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문제 정의
- 조류는 수중 생태계에서 가장 기본적인 생산자로서 매우 중요하며, 세대기간이 짧아 단시간 내에 독성을 평가할 수 있다는 장점을 가지며, 다양한 산업용수의 생물지표(bio-indicator)로 이용되어져 왔다[1-3, 24], 또한 Chlorella vulgaris 등의 미세조류를 이용하여 화학물질을 96 시간 처리하여 독성을 평가하는 국제지침 역시 마련되어 있으며 [5, 12-14, 16], 국내에서도 OECD 201 지침을 이용하여 수계에서의 미세조류 독성평가를 진행하여 왔다[4, 12], 최근에는 endosulfan을 효율적으로 분해할 수 있는 미세조류선별도 보고되고 있다[11, 19]. 따라서 본 연구에서는 광범위 살충제로 널리 사용되고 있는 endosulfane 수계 독성을 평가하기 위해, 미세조류를 이용하여 반수저해농도(IC50)를결정하고, endosulfane] 화학적, 생물학적 분해산물들의 독성을 비교 평가하였다. 또한 endosulfan을 다양한 pH 상태에서 처리한 후 처리액의 독성을 평가하여 미세조류를 이용한 독성평가의 효율성을 확인하였다.
제안 방법
- Chlorella sp. AG 10002는 21。(: 생장기 (LS-103-2, Lab-Tech Korea, Korea)에서 10일간 전배양 후 사용하였으며, 광도는 5,000 lu>로 조절하였으며 , 명조건과 암조건을 각각 16 시간과 8시간으로 조절하였다. 배양은 조류배양용 배지 BG11 을 이용하였으며, pH 7.
- sp. AG 10002를 접종한 후 96시간동안 배양하면서 세포성장 억제 능으로 평가하였으며, 세포 성장은 세포건조중량 측정 , 배양액의 680 nm에서의 흡광도 측정 및 chlorophyll a 농도측정으로 결정하였다 . 세포건 조중량의 경우에는 0.
- Endosulfan의 무독화 처리가능성과 미세조류 독성평가 시스템을 확인하기 위해 10 mg/L의 endosulfan을 pH 3.0, 4.0, 6.5, 9.0, 및 11.0의 BG11 배지에 각각 첨가하고, 21 ℃ 생장기에서 3일간 처리하였다. 처리 후, 배지내의 잔존 endosulfan 및 분해산물들을 HPLC를 이용하여 정량한 결과, endos나Ifane pH 3.
- 그러나 Ma 등이 보고[13, 14]한 paraquit, diuron, fenoxaprop, nicosulfuran, pendimethalin, atrazine, simazine, cyanazine, promettryne, isoproturon 등의 제초제들의 IGo가 통상 1 mg/L 정도임을 감안하면 endos니Ifa日의 독성은 미세조류에게 제초제보다 맹독성으로 작용하지는 않음을 알 수 있으며, 제초제 중에서는 Diclofbp-p, haloxyfbp-R, flumetsulam, Anilfbs, butachkn와 유사한 독성정도를 나타내었다. 동일한 실험을 0, 1, 5, 7, 5, 10, 15, 25, 30, 50 mg/L의 농도의 endosulfan 및 알려진 대사산물들에 대해 수행하고, linear regression을 통해 반수저해농도(IC50)를 각각 결정하였다 (Table 2). 그 결과, 독성 정도는 endosulfan > endosulfan sulfate > endosulfan lactone>endosulfan ether 순으로 나타났으며 , endosulfan di아은 50 mg/L 농도까지 반수저 궁!]가 나타나지 않았다.
