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문제 정의
- 암 치료제를 개발하기 위해 전 세계적으로 다양한 연구가 시도되고 있는데, 현재까지 승인된 암치료제의 60% 정도는 식물유래 화합물(예, vin- ceristine, taxanes 등) 또는 미생물(예, dactinomicine, an- thracyclines 등) 등의 자연산물을 이용해 개발되었다(10). 본 연구에서는 전래적으로 다양한 약효가 있다고 알려진 비단풀의 물 주줄물을 제조하여 항산화능과 항암력을 측정하여 신규 소재로서의 가능성을 조사하고자 하였다.
제안 방법
- 항산화물질에 대한 철 이온의 환원력(Fe"가 Fe»로 변화)을 측정하였다(16). 농도에 따른 비단풀의 환원력을 Table1에 나타내었다.
- 4) 에 10분씩 담가세척하는 과정을 3회 반복하여 slide를 건조시켰다. 20 卩L/ mL 농도의 ethidium bromide로 핵을 염 색하여 cover glass 로 덮은 뒤 형광현미경(Leica, Germany) 상에서 관찰하였다. CCD camera(Nikon, Japan)를 통해 보내진 각각의 세포핵 image는 Komet 5.
- 20 卩L/ mL 농도의 ethidium bromide로 핵을 염 색하여 cover glass 로 덮은 뒤 형광현미경(Leica, Germany) 상에서 관찰하였다. CCD camera(Nikon, Japan)를 통해 보내진 각각의 세포핵 image는 Komet 5.0 comet image analyzing system(Kinetic Imaging, UK)이 설치된 컴퓨터 상에서 분석하였다. 백혈구의 hydrogen peroxide에 ■의 한 DNA 손상 및 비 단풀 추출물에 의한 손상억제 정도는 핵으로부터 이동해서 꼬리 부분으로 떨어져 나간 꼬리 부분 내 DNA %함량(% tail DNA)을 측정하여 나타내었다.
- 비단풀 물 추출물의 암세포 성장 억제효과를 측정하기 위하여 MTT assay를 실시하였다. 각각의 암세포주를 96-well plate에 lxltf cells/mL 의 농도로 100 mL씩 분주하여 24시간 동안 37°C, 5% CO2 incubator에서 배양한 후, DMSO에 용해된 비단풀 물 추출물을 각각 5, 10 pg/mL의 농도로 처리하였다. 24시간 후, 각 well에 MTT(5 mg/mL) 용액을 10 uL씩 첨가하이 약 1시간 동안 匸十시 배양한 다음 형성된 formazan을 100 μL의 DMSO에 용해시키고 ELISA reader(Bio-Rad, microplate, model 680, USA)를 이용하여 540 nm에서 흡광도를 측정하였다.
- 백혈구의 hydrogen peroxide에 ■의 한 DNA 손상 및 비 단풀 추출물에 의한 손상억제 정도는 핵으로부터 이동해서 꼬리 부분으로 떨어져 나간 꼬리 부분 내 DNA %함량(% tail DNA)을 측정하여 나타내었다. 각각의 처리구에서 2개의 slide를 만들어 각각 100개 세포의 DNA 손상 정도를 측정하고 각 처리구는 최소 3회 반복 실험하였다.
- 0 comet image analyzing system(Kinetic Imaging, UK)이 설치된 컴퓨터 상에서 분석하였다. 백혈구의 hydrogen peroxide에 ■의 한 DNA 손상 및 비 단풀 추출물에 의한 손상억제 정도는 핵으로부터 이동해서 꼬리 부분으로 떨어져 나간 꼬리 부분 내 DNA %함량(% tail DNA)을 측정하여 나타내었다. 각각의 처리구에서 2개의 slide를 만들어 각각 100개 세포의 DNA 손상 정도를 측정하고 각 처리구는 최소 3회 반복 실험하였다.
- 분리해 놓은 백혈구에 DMSO로 희석한 비단풀 물 추출물(5 mg/mL의 stock solution)을 5, 10, 50 pg/ml丄의 농도로 처리하여 37°C에서 30분간 반응시켰다. 반응이 끝난 후 백혈구를 PBS로 세척한 후 인위적으로 산화적 스트레스를 유발하기 위하여 200 UM의 H2O2를 백혈구에 처리하여 4°C에 5분간 반응시킨 다음 다시 PBS로 세척하였다.
- 비단풀 물 추출물에 대한 각각의 암세포주의 형태학적인 관찰을 위 해 6-well plate에 1 x 105 cells/well로 각각 2 mL씩 분주하여 24시간 동안 37°C, 5% CO2 incubator에서 배양한 후, DMSO로 용해된 비단풀 물 추출물을 각각 5, 10 ug/ mL의 농도로 처리하였다. 비단풀 물 추출물을 처리한 24시간 후, inverted microscope(Nicon, Japan)로 각 well의 세포형태를 100배 배율로 관찰하였다.
