잔디 피시움마름병(Pythium blight)의 생물학적 방제를 위한 길항 미생물의 선발과 효력 검정 Development of Antagonistic Microorganism for Biological Control of Pythium Blight of Turfgrass원문보기
Pythium spp. 균에 의해 발생되는 피시움마름병(Pythium blight)은 골프장 퍼팅 그린에서 문제가 되는 대표적 병해이다. 본 연구에서는 Pythium aphanidermatum를 피시움마름병 병원균으로 하여 생물학적 방제법에 이용할 수 있는 길항 미생물을 1차 선발하였고, 선발된 길항 미생물에 대해 폿트 수준의 생물 검정 실험을 실시하였다. 두 실험을 동해 선발된 미생물 중에서 Relative Performance Indies 값을 기준으로 가장 우수한 것을 선별하여 피시움마름병에 대한 길항 미생물로 최종 선발하였고, 동정한 결과 Bacillus subtilis로 밝혀졌다. 최종 선발된 미생물은 B. subtilis GB-0365라 명명하였고, 화학 농약에 대한 내성 실험과 혼용 처리에 따른 효과를 검정하여 화학 농약과 시간의 차이를 두고 교호 살포할 경우 방제효과가 보다 높게 나타났다. 골프장의 간이 묘포장에서 자연 발생된 피시움마름병에 대한 B. subtilis GB-0365의 방제효과를 검증한 결과, 무처리 대비 방제가는 56.4%, 화학 농약 대비 방제가는 60.9%로 우수한 방제 효과을 가진 것으로 판명되었다.
Pythium spp. 균에 의해 발생되는 피시움마름병(Pythium blight)은 골프장 퍼팅 그린에서 문제가 되는 대표적 병해이다. 본 연구에서는 Pythium aphanidermatum를 피시움마름병 병원균으로 하여 생물학적 방제법에 이용할 수 있는 길항 미생물을 1차 선발하였고, 선발된 길항 미생물에 대해 폿트 수준의 생물 검정 실험을 실시하였다. 두 실험을 동해 선발된 미생물 중에서 Relative Performance Indies 값을 기준으로 가장 우수한 것을 선별하여 피시움마름병에 대한 길항 미생물로 최종 선발하였고, 동정한 결과 Bacillus subtilis로 밝혀졌다. 최종 선발된 미생물은 B. subtilis GB-0365라 명명하였고, 화학 농약에 대한 내성 실험과 혼용 처리에 따른 효과를 검정하여 화학 농약과 시간의 차이를 두고 교호 살포할 경우 방제효과가 보다 높게 나타났다. 골프장의 간이 묘포장에서 자연 발생된 피시움마름병에 대한 B. subtilis GB-0365의 방제효과를 검증한 결과, 무처리 대비 방제가는 56.4%, 화학 농약 대비 방제가는 60.9%로 우수한 방제 효과을 가진 것으로 판명되었다.
Pythium blight caused by Pythium spp. is one of major diseases in putting green of golf course. In this study, microorganisms which are anatgonistic to Pythium aphanidermatum, a pathogen of pythium blight, were selected primary through in vitro tests, dual culture method and triple layer agar diffus...
Pythium blight caused by Pythium spp. is one of major diseases in putting green of golf course. In this study, microorganisms which are anatgonistic to Pythium aphanidermatum, a pathogen of pythium blight, were selected primary through in vitro tests, dual culture method and triple layer agar diffusion method. In vivo test against pythium blight were conducted to select the best candidate biocontrol microorganism by pot experiment in a plastic house. Bacillus subtilis GB-0365 was finally selected as a biocontrol agent against pythium blight. Relative Performance Indies(RPI) was used as a criterion of selecting potential biocontrol agent. B. subtilis GB-0365 showed resistance to major synthetic agrochemicals used in golf course. Alternative application of synthetic agrochemicals and B. subtilis GB-0365 was most effective to successfully contol pythium blight. B. subtilis GB-0365 suppressed the development of pythium bight of bentgrass by 56.4% as compared to non-treated control and its disease control efficacy was 60.9% of a synthetic fungicide Oxapro(WP) efficacy. B. subtilis GB-0365 has a potential to be a biocontrol agent for control of pythium blight.