- 따라서 본 연구에서는 광범위 살충제로 널리 사용되고 있는 endosulfane 수계 독성을 평가하기 위해, 미세조류를 이용하여 반수저해농도(IC50)를결정하고, endosulfane] 화학적, 생물학적 분해산물들의 독성을 비교 평가하였다. 또한 endosulfan을 다양한 pH 상태에서 처리한 후 처리액의 독성을 평가하여 미세조류를 이용한 독성평가의 효율성을 확인하였다. 이러한 결과는 다양한 오염물질 및 대사산물의 상대적인 독성평가 뿐만 아니라, endosulfan의 무독화 균주개발, 무독화 공정개발에 유용하게 이용될 수 있다.
- 미세조류를 이용한 독성평가의 효율성을 검토하기 위해, 10 mg/L의 endosulfan이 포함된 BG11 배지 (pH 7.2)를 1N HCl 및 IN NaOH 용액을 이용하여 각각 3.0, 4.0, 6.5, 9.0, 및 1LQ으로 조정하고, 21℃ 생장기에서 3일간 방치하여, 산, 알카리 용액상태에서 endosulfMi의 자연적 변환 및 알카리가수분해를 유도하였다[8, 9, 2이. 이후 BG11 배지의 pH를 다시 7.
- , Germany)를 이용하여 미세조류를 회수한 후, 수질오염 공정시험법에 준하여 측정하였다[12]. 반수저해농도(IC50)는 미세조류 배양액에 endosulfan 및 이의 대사산물들을 각각 0, 1, 5, 7, 5, 10, 15, 25, 30, 50 mg/L의 농도로 첨가한 후, 24시간 간격으로 세포 성장을 측정하면서, 96시간 배양시 50% 생육저해가 나타나는 농도를 linear regression(Sigmaplot 2000, Ver7.0, SPSS Inc. U.S.A.)방법으로 계산하였다.
- 배지의 잔존 endosulfan 및 endosulfan 전횐물질은 HPLC 를 이용하여 정량하였다. 먼저 배지 부피의 2배량의 methylene chloride를 첨가하여 10분간 교반 후 상층액을 회수하고, 이를 2회 반복한 후 회수된 상층액은 Speed-Vac (VS-802, Vision Co.
- 14]. 본 실험에서는 endosulfan 및 endosulfan 전환물질들을 acetone과 methanol0]] 녹여, BG11 배지에 첨가하였으며, 배지내 최종농도는 각각 0.2%였다. 이 경우-acetone 과 methanol 자체가 미세조류 성장에 심각한 영향을 나타내지는 않았으나, acetone 사용의 경우 methanol 사용보다 상대적으로 미미한 성장저해가 나타났다(결과 미제시).
- 71 mg/L가 확인되어, 기존의 보고에서처럼 알카리조건에서 endosulfane 주로 endosulfan diol로 분해됨 [8, 9]을 확인하였다. 이후, 다양한 pH에서 endosulfan을 처리한 배지에 다시 미세조류를 접종하여 endosulfan 및 분해산물들이 포함된 배지의 독성을 미세조류 성장저해를 통해 평가하였으며, 그 결과는 Fig. 4에 나타내었다. 그 결과 무처리구에서는 정상적인 성장이 나타났으며, 10 mg/L endosulfan을 처리한 경우 세포생육이 54%로 감소되었다.
- 초기 흡광도 0.2로 조정한 미세조류 배양액에 다양한 농도의 endosulfan을 첨가하여 96시간 배양하면서 경시적으로 배양액의 흡광도를 측정하여 생육저해 독성을 평가하였다. 그 결과 농도 증가에 따라 독성이 비례적으로 증대되었으며, 특히 1 mgL의 endosulfan 처리시에도 생육도는 76% 정도로 감소되어(Fig.
- 한편 세포 성장저해를 손쉽게 측정하기 위해, 세포건조 중량과 배양액의 흡광도, 아Mrophyll a의 농도의 상호 연관 관계를 평가하였다. 그 결과 세포 건조중량(DCW)과 흡광도 (OD)는 직선 비례관계를 나타내었으며, DCW=302.