- 비단풀 물 추출물을 제조하여 DMSO 용매에 녹인 후 항산화 활성 과 항암활성 을 조사하였 다. 항산화활성 을 10, 100, 250, 500, 1, 000 ug/mL의 농도에서 측정하였을 때, 총 페놀 함량, 라디 칼 소거능-, 환원력은 각각 농도에 의존하여 결과값이 향상되었으며, 1, 000 Ug/mL 농도에서 각각 659.
- 농도로 처리하였다. 비단풀 물 추출물을 처리한 24시간 후, inverted microscope(Nicon, Japan)로 각 well의 세포형태를 100배 배율로 관찰하였다.
- 비단풀 물 추출물의 항암효과를 조사하기 위해 MTT re duction assay 방법을 이용하여 추출물을 처리하지 않은 대조구와 비교하여 비단풀 물 추출물의 암세포 성장억제 효과를 확인하였다. Fig.
- Lysis가" 끝난 후, slide를 electrophoresis tank에 배 열하고 4°C의 차가운 전기 영동 buffer(300 mM NaOH, 10 mM NazEDTA, pH>13)를 채워 40분 동안 unwinding 시켜 DNA 의 alkali labile sites가 드러나게 한 후 25 V/300 + 3 mA의 전압을 걸어 20분간 전기영동을 실시하였다. 빛에 의해 DNA가 부가적으로 손상되는 것을 방지하기 위해 위의 과정은 전기영동 tank를 어두운 천으로 덮은 채 실시하였다. 전기 영동이 끝난 후 0.
- 24시간 후, 각 well에 MTT(5 mg/mL) 용액을 10 uL씩 첨가하이 약 1시간 동안 匸十시 배양한 다음 형성된 formazan을 100 μL의 DMSO에 용해시키고 ELISA reader(Bio-Rad, microplate, model 680, USA)를 이용하여 540 nm에서 흡광도를 측정하였다. 암세포 성장억제효과는 대조구 세포수를 100%로 하였을 때, 상대적인 암세포 성장억제율을 산출하여 결정하였다.
- 총 페놀 함량은 Gutfinger의 방법(11)을 변형하여 측정하였다. 즉, 비단풀 물 추출물 1 mL를 취하여 2%(w/v) Na2CQj용액 1 mL를 가한 후 3분간 방치한 후, 50% FoKn-Ciocalteu 시약 0.
대상 데이터
- (St Louis, MO, USA)에서구입하였고, Folin-Ciocalteu 시약은 Wako Pure Chemical Industries, Ltd.(Osaka, Japan)에서 구입하여 사용하였다. 그 외의 시약 염화철, potassium ferricyanide 등은 모두 일급 이상의 등급을 사용하였다.
- 암세포의 성장억제 효과 실험에 사용된 시약과 세포주 배양에 사용된 시약 중 3-[4, 5- dimethylthiazol-2-yl]-2, 5-diphenyl tetrazolium bromide (MTT)는 Sigma Chemical Co.(St. Louis, MO, USA) 제품을 구입하였고, Rosewell Park Memorial Institute(RPMI) 1640 medium, fetal bovine serum(FBS) 및 penicillin- streptomycin 등은 Gibco-BRL(Grand Island, NY, USA) 에서 구입하였으며, 그 외 연구에 사용된 모든 시약은 주로 특급 및 일급 시약을 사용하였다.
- 2005년도 8〜10월에 경상남도 함안군 가야읍 가야리 189 번지 주변 텃밭에 자생하는 비 단풀 1, 000 g을 채취하여 그늘에서 말린 후 물 1, 000 mL를 첨가하여 끓이면서 40분 동안 가열하여 물 추출물을 제조하였다. 제조한 비단풀 물 추줄물을 회 전감압농축기 (EYELA N-1000, Tokyo Rikakikai Co.
- 건강한 성 인남성 2명으로부터 채혈한 신선한 전혈 5 mL을 Histopaque 1077를 이용해 백혈구만을 분리해낸 후 본실험에 사용하였다.
- 본 실험에 사용된 암세포주는 대장암 유래 세포인 HT-29(human colon carcinoma)와 유방암세포 MCF-7(humanbreast adenocarcinoma pleural effusion)로 한국세포주-은행 (KCLB, Seoul)으로부터 분양 받아 실험에 사용하였다. 세포배양을 위한 배지는 모두 RPMI 1640 medium을 사용호].