Pythium blight caused by Pythium spp. is one of major diseases in putting green of golf course. In this study, microorganisms which are anatgonistic to Pythium aphanidermatum, a pathogen of pythium blight, were selected primary through in vitro tests, dual culture method and triple layer agar diffusion method. In vivo test against pythium blight were conducted to select the best candidate biocontrol microorganism by pot experiment in a plastic house. Bacillus subtilis GB-0365 was finally selected as a biocontrol agent against pythium blight. Relative Performance Indies(RPI) was used as a criterion of selecting potential biocontrol agent. B. subtilis GB-0365 showed resistance to major synthetic agrochemicals used in golf course. Alternative application of synthetic agrochemicals and B. subtilis GB-0365 was most effective to successfully contol pythium blight. B. subtilis GB-0365 suppressed the development of pythium bight of bentgrass by 56.4% as compared to non-treated control and its disease control efficacy was 60.9% of a synthetic fungicide Oxapro(WP) efficacy. B. subtilis GB-0365 has a potential to be a biocontrol agent for control of pythium blight.
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문제 정의
골프장에서 사용하고 있는 화학 농약과의 혼용성 여부를 검정함으로써 IPM 소재로써의 여부를 검증해 보았다. 최종 선발 미생물을 LB 배지 (yeast extract 0.
이는 길항 미생물이 plate가 아닌 실제 현장이나 외부 토양에선 다른 미생물에 의한 간섭과 환경 요인에 의해 처리 지역에 정착할 수 없어서 병원균에 대해 억제력을 보이지 못할 수 있기 때문이다. 그리하여, 본 연구에서는 in vitro 상에서 길항 작용을 보인 균주에 대해 생물 검정 시험을 실시하였다. 앞서 P.
본 연구를 통해 골프장에서 널리 사용되고 있는 화학농약 제품 중 살균제 43종, 살충제 11종, 제초제 22종, 생장조절제 1종에 대하여 B. subtilis GB-0365의 농약 혼용 가능 여부를 조사하였다. Table 4에 나와 있는 결과에는 살균제의 경우, 카바메이트계, 피리미딘계, 이족사놀계, 카르복시아니라이드계, 아실아라닌계, 요소계 등 22종, 살충제는 유기인계, 카바메이트계, 합성 피레스로이드계 등 6 종이 혼용 가능하였고, 제초제에 있어서는 디니트로아니린계, 설포닐우레아계, 카바메이트계 등 4종이 가능하였다.
미생물에 대해 피시움마름병을 일으키는 Pythium spp. 의길항균을 in vitro에서 활성 검증하여 선발하였고, 폿트와간이 묘포장 수준에서 생물 검정 시험을 통해 피시움마름병 방제제로 사용할 수 있는 미생물 제제를 개발코자 하였다.
제안 방법
고려할 수 있도록 RPI 기법을 이용하였다. RPJ를 구하는 방법은 다음과 같으며, Efficacy는 앞서의 생물 검정시험(폿트 시험)에서의 방제가를 X 값으로 계산하였고, Kinetics는 후보 균들을 5 ml LBS 배지 (soluble starch, 10 g//; Tryptone, 10 g//; Yeast extract, 5 g//; NaCl, 5 g/Z)에서 1 차 사면배양(301, 16시간)한 후, 10 m/ LBS 배지에서 2차 사면배양(30℃, 12시간)을 진행한 후보 균들의 최종 OD500을 X 값으로 이용하였다.
투명환의 크기를 기준으로 순수 분리된 colony를 TSB에 배양하여 colony의 형태 및 현미경 관찰을 통해 본 결과, actinomycetes, bacteria, fungi 등 총 28종의 미생물이 조사되었다. 각각의 순수 분리된 미생물은 지역과 분리 순서에 따라 일련의 명칭을 부여하였고, 대칭 배양법과 활성 저지원법을 이용하여 P. aphanidermatum에 대한 길항성을 조사하였다. 활성저지원 실험 결과 직경이 27mm 이상인 것을 기준으로 활성이 존재한다고 보았으며, 본연구와 동시 실시한 다른 실험 결과에서 우수한 길 항력을 보인 미생물을 포함하여 13종에 대하여 대칭 배양법을 실시하였다.