대상 데이터
- Chlorella sp. AG 10002 를 한국생명공학연구원 생물자원센터(KCTC)에서 분양받아 사용하였다. Endosulfan 및 이의 전환체들은 acetone에 녹여 사용하였으며, acetone 및 methanole 각각 Merck Co.
- AG 10002 를 한국생명공학연구원 생물자원센터(KCTC)에서 분양받아 사용하였다. Endosulfan 및 이의 전환체들은 acetone에 녹여 사용하였으며, acetone 및 methanole 각각 Merck Co. (Darmstadt, Germany)의 제품을 사용하였다.
- Endosulfan, endosulfan lactone, endosulfan diol, endosulfan sulfate 및 endosulfan ether는 Aldrich Chemical Co. (Milwaukee, WI, U.S.Ay}에서 구입하여 사용하였으며, 각각의 구조는 Fig. 1에 나타내었다. Chlorella sp.
- AG 10002는 21。(: 생장기 (LS-103-2, Lab-Tech Korea, Korea)에서 10일간 전배양 후 사용하였으며, 광도는 5,000 lu>로 조절하였으며 , 명조건과 암조건을 각각 16 시간과 8시간으로 조절하였다. 배양은 조류배양용 배지 BG11 을 이용하였으며, pH 7.2이며, 조성은 Table 1에 나타내었다.
이론/모형
- AG 10002를 접종한 후 96시간동안 배양하면서 세포성장 억제 능으로 평가하였으며, 세포 성장은 세포건조중량 측정 , 배양액의 680 nm에서의 흡광도 측정 및 chlorophyll a 농도측정으로 결정하였다 . 세포건 조중량의 경우에는 0.45 pim membrane filter(Millipore, Ireland), 흡광도 측정에는 UV-Vis spectrophotometer(Hitachi U-3010, Japan)를 사용하였으며, chlorophyll a 농도는 배양액 100 ml를 GF-50 glass fibre paper(Schleicher and Schuell Co., Germany)를 이용하여 미세조류를 회수한 후, 수질오염 공정시험법에 준하여 측정하였다[12]. 반수저해농도(IC50)는 미세조류 배양액에 endosulfan 및 이의 대사산물들을 각각 0, 1, 5, 7, 5, 10, 15, 25, 30, 50 mg/L의 농도로 첨가한 후, 24시간 간격으로 세포 성장을 측정하면서, 96시간 배양시 50% 생육저해가 나타나는 농도를 linear regression(Sigmaplot 2000, Ver7.
성능/효과
- 2로 조정한 미세조류 배양액에 다양한 농도의 endosulfan을 첨가하여 96시간 배양하면서 경시적으로 배양액의 흡광도를 측정하여 생육저해 독성을 평가하였다. 그 결과 농도 증가에 따라 독성이 비례적으로 증대되었으며, 특히 1 mgL의 endosulfan 처리시에도 생육도는 76% 정도로 감소되어(Fig. 3), endosulfane 강한 독성을 확인할 수 있었다. 또한 25 mg/L 및 50 mg/L의 고농도 처리 시에는 생육이 완전히 정지되었으며, 실제 흡광도는 0.
- 4에 나타내었다. 그 결과 무처리구에서는 정상적인 성장이 나타났으며, 10 mg/L endosulfan을 처리한 경우 세포생육이 54%로 감소되었다. 그러나 pH 3.
- 평가하였다. 그 결과 세포 건조중량(DCW)과 흡광도 (OD)는 직선 비례관계를 나타내었으며, DCW=302.57 OD-8.396의 상관식을 얻을 수 있었다(Fig. 2a). 이는 Kasai 등[5] 의 보고한 세포농도 및 세포수는 680 nm5] 흡광도와 잘 일치한다는 내용과 일치한다.