- 물 추출물을 제조하였다. 제조한 비단풀 물 추줄물을 회 전감압농축기 (EYELA N-1000, Tokyo Rikakikai Co., Tokyo, JapanX 사용하여 37°C에서 농축하여 2 mg/m丄로 DMSO(dimethyl sulfoxide)에 녹여 적당한 농도로 희석해서 실험에 사용하였다.
데이터처리
- All measurements were done in triplicate, and values are average of three replications. Values not sharing the same letter are significantly different from one another (p<0.05) by Duncan' s multiple range test.
- All measurements were done in triplicate, and values are average of three replications. Values not sharing the same letter are significantly different from one another (p<0.05) by Duncan' s multiple range test.
- 모든 실험은 3회 반복으로 이루어졌으며, 실험 결과는 각항목에 따라 평균치 士표준편차를 구하여 신뢰 수준 95%(p< 0.05)에서 통계적 유의차를 평가하였다.
이론/모형
- DPPH 라디칼 소거능은 Jeong 등의 방법(12)에 준하여 시료 0.1 mL에 41x1(/ M의 DPPH 용액 0.9 mL를 가한 후 상온에서 25분간 반응시켜 517 nm에서 흡광도를 측정하였다. 각 시료의 라디칼 소거능은 아래의 식에 의해 전자공여능으로 계산하여 백분율로 나타내었다.
- 였오며 10% fetal bovine serum(FBS)과 100 unit/mL의 fien- icillin, 100 Hg/mL의 streptomycin을 각각 첨가하여 37℃, 5% CO2 incubator에서 배양하였다. 비단풀 물 추출물의 암세포 성장 억제효과를 측정하기 위하여 MTT assay를 실시하였다. 각각의 암세포주를 96-well plate에 lxltf cells/mL 의 농도로 100 mL씩 분주하여 24시간 동안 37°C, 5% CO2 incubator에서 배양한 후, DMSO에 용해된 비단풀 물 추출물을 각각 5, 10 pg/mL의 농도로 처리하였다.
- 환원력은 Oyaizu의 방법(13)에 따라 측정하였으며, 항산화물질에 대한 철 이온의 환원력을 측정한 것이다. 즉, 1 mL의 인산염 완충 용액 (0.
성능/효과
- 100μg/mL의 농도에서는 100.7 iiM의 결과를 보였으며, 500 μg/mL 농도에서는 387.1 uM, 농도를 2배 증가시킨 1, 000 μg/mL에서는 659.2 uM로 100 ug/mL 농도에 비해 6배 정도의 높은 총 페놀 함량을 보였다. 그리고 농도가 증가할수록 총 페놀 함량도 유의성 있게 높아짐을 알 수가 있었다.
- 라디칼 소거능도 총 페놀 함량처럼 농도에 따라 유의성 있게 활성이 높았다. 250 yg/mL 농도 이상에서 67.9% 이상의 활성을 보였으며, 500 ug/mL 농도에서는 85.1%까지 활성 이 나타났다. 다만 1, 000 ug/mL 농도에서는 86.
- 확인하였다. Fig. 2에서 보는 것처럼, 각각의 암세포 주에 비단풀 물 추출물을 5, 10 ug/mL로 처리하였을 때, 대장암 유래의 암세포주 HT-29에서는 10 ug/mL 농도에서 49%의 생존율을 나타내었고(Fig. 2A), 유방암 유래의 암세포주 MCF-7에서 역시 10 ug/mL 농도에서 60%의 생존율을 확인하였다(Fig. 2B). 또한 비단풀 물 추출물이 각각의 암세포 주에 대한 형태학적 변화에 미치는 영향을 알아보기 위하여 inverted rrdcroscc>pe( x 100)를 이용하여 세포형태를 관찰한 결과, 대조구는 암세포가 조밀하게 정상적으로 성장하는데 반해 비단풀 물 추출물을 5, 10 ug/m也의 농도로 처리한 세포는 결속력이 감소되어 세포 주위가 흐트러지고 세포가 응축되어 사멸되는 것을 관찰할 수 있었다.
- 084의 수치로 높은 활성을 보였다. 그리고 comet assay에서는 비 단풀을 5, 10, 25, 50 卩g/mL의 농도로 백혈구에 처리한 후 hydrogen peroxide 200 uM의 농도로 처 리 하여 DNA 손상을 유도한 결과 손상된 DNA tail 부분의 DNA 함량을 측정한 % fluorescence in tail이 각각 62.3, 39.8, 24.8, 16.4%로 83.0%인 H2O2 처리 양성 대조구에 비해 유의적으로 감소하였다. 항암효과를 조사하기 위한 MTT reduction assay 방법에서는 추출물을 처리하지 않은 대조구와 비단 풀물 추출물의 암세포 성장억제효과 비교시 대장암 유래의 암 세포주 HT-29에서는 10 pg/mL 농도에서 49%의 생존율을 나타내었고, 유방암 유래의 암세포주 MCF-7에서 역시 10 Pg/mL 농도에서 60%의 생존율을 확인하였다.
