통계적 유의성은 5% 수준에서 평가하였다.
이론/모형
- Antiproliferation effect of water fraction from G Semen in SW620 cells. Cytotoxic effect was determined using MTT reduction assay and LDH release assay (A: MTT assay, B: LDH assay). After MTT assay, the MTT reduction rate (means ± S.
- 조각인 추출물 및 분획물의 세포독성을 측정하기 위하여 MTT reduction assay를 실시하였다. 세포주를 Ixlb cells/mE 맞추고 96 well plate에 각각 100 씩 첨가하여 24시간 동안 37℃, CO2 incubatoi에서배양한 후, DMSO에 녹인 각 용매별 추출물 및 분획물을 각각 1, 5, 10, 25 μg/m/의 농도로 제조하여 암세포주에 처리하였다.
성능/효과
- 성장을 효과적으로 억제할 수 있는 방법을 개발함으로써 대장암 세포뿐만 아니라 대부분의 암세포들의 성장을 효과적으로 억제시키기 위해서 많은 연구를 수행하고 있다.4) 암의 치료에 있어서 또 하나의 문제점으로 지적되는 것이 바로 항암제의 자체독성이다. 이러한 항암제의 자체 독성으로 암세포는 물론 정상세포까지 손상시키게 되고, 이로 인하여 오심.
- 실험을 실시하였다. Fig. 6A와 같이 MTT reduction assay를 통하여 water 분획물을 각각 1, 5, 10, 25 μg/m/의 농도로 처리한 후 SW620 세포주에 대한 세포독성을 확인한 결 과, 농도 의존적으로 높은 세포독성을 가짐을 확인할 수 있었고, 특히 25 m/의 농도로 처리했을 때는 42.0%로 강력한 암세포 생육저해능을 가지는 것을 알 수 있었다. 또한 LDH release assay를 통하여 세포독성을 확인한 결과, 마찬가지로 25 μg/mZ의 농도에서 세포독성을 보임을 알 수 있었다(Fig.
- 3과 같이 w-hexane, diethyl ether, ethyl acetate 및 water 순서로 용매 분획하여 그 분획물을 얻었다. 각 분획물 의용 매를 제거한 1, 5, 10, 25 pig/m/의 농도로 제조하여 HT- 29 세포주에 처리하였을 때의 세포독성을 나타낸 결과 Fig. 4 와 같이 water층 분획물에서 가장 높은 항암 활성을 가짐을 확인 할 수 있었다. 즉, wat&층 분획물을 처리했을 때 농도 의존적으로 암세포의 생육이 억제 되었으며, 특히 25 μg/mZ의 농도로 처리했을 때의 활성을 26.
- 이러한 조각인의 각용 매별 추출물이 HT-29 세포주에 대해 어떠한 형태학적 변화를 일으키는지 확인하기 위하여 위상차 현미경을 이용하여 무 처리한 대조군과의 비교를 통해 세포의 형태를 관찰하였다. 각용 매별 추출물을 25 의 농도로 각각 처리한 결과, 무 처리한 대조군과 비교하였을 때 확연한 형태학적 변화가 나타났다 (Fig. 2). Methanol과 ethanol 주출물에서 대조군과 비교하여 볼 때, 전체적인 세포의 수가 적을 뿐만 아니라 그 형태가 응축되어 있고, 불규칙적인 형태를 가지면서 세포사멸이 나타난 것을 관찰할 수 있다.
- 외에서 자생하고 있는 435가지의 약용식물 추출물을 대상으로 인간 대장암 세포주의 성장을 효과적으로 저해하는 천연추출물을 찾는 탐색을 시도하였다. 그 결과 조각인(Gleditsiae Semen) 추출물로부터 강력한 대장암 세포주에 대한 세포독성을 확인할 수 있었다. 본 연구에 사용된조각인은 주엽나무(Gleditsia japonica Miquel var.
- 1). 그 결과, methanol 추출물에서 농도 의존적으로 아주 강력한 세포독성을 확인할 수 있었고, ethanol 추출물 역시 높은 항암 활성을 나타내었다. 그러나 acetone 추출물에서는 조각인 추출물을 농도별로 처리하여도 대조군과 비교하여 활성이 크게 증가하지 않는 것으로 보아 조각인 acetone 추출물에서는 아주 낮은 세포독성을 보이는 것을 알 수 있었다.