- 그 결과 무처리구에서는 정상적인 성장이 나타났으며, 10 mg/L endosulfan을 처리한 경우 세포생육이 54%로 감소되었다. 그러나 pH 3.0, 4.0, 및 11.0에서 3일간 전 처리한 endosulfan의 경우, 세포생육은 각각 84%, 95% 및 67%로 독성이 감소되었으며, pH 6.5 및 pH 9.0 에서는 세포 생육이 각각 31% 및 36%로 나타났다. 따라서, endosulfan을 알카리 처리시에 미세조류에 대한 무독화가 가능함을 확인하였다.
- 그러나 오염물질이 통상, 수계에서 다른 화합물로 전환되며, 심지어 더욱 독성이 강한 물질로 변환될 수 있으며, 수계 생명체에 강한 독성을 나타내는 endosulfan의 경우에도 화학적, 생물학적 분해로 인하!] endosulfan sulfate, endosulfan diol, endosulian ether, endosulfan lactone 등으로 변환됨이 알려져 있다:8-11]. 따라서 endosulfan의 수계에서의 독성평가를 위해서는 이미 보고한 동물세포, 효모 또는 지렁이를 이용한 독성평가[20-22]보다 미세조류를 이용하는 것이 보다 효율적이라고 판단된다. 조류는 수중 생태계에서 가장 기본적인 생산자로서 매우 중요하며, 세대기간이 짧아 단시간 내에 독성을 평가할 수 있다는 장점을 가지며, 다양한 산업용수의 생물지표(bio-indicator)로 이용되어져 왔다[1-3, 24], 또한 Chlorella vulgaris 등의 미세조류를 이용하여 화학물질을 96 시간 처리하여 독성을 평가하는 국제지침 역시 마련되어 있으며 [5, 12-14, 16], 국내에서도 OECD 201 지침을 이용하여 수계에서의 미세조류 독성평가를 진행하여 왔다[4, 12], 최근에는 endosulfan을 효율적으로 분해할 수 있는 미세조류선별도 보고되고 있다[11, 19].
- 비록 Lee 등[12]은 660 nm의 홉광도와 chlorophyll a 농도가 잘 일치한다는 보고를 하였으나, 680 nm에서의 흡광도와도 잘 일치함을 알 수 있었다. 따라서 세포생육 평가는 660 nm 및 680 nm에서 모두 가능하리라 추측되며, 실제 사용된 기본배지에서는 680 nm에서의 흡광도가 660 nm에서보다 3-5% 정도 낮은 값을 나타내어, 보다 정확한 평가가 가능하리라 판단되었다. 이러한 결과는 세포건조중량과 chlorophyll a 농도가 직선 관계에 있음을 고려할 떼 (Fig.
- 0 에서는 세포 생육이 각각 31% 및 36%로 나타났다. 따라서, endosulfan을 알카리 처리시에 미세조류에 대한 무독화가 가능함을 확인하였다. 그러나 pH 3, 또는 4 처리시어), pH 11 처리시보다 상대적으로 endosulfan의 잔존농도가 높음에도 불구하고, 미세조류의 우수한 성장이 나타났는데 , 이에 대한기작은 차후 규명하여야 할 것이다.
- 3), endosulfane 강한 독성을 확인할 수 있었다. 또한 25 mg/L 및 50 mg/L의 고농도 처리 시에는 생육이 완전히 정지되었으며, 실제 흡광도는 0.15 정도로 초기 세포농도보다 오히려 약한 감소가 나타났다. 이는 세포 수의 급격한 감소^- 없음을 고려할 때 , endosulfan의 고농도처리 시 chlorophyll a 합성 억제 및 색소파괴가 나타나는 것으로 추측된다.
- 1 mg/L가 잔존하여, pH 4 이하의 스]:성조건 및 pH 11의 알카리조건에서 endosulfane] 분해됨을 알 수 있었다. 또한 endosulfan 분해산물로는 endosulfan diol과미확인 물질peak이 검출되었으며, 각각의 pH에서 endosulfan diol의 농도는 0.85, 0.38, 0.32, 2.02, 4.71 mg/L가 확인되어, 기존의 보고에서처럼 알카리조건에서 endosulfane 주로 endosulfan diol로 분해됨 [8, 9]을 확인하였다. 이후, 다양한 pH에서 endosulfan을 처리한 배지에 다시 미세조류를 접종하여 endosulfan 및 분해산물들이 포함된 배지의 독성을 미세조류 성장저해를 통해 평가하였으며, 그 결과는 Fig.