- 2 uM로 100 ug/mL 농도에 비해 6배 정도의 높은 총 페놀 함량을 보였다. 그리고 농도가 증가할수록 총 페놀 함량도 유의성 있게 높아짐을 알 수가 있었다.
- 농도에 따른 비단풀의 환원력을 Table1에 나타내었다. 농도에 의존하여 환원력이 높아짐을 알 수가 있었으며, DPPH의 결과와 같이 500 ug/mL의 농도와 1, 000 pg/mL 농도의 결과값은 다른 농도의 차이 에 비해서 크게 나타나지 않았다. 250, 500, 1, 000 ug/mL 농도에서 각각 0.
- 2B). 또한 비단풀 물 추출물이 각각의 암세포 주에 대한 형태학적 변화에 미치는 영향을 알아보기 위하여 inverted rrdcroscc>pe( x 100)를 이용하여 세포형태를 관찰한 결과, 대조구는 암세포가 조밀하게 정상적으로 성장하는데 반해 비단풀 물 추출물을 5, 10 ug/m也의 농도로 처리한 세포는 결속력이 감소되어 세포 주위가 흐트러지고 세포가 응축되어 사멸되는 것을 관찰할 수 있었다.
- 1와 같다. 비단풀 물 추출물을 5, 10, 25, 50 iig/mL의 농도로 백혈구에 처리한 후 hydrogen peroxide 200 uM의 농도로 처 리 하여 DNA 손상을 유도한 결과 손상된 DNA tail 부분의 DNA 함량을 측정한 % fluorescence in tail이 각각 62.3, 39.8, 24.8, 16.4%로 83.0%인 H2O2 처 리 양성 대조구에 비해 유의적으로 감소하였다. 즉, 비단풀 물 추출물의 DNA 손상 억제효과는 처리 농도가 높아짐에 따라 유의적으로 증가한 것으로 나타났다.
- 즉, 비단풀 물 추출물의 DNA 손상 억제효과는 처리 농도가 높아짐에 따라 유의적으로 증가한 것으로 나타났다. 이상의 결과에서 비단풀 물 추출물은 산화적 스트레스 유발물질인 hydrogen peroxide에 의 해 유도되 는 DNA 손상을 효과적 으로 억제시키고 있음을 알 수 있었다.
- 0%인 H2O2 처 리 양성 대조구에 비해 유의적으로 감소하였다. 즉, 비단풀 물 추출물의 DNA 손상 억제효과는 처리 농도가 높아짐에 따라 유의적으로 증가한 것으로 나타났다. 이상의 결과에서 비단풀 물 추출물은 산화적 스트레스 유발물질인 hydrogen peroxide에 의 해 유도되 는 DNA 손상을 효과적 으로 억제시키고 있음을 알 수 있었다.
- 과 항암활성 을 조사하였 다. 항산화활성 을 10, 100, 250, 500, 1, 000 ug/mL의 농도에서 측정하였을 때, 총 페놀 함량, 라디 칼 소거능-, 환원력은 각각 농도에 의존하여 결과값이 향상되었으며, 1, 000 Ug/mL 농도에서 각각 659.2 卩M, 86.0%, 1.084의 수치로 높은 활성을 보였다. 그리고 comet assay에서는 비 단풀을 5, 10, 25, 50 卩g/mL의 농도로 백혈구에 처리한 후 hydrogen peroxide 200 uM의 농도로 처 리 하여 DNA 손상을 유도한 결과 손상된 DNA tail 부분의 DNA 함량을 측정한 % fluorescence in tail이 각각 62.
- 0%인 H2O2 처리 양성 대조구에 비해 유의적으로 감소하였다. 항암효과를 조사하기 위한 MTT reduction assay 방법에서는 추출물을 처리하지 않은 대조구와 비단 풀물 추출물의 암세포 성장억제효과 비교시 대장암 유래의 암 세포주 HT-29에서는 10 pg/mL 농도에서 49%의 생존율을 나타내었고, 유방암 유래의 암세포주 MCF-7에서 역시 10 Pg/mL 농도에서 60%의 생존율을 확인하였다. 현재 한약재를 비롯한 농산물 유래의 추출물이 항산화효과와 항암효과를 보이는 연구가 많이 보고되고 있으며, 비단풀도 하나의 천연물 소재로 생리활성물질 탐색에 중요한 천연자원이 될 수 있는 가능성을 확인할 수 있었다.
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