간이 묘포장 수준의 약효·약해 검증 실험.
균주 선발 과정을 통해 잔디 피시움마름병에 높은 항균활성을 나타내는 미생물을 최종선발하였고, 이 균주의 동정을 위해 형태적 특성 및 생리적 특성을 조사하였다. 균주의 동정에 있어 1차적으로 Bergey's manual of determinative bacteriology, Microbiological methods, Manual of methods for general bacteriology, Bergey's manual of systemic bacteriology 등을 참고하였고, BIOLOG system, Fatty acid methyl ester(FAME) 분석과 16s RNA 유전자 염기서열 분석을 통하여 최종적으로 동정하였다.
실험은 피시움마름병자연 발생지에서 진행하였으며, 길항 미생물의 처리는 본연구기관인 그린바이오텍에서 개발한 최적 생산 배지와 최적 배양 공정을 통해 만들어진 시제품을 100배 희석하여 발병 직후부터 7일 간격으로 실험구 당 1㎡씩 4주간 처리하였다. 대조 화학 농약은 옥사프로 수화제를 사용하였으며, 500배 희석액을 역시 1주 간격으로 4회 경엽 살포하였다. 최종 처리 7일 후에는 발병 면적율을 조사하였고, 무처리 대비 방제가(%)와 화학 농약 대비 방제 효과(%)를 구하였다.
미생물 제제와 화학 농약의 교호 사용에 따른 효과를 알아보기 위해서 metalaxyl을 2000배 희석 처리하고, 3일 후에 최종 선발 길항 미생물 제제를 100배 희석하여 처리구당 처리하였다. 대조구로는무처리구와 유기 합성 살균제 단독 처리구를 두었고, 무처리구 대비 방제가로 효력을 검증하였다.
제조된 평판배지를 30℃ 항온기에서 3〜7일간 배양하고, 피시움마름병 병원균인 Pythium aphanidermatum에 대해 길항성을 조사하여 길항성이 있는 것으로 보이는 미생물은 순수 분리한 후, Trytic Soy Broth(TSB) 배지를 이용하여 배양한 다음 대칭배양법과 생육 저지환 측정법을 이용하여 우수한 길항력이 있는 미생물을 선별하였다. 대칭배양법의 경우 다음의 식에 의해 생육 저해율을 계산하였고, 생육 저지환 측정법은 투명환의 직경으로서 길 항력을 평가하였다.
85% topping용 soft agar 5 m, 에 100 ㎕을 첨 가하고 잘 혼합한 후, LB agar plate에 부어 풍건하여 농약 혼용성 평가용 p* late 제조하였다. 물 처리를 대조구로 하고, 검정 대상 농약의 권장 희석배수 1/10배 , 1배, 2배 희석액을 제조하여 0.8 mm thick paper disc에 100 ㎕씩 처리하여서 미리 제작한 농약 혼용성 평가용 plate 위에 치상한 다음 30℃에서 배양하여 생육 저지 원의 유무로 농약 혼용성을 평가하였다. 혼용성 여부는 전 농도에 걸쳐서 생육 저지원이 생기지 않는 것을 기준으로 하였다.
미생물 제제와 유기 합성 살균제의 혼용에 따른 효력검정 실험.
미생물 제제의 단독 처리 효과를 알아보기 위해 최종 선발 길항 미생물을 100배 희석하여 처리구당 1 Z/m2 처리하였고, 미생물 제제와 화학 농약의 혼합 처리 효과를 알아보기 위해 metalaxyl 2000배 희석액을 사용하여 최종 선발 길항 미생물을 100배 희석하여 처리구당 1 //m2 처리하였다. 미생물 제제와 화학 농약의 교호 사용에 따른 효과를 알아보기 위해서 metalaxyl을 2000배 희석 처리하고, 3일 후에 최종 선발 길항 미생물 제제를 100배 희석하여 처리구당 처리하였다. 대조구로는무처리구와 유기 합성 살균제 단독 처리구를 두었고, 무처리구 대비 방제가로 효력을 검증하였다.