- 그 결과, methanol 추출물에서 농도 의존적으로 아주 강력한 세포독성을 확인할 수 있었고, ethanol 추출물 역시 높은 항암 활성을 나타내었다. 그러나 acetone 추출물에서는 조각인 추출물을 농도별로 처리하여도 대조군과 비교하여 활성이 크게 증가하지 않는 것으로 보아 조각인 acetone 추출물에서는 아주 낮은 세포독성을 보이는 것을 알 수 있었다. 즉, 조각인 methanol 추출물을 25|ig/nV로 세포주에 처리했을 때 암세포 생존율은 10.
- 6B). 따라서 조각인은 다양한 종류의 대장암 세포주에 대해 강력한 항암 활성을 나타내는 것을 확인할 수 있었다.
- 3%보다 3배 정도로 세포독성 효과가 증가한 것을 알 수 있었다. 또한 Fig. 5와 같이 water층 분획물을 농도별로 처리한 후, 위상차 현미경을 이용하여 암세포 성장 억제 효과를 확인한 결과 세포응축이나 단일화와 같은 형태학적인 변화를 보임을 알 수 있었다. 따라서 조각인의 세포독성 효과를 나타내는 물질은 아주 강한 극성의 성질을 나타낸다는 것을 강력하게 시사하고 있었다.
- 0%로 강력한 암세포 생육저해능을 가지는 것을 알 수 있었다. 또한 LDH release assay를 통하여 세포독성을 확인한 결과, 마찬가지로 25 μg/mZ의 농도에서 세포독성을 보임을 알 수 있었다(Fig. 6B). 따라서 조각인은 다양한 종류의 대장암 세포주에 대해 강력한 항암 활성을 나타내는 것을 확인할 수 있었다.
- 3%로 높은 세포독성을 나타내었지만, methanol 추출물에 비해서는 상대적으로 낮은 세포독성을 보였다. 반면 acetone 추출물을 1, 5, 10, 25)의 농도로 처리했을 때, 각각 91.6, 91.2, 88.3, 85.1%로 활성이 크게 증가하지 않았고 대체적으로 낮은 암세포 증식 억제 활성을 보임을 확인하였다. 이러한 조각인의 각용 매별 추출물이 HT-29 세포주에 대해 어떠한 형태학적 변화를 일으키는지 확인하기 위하여 위상차 현미경을 이용하여 무 처리한 대조군과의 비교를 통해 세포의 형태를 관찰하였다.
- 4 와 같이 water층 분획물에서 가장 높은 항암 활성을 가짐을 확인 할 수 있었다. 즉, wat&층 분획물을 처리했을 때 농도 의존적으로 암세포의 생육이 억제 되었으며, 특히 25 μg/mZ의 농도로 처리했을 때의 활성을 26.4%로 1 μg/mZ로 처리했을 때인 79.3%보다 3배 정도로 세포독성 효과가 증가한 것을 알 수 있었다. 또한 Fig.
- 그러나 acetone 추출물에서는 조각인 추출물을 농도별로 처리하여도 대조군과 비교하여 활성이 크게 증가하지 않는 것으로 보아 조각인 acetone 추출물에서는 아주 낮은 세포독성을 보이는 것을 알 수 있었다. 즉, 조각인 methanol 추출물을 25|ig/nV로 세포주에 처리했을 때 암세포 생존율은 10.3%로 1 μg/mZ로 처리했을 때의 91.4%에 비해 약 9배 이상의 증가된 세포독성을 확인할 수 있었다. Ethanol 추출물에서도 조각인 추출물의 농도가 25 7일 때의 활성이 15.
- Methanol과 ethanol 주출물에서 대조군과 비교하여 볼 때, 전체적인 세포의 수가 적을 뿐만 아니라 그 형태가 응축되어 있고, 불규칙적인 형태를 가지면서 세포사멸이 나타난 것을 관찰할 수 있다. 특히 methanol 추출물을 처리한 세포에서는 더 많은 세포사멸이 일어나는 것으로 보아 MTT reduction assay 결과와 동일한 양상으로 조각인 methanol‘추출물에서 암세포 성장 억제 능력이 가장 강함을 확인할 수 있었다. 한편 acetone 추출물을 처리했을 때는 세포사멸이 다른 추출물에 비해 적고, 세포독성을 거의 나타내지 않았다.
※ AI-Helper는 부적절한 답변을 할 수 있습니다.