- 따라서 세포생육 평가는 660 nm 및 680 nm에서 모두 가능하리라 추측되며, 실제 사용된 기본배지에서는 680 nm에서의 흡광도가 660 nm에서보다 3-5% 정도 낮은 값을 나타내어, 보다 정확한 평가가 가능하리라 판단되었다. 이러한 결과는 세포건조중량과 chlorophyll a 농도가 직선 관계에 있음을 고려할 떼 (Fig. 2c), 680 nm에서 흡광도 측정이 간편하면서도 정확하게 세포 성장을 결정할 수 있음을 알 수 있으며, 이후 실험에서의 세포성장은 680 nm의 흡광도로 표시하였다.
- 0의 BG11 배지에 각각 첨가하고, 21 ℃ 생장기에서 3일간 처리하였다. 처리 후, 배지내의 잔존 endosulfan 및 분해산물들을 HPLC를 이용하여 정량한 결과, endos나Ifane pH 3.0, 4.0, 6.5, 9.0, 및 11.0에서 각각 6.7, 7.4, 9.5, 8.1, 5.1 mg/L가 잔존하여, pH 4 이하의 스]:성조건 및 pH 11의 알카리조건에서 endosulfane] 분해됨을 알 수 있었다. 또한 endosulfan 분해산물로는 endosulfan diol과미확인 물질peak이 검출되었으며, 각각의 pH에서 endosulfan diol의 농도는 0.
후속연구
- 따라서, endosulfan을 알카리 처리시에 미세조류에 대한 무독화가 가능함을 확인하였다. 그러나 pH 3, 또는 4 처리시어), pH 11 처리시보다 상대적으로 endosulfan의 잔존농도가 높음에도 불구하고, 미세조류의 우수한 성장이 나타났는데 , 이에 대한기작은 차후 규명하여야 할 것이다. 현재로는, pH 3, 또는 4 의 산성조건에서 만들어진 endosulfan 분해산물, 또는 전환체가 미세조류 성장을 촉진시키는 효과, 또는 endosulfan의 독성을 상쇄시키는 효과가 있을 것으로 추측된다.
- 이러한 결과는 화학적 분석에 따른 endosulfane 독성추측법과 함께, 생물학적 독성평가의 필요성을 제시하고 있으며, 또한 특정 오염물질뿐만 아니라 오염물질의 전환체 및 대사산물들의 독성평가도 필요함을 제시한다. 또한 본 연구결과는 미세조류를 이용한 수계에서의 오염물질 독성평가가 효율적임을 확인하였으며, 이러한 생물독성평가를 기반으로 하여, endosulfan의 무독화 공정개발 및 무독화 균주개발 등에 이용될 것이다.
- 그러나 pH 3, 또는 4 처리시어), pH 11 처리시보다 상대적으로 endosulfan의 잔존농도가 높음에도 불구하고, 미세조류의 우수한 성장이 나타났는데 , 이에 대한기작은 차후 규명하여야 할 것이다. 현재로는, pH 3, 또는 4 의 산성조건에서 만들어진 endosulfan 분해산물, 또는 전환체가 미세조류 성장을 촉진시키는 효과, 또는 endosulfan의 독성을 상쇄시키는 효과가 있을 것으로 추측된다. 이러한 결과는 화학적 분석에 따른 endosulfane 독성추측법과 함께, 생물학적 독성평가의 필요성을 제시하고 있으며, 또한 특정 오염물질뿐만 아니라 오염물질의 전환체 및 대사산물들의 독성평가도 필요함을 제시한다.
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