실험구의 약제 처리는 다음과 같이 분류하여 실시하였다. 미생물 제제의 단독 처리 효과를 알아보기 위해 최종 선발 길항 미생물을 100배 희석하여 처리구당 1 Z/m2 처리하였고, 미생물 제제와 화학 농약의 혼합 처리 효과를 알아보기 위해 metalaxyl 2000배 희석액을 사용하여 최종 선발 길항 미생물을 100배 희석하여 처리구당 1 //m2 처리하였다. 미생물 제제와 화학 농약의 교호 사용에 따른 효과를 알아보기 위해서 metalaxyl을 2000배 희석 처리하고, 3일 후에 최종 선발 길항 미생물 제제를 100배 희석하여 처리구당 처리하였다.
미생물 제제의 단독 처리와 혼용 처리의 효력 차이를 검정하기 위해 온실 내에서 폿트 수준의 생물검정 실험을 실시하였다. 병원균의 준비와 접종법은 위에서 설명한 폿트 수준의 생물 검정 실험과 같고, 미생물제제의 경우 최종 선발된 길항 미생물을 사용하였으며, 혼용 또는 단독 처리한 화학 농약으로 metalaxyl을 사용하였다.
병원균 접종은 길항미생물 처리 전에 폿트당 접종체 20g 수준으로 처리하였으며, 길항미생물 처리는 대상 길항미생물이 충분히 자랄 수 있도록 적절한 배지(PDB 또는 TSB)에서 충분히 배양한 다음 배양액을 100배 희석하여 폿트당 200 tW씩 처리하였다. 대조 화학 농약으로는 옥사프로 수화제500배 희석액을 살포하였다.
병원균의 접종원은 1일 간격으로 2회 연속 살균한 sand-oatmeal 배양기 (1, 000 m/ 삼각플라스크에 모래 380 g, oatmeal 20 g을 넣어 혼합하고, 증류수 76 ml 를 첨가)에 감자한천배지(PDA)에서 5일간 배양한 피시움마름병의 병원균 P. aphanidermatum의 균종을 코르크 보아로 잘라 5개씩 이식하여 30℃ 항온기에서 20일간 배양하여 준비하였다.
대상 작물은 약효 검증 실험의 경우 한지형 잔디인 크리핑 벤트그라스(Creeping bentgrass), 약해 실험은 크리핑 벤트그라스와 난지형 잔디인 한국 잔 (Zoysia japonica)를 사용하였다. 실험은 피시움마름병자연 발생지에서 진행하였으며, 길항 미생물의 처리는 본연구기관인 그린바이오텍에서 개발한 최적 생산 배지와 최적 배양 공정을 통해 만들어진 시제품을 100배 희석하여 발병 직후부터 7일 간격으로 실험구 당 1㎡씩 4주간 처리하였다. 대조 화학 농약은 옥사프로 수화제를 사용하였으며, 500배 희석액을 역시 1주 간격으로 4회 경엽 살포하였다.
그리하여, 본 연구에서는 in vitro 상에서 길항 작용을 보인 균주에 대해 생물 검정 시험을 실시하였다. 앞서 P. aphcmidermahmi에 대해 길항능력이 뛰어난 총 13개의 후보 균주에 대해 먼저 생물 검정 실험을 실시하였고, 이 중 병 발생 억제력 면에서 가장 높은 효과가 보이는 4개 균주에 대해 폿트를 이용한 2차 생물 검정 실험을 실시하여 Table 2에 결과를 나타내었다.
최종 처리 7일 후에는 발병 면적율을 조사하였고, 무처리 대비 방제가(%)와 화학 농약 대비 방제 효과(%)를 구하였다. 약해 검증 실험의 경우 약효 검증 실험 기준량과 그 배량으로 실험을 실시하였고, 1실 험구(1 m2) 당 약효 검증 실험량과 같은 1/㎡으로 처리하였다.
aphanidermahmi에대해 높은 길항력을 가진 것으로 볼 수 있었다. 위의 in vitro의 결과를 토대로 폿트 수준의 생물 검정 실험을 통해 피시움마름병의 병 억제력을 측정할 후보 균주를 선발하였다.
동정 자료를 토대로 일반적인 Bacillus spp. 의 배양 조건을 참고하여 실제 생물적 방제법에 사용될 수준의 배양 조건을 연구하였고, 본 연구의 간이 묘포장실험에 사용한 시제품 생산에 적용하였다.
subtilis GB-0365의 피시움마름병에 대한 효력 검정을 위하여 간이 묘포장에서 생물 검정 시험을 실시하였다. 이 실험은 기존의 생물 검정 실험과 다르게 병원균 접종을 하지 않고, 피시움마름병의 자연 발생지에서 실험을 실시하였다. 온실이나 실험실 내부에서의 생물 검정 실험에만 그칠 경우 실제 병 발생 현장에 바로 적용하는 것은 어렵다.
한다. 이에 본 연구에서는 RPI 개념을 도입하여 위 능력에 대해 검증하였다(Fig. 1). 결과적으로 RPI 값을 기준으로 보았을 때, GB-0365가 약 80으로 가장 높은 RPI 값을 가진 것으로 나타나 피시움마름병에 대한 미생물 제제의 후보 균주로 최종 선정되었다.
지금까지 제조한 plate 위 에 water agar 용액 5 m/를 넣어 굳힌 후 마지 막으로 계대 배 양중인 사면배지 로부터 잔디 병 원성 미 생 물의 포자 현탁액을 만든 것을 50℃ 항온기에 준비된 PDA 배지 10 m/에 2〜3방울 첨가하고 잘 혼합한 후에 상기의 plate에 다시 분주하여 삼중층평판배지를 제조하였다. 제조된 평판배지를 30℃ 항온기에서 3〜7일간 배양하고, 피시움마름병 병원균인 Pythium aphanidermatum에 대해 길항성을 조사하여 길항성이 있는 것으로 보이는 미생물은 순수 분리한 후, Trytic Soy Broth(TSB) 배지를 이용하여 배양한 다음 대칭배양법과 생육 저지환 측정법을 이용하여 우수한 길항력이 있는 미생물을 선별하였다. 대칭배양법의 경우 다음의 식에 의해 생육 저해율을 계산하였고, 생육 저지환 측정법은 투명환의 직경으로서 길 항력을 평가하였다.
이어서 채취한 토양시료 1 g을 멸균한 생리식염수 100m/ 에 잘 현탁한 다음, 현탁액 2〜3 방울을 상기 시험관에 넣고 잘 혼합하여 plate를 제조하였다. 지금까지 제조한 plate 위 에 water agar 용액 5 m/를 넣어 굳힌 후 마지 막으로 계대 배 양중인 사면배지 로부터 잔디 병 원성 미 생 물의 포자 현탁액을 만든 것을 50℃ 항온기에 준비된 PDA 배지 10 m/에 2〜3방울 첨가하고 잘 혼합한 후에 상기의 plate에 다시 분주하여 삼중층평판배지를 제조하였다. 제조된 평판배지를 30℃ 항온기에서 3〜7일간 배양하고, 피시움마름병 병원균인 Pythium aphanidermatum에 대해 길항성을 조사하여 길항성이 있는 것으로 보이는 미생물은 순수 분리한 후, Trytic Soy Broth(TSB) 배지를 이용하여 배양한 다음 대칭배양법과 생육 저지환 측정법을 이용하여 우수한 길항력이 있는 미생물을 선별하였다.
약제 처리 후에 습실상(온도 281, 상대습도 100%) 안에서 발병을 유도하였다. 처리 10일 후에 발병 면적율을 조사하고, 무처리 대비 방제가(%)를 구하여 높은 항균활성을 나타내는 미생물을 선발하였다.
최종 선발 미생물을 LB 배지 (yeast extract 0.5%, tryptone 1.0%, NaCl 0.5%)에서 3CTC에 12시간 동안 진탕 배 양하고, I X 107 cell(spore)/m/ 수준으로 조정 하여 현탁액을 제조하였다. 이 현탁액을 0.
최종 선발된 길항 미생물의 약효 실험은 경기도 모 골프장의 간이 묘포장에서 난괴법 3반복으로 실험구(1 실험구당 4 m2) 를 배치하여 진행하였다. 대상 작물은 약효 검증 실험의 경우 한지형 잔디인 크리핑 벤트그라스(Creeping bentgrass), 약해 실험은 크리핑 벤트그라스와 난지형 잔디인 한국 잔 (Zoysia japonica)를 사용하였다.
최종 선발된 미생물인 B. subtilis GB-0365의 피시움마름병에 대한 효력 검정을 위하여 간이 묘포장에서 생물 검정 시험을 실시하였다. 이 실험은 기존의 생물 검정 실험과 다르게 병원균 접종을 하지 않고, 피시움마름병의 자연 발생지에서 실험을 실시하였다.
대조 화학 농약은 옥사프로 수화제를 사용하였으며, 500배 희석액을 역시 1주 간격으로 4회 경엽 살포하였다. 최종 처리 7일 후에는 발병 면적율을 조사하였고, 무처리 대비 방제가(%)와 화학 농약 대비 방제 효과(%)를 구하였다. 약해 검증 실험의 경우 약효 검증 실험 기준량과 그 배량으로 실험을 실시하였고, 1실 험구(1 m2) 당 약효 검증 실험량과 같은 1/㎡으로 처리하였다.
퍼팅 그린에서 문제가 되고 있는 토양 전염성 병원균에 대해 항균 활성을 갖는 미생물을 선발하기 위해서 경기 9개 지역, 충북 2개 지역, 충남 1개 지역의 골프장 토양과 밭 토양, 산림 토양을 채취하였고, 삼중층 평판배지를 이용하여 길항균을 분리하였다. 삼중층 평판배지를 만들기 위한 과정은 다음과 같이 진행하였다.
aphanidermatum에 대한 길항성을 조사하였다. 활성저지원 실험 결과 직경이 27mm 이상인 것을 기준으로 활성이 존재한다고 보았으며, 본연구와 동시 실시한 다른 실험 결과에서 우수한 길 항력을 보인 미생물을 포함하여 13종에 대하여 대칭 배양법을 실시하였다. 조사 결과는 Table 1과 같다.
대상 데이터
배치하여 진행하였다. 대상 작물은 약효 검증 실험의 경우 한지형 잔디인 크리핑 벤트그라스(Creeping bentgrass), 약해 실험은 크리핑 벤트그라스와 난지형 잔디인 한국 잔 (Zoysia japonica)를 사용하였다. 실험은 피시움마름병자연 발생지에서 진행하였으며, 길항 미생물의 처리는 본연구기관인 그린바이오텍에서 개발한 최적 생산 배지와 최적 배양 공정을 통해 만들어진 시제품을 100배 희석하여 발병 직후부터 7일 간격으로 실험구 당 1㎡씩 4주간 처리하였다.
실험을 실시하였다. 병원균의 준비와 접종법은 위에서 설명한 폿트 수준의 생물 검정 실험과 같고, 미생물제제의 경우 최종 선발된 길항 미생물을 사용하였으며, 혼용 또는 단독 처리한 화학 농약으로 metalaxyl을 사용하였다. 실험구의 약제 처리는 다음과 같이 분류하여 실시하였다.
본 연구에서는 수년간 여러 지역에서 채취한 토양 내 .미생물에 대해 피시움마름병을 일으키는 Pythium spp.
실험 작물은 골프장 그린의 주초종인 크리핑 벤트그라스(품종: 펜크로스)로 잔디 포지에서 채취하여 30X45 cm 사각 폿트로 옮긴 후에 20〜3VC의 온실에서 30일 이상 활착을 시킨 것이나 파종 후 60일 이상 재배한 것을 사용하였다.
실제 골프장 환경은 기상 상태, 잔디의 생육 정도, 토양의 이화학성, 시비 량, 토양 병원균의 병원성 등 많은 차이가 있으며, 이로 인해 병의 발생 정도가 다르고 생물적 방제에 의한 결과도 달라질 수 있다(Harmon 과 Hardar, 1983). 이번 실험은 경기도 모 골프장의 실제 골프 코스와 대등한 관리 아래 있다 가정할 수 있는 간이 묘포장에서 실시하였다. 실험 기간 동안 실험 결과에 영향을 줄만한 기후적, 물리적 영향은 없었고, 발병률은 대조 구에서 27% 이상으로 실험을 진행하기에 충분한 정도였다.
이론/모형
특성을 조사하였다. 균주의 동정에 있어 1차적으로 Bergey's manual of determinative bacteriology, Microbiological methods, Manual of methods for general bacteriology, Bergey's manual of systemic bacteriology 등을 참고하였고, BIOLOG system, Fatty acid methyl ester(FAME) 분석과 16s RNA 유전자 염기서열 분석을 통하여 최종적으로 동정하였다.
최종 길항 미생물의 선정은 병원균에 대한 길항력과 생장 속도를 복합적으로 고려할 수 있도록 RPI 기법을 이용하였다. RPJ를 구하는 방법은 다음과 같으며, Efficacy는 앞서의 생물 검정시험(폿트 시험)에서의 방제가를 X 값으로 계산하였고, Kinetics는 후보 균들을 5 ml LBS 배지 (soluble starch, 10 g//; Tryptone, 10 g//; Yeast extract, 5 g//; NaCl, 5 g/Z)에서 1 차 사면배양(301, 16시간)한 후, 10 m/ LBS 배지에서 2차 사면배양(30℃, 12시간)을 진행한 후보 균들의 최종 OD500을 X 값으로 이용하였다.
성능/효과
실험 결과는 Table 6과 같다. P. aphanidermatum 만 처리한 대조구의 경우 전체적으로 높은 수준의 발병면적율을 보이며 잔디가 고사했고, B. subtilis GB-0365를 처리한 경우 만족할 수준은 아니지만 무처리 대비 방제가 는 56.4%, 화학 농약 대비 방제 효과는 60.9%로 비교적 우수한 방제 효과를 나타내었다. 약해는 기준 처리량 배량의 약제 처리에서도 크리핑 벤트그라스와 한국 잔디두 종에서 모두 발견되지 않았다.
Table 1 의 결과를 보면 in vitro 상에서 GB-0365와 GB- 017, EW-15, F63 등이 P. aphanidermahmi에대해 높은 길항력을 가진 것으로 볼 수 있었다. 위의 in vitro의 결과를 토대로 폿트 수준의 생물 검정 실험을 통해 피시움마름병의 병 억제력을 측정할 후보 균주를 선발하였다.
subtilis GB-0365의 농약 혼용 가능 여부를 조사하였다. Table 4에 나와 있는 결과에는 살균제의 경우, 카바메이트계, 피리미딘계, 이족사놀계, 카르복시아니라이드계, 아실아라닌계, 요소계 등 22종, 살충제는 유기인계, 카바메이트계, 합성 피레스로이드계 등 6 종이 혼용 가능하였고, 제초제에 있어서는 디니트로아니린계, 설포닐우레아계, 카바메이트계 등 4종이 가능하였다.
1). 결과적으로 RPI 값을 기준으로 보았을 때, GB-0365가 약 80으로 가장 높은 RPI 값을 가진 것으로 나타나 피시움마름병에 대한 미생물 제제의 후보 균주로 최종 선정되었다.
이번 실험은 경기도 모 골프장의 실제 골프 코스와 대등한 관리 아래 있다 가정할 수 있는 간이 묘포장에서 실시하였다. 실험 기간 동안 실험 결과에 영향을 줄만한 기후적, 물리적 영향은 없었고, 발병률은 대조 구에서 27% 이상으로 실험을 진행하기에 충분한 정도였다. 실험 결과는 Table 6과 같다.
적합한 균주로 GB-0365가 선정되었다. 이에 최종 선발 길항 미생물의 생리·형태학적 특성을 조사하고, 염기서열의 분석을 실시한 결과, GenBank의 Bacillus subtilis 와 16s rRNA 서열의 동일성이 98% 이상 나타나 최종적으로 Bacillus subtilis로 동정하였고, 동정 결과를 Table 3 에 나타내었다. 동정 자료를 토대로 일반적인 Bacillus spp.
이중 F63과 GB-0365가 무처리 대조구 대비 방제가(%) 에서 비교적 높은 병 발생 억제력을 갖는 것을 볼 수 있었으며, 두 균주는 통계적으로 화학 농약 처리와 동일한 수준의 우수한 방제력을 갖는 것을 알 수 있었다.
최종 선발된 피시움마름병 병원균 P. aphanidermatiirri의 길항 미생물 B. subtilis GB-0365가 피시움마름병 용 화학 살균제인 metalaxyl 수화제와 거의 대등한 방제 효과를 보였으며, metalaxyl 수화제를 먼저 살포하고 3〜4일 후에 B. subtilis GB-0365를 처리한 경우에 가장 강한 방제 효과를 보였다. 이를 보았을 때, B.
이 때, 토양 현탁액에 존재하는 filamentous soil microorganism의 경우 water agar증까지 생장하여 병원균 접종 시 오염원으로 작용할 수 있으므로 토양 현탁액이 희석된 층이 일체의 외부 오염없이 완전히 건조된 후, water agar를 붓도록 함으로써 filamentous soil microorganism의 간섭을 방지하였다(이 등, 1997). 투명환의 크기를 기준으로 순수 분리된 colony를 TSB에 배양하여 colony의 형태 및 현미경 관찰을 통해 본 결과, actinomycetes, bacteria, fungi 등 총 28종의 미생물이 조사되었다. 각각의 순수 분리된 미생물은 지역과 분리 순서에 따라 일련의 명칭을 부여하였고, 대칭 배양법과 활성 저지원법을 이용하여 P.
후속연구
미생물이 대상 병원균에 활성을 나타내는 기작에는 중복 감염 (hyperparastism), 영양과 서식처에 대한 경쟁(competition) 및 항생물질에 의한 항생작용(antibiosis) 등으로 나눌 수 있는데 (Baker, 1968), 미생물 농약이 효과를 나타내기 위해서는 이들 특성에 맞는 배양 조건, 균 밀도 유지, 항균 물질의 가수 분해 방지 등의 개발 및 연구가 필요하다. 둘째로, 골프장 현장에 적합한 제형의 연구가 필요하다. 이런 관점에서 염 (1999)의 경우, Trichoderma harzianum 균을 이용한 골프 그린에 발생하는 피시움마름병 방제 실험에서 토양 내 미생물 제제의 처리 시 제형과 처리 방법이 효력에 얼마나 영향을 미치는 지 검증하여 Topdressing Aeration Core (TAC) 처리 시 관주 처리에 비하여 더 좋은 효과를 나타내었다.
미생물은 외부 환경에 노출되는 경우 급속한 밀도 저하를 일으키거나 대상 병원균에 대한 활성을 잃을 수 있다(Burges, 1998). 이를 방지하고 더 좋은 방제 결과를 얻기 위해 제형의 연구가 함께 뒤따라야 할 것이다.
subtilis GB-0365를 처리한 경우에 가장 강한 방제 효과를 보였다. 이를 보았을 때, B. subtilis GB-0365 역시 미생물 농약과 화학 농약의 혼용을 통해 효과를 증진시킬 수 있으며, 앞으로 미생물과 화학 농약의 혼용 처리에 따른 효력 상승효과 및 토양 미생물상의 변화에 대한 실험을 통해 골프장 관리에 실제 적용될 수 있는 모델의 개발이 필요할 것이다.
참고문헌 (11)
Baker, R. 1968. Mechanism of biological control of soil-borne pathogens. Annu. Rev. Phytopathol. 6: 263-294
Burges, H. D. 1998. Formulation of Microbial Biopesticides. 412p. Kluwer Academic Publisher. Dordrecht, Netherlands
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Harmon, G. E. and Hardar, Y. 1983. Biological control of Pythium species. Seed Sci. Technology 11: 893-906
Shurtleff, M. C., Fermanian, T. W. and Randell, R. 1987. Controlling turfgrass pests. 449 p. In: A reston book. Prentice- Hall, Inc. Englewood Cliffs, New Jersey
Uddin, W. and Viji, G. 2002. Biological control of turfgrass disease. pp. 313-314. In: Biological control of crop disease. Marcel Dekker, Inc. Barsel, New York
이용세, 전하준, 이창호, 송치현. 1997. 잔디 토양전염성병원진 균에 대한 길항미생물의 분리 및 길항효과, Kor. J. Org. Agric. 6: 133-149
안용태. 1992. Golf장 관리의 기본과 실제, 한국잔디연구소. 유 천문화사
염주립. 1999. Trichoderma harzianum ABGC-95를 이용한 골 프그린에 발생하는 Pythium 마름병의 생물적 방제. 한국잔디학회지 13: 223-234
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