포유류의 조직에 널리 분포되어 있으며 혈압 조절에 중요한 역할을 하는 Angiotensin-converting enzyme(ACE)은 아연을 함유하는 dipeptidase로서 angiotensin I을 가수분해하여 강력한 혈압상승제인 angiotensin II를 생성하는 효소이다. 최근에 돼지의 난소에서 ACE 활성이 측정되었으며, 돼지의 신장에서 ACE 단백질이 분리되어 그 특성이 알려졌다. 그러나 돼지의 어떠한 ACE DNA 염기서열도 아직까지 보고 된 바는 없다. 그러므로 본 연구에서 reverse transcriptase-polymerase chain reaction(RT-PCR)을 이용하여 돼지의 신장 ACE cDNA를 클로닝하고 그 염기서열을 분석하였다. ACE cDNA는 1309개의 아미노산으로 구성되어 있으며 그 분자량은 150kDa이다. 염기서열로부터 유추한 아미노산의 서열을 분석한 결과, N 말단의 33개 아미노산이 signalpeptide 역할을 하는 것으로 보이며, C 말단 근처의 짧은 transmembrane 영역은 세포막에 anchor역할을 하는 것으로 보인다. 돼지 신장의 ACE에서 두 개의 매우 유사한 amino acid peptidase domain은 tandem duplication 되어 있으며, 각각의 domain은 다른 포유류의 체세포 ACE들과 마찬가지로 putative metal-binding site(His-Glu-Met-Gly-His)를 하나씩 가지고 있는 것으로 나타났다. 돼지 신장 ACE 서열과 인간, 토끼, 쥐 등과 같은 포유류의 ACE 아미노산 서열들과의 상동성 비교는 진화과정 중 두 domain이 매우 잘 보전되어 왔음을 보여주고 있다.
포유류의 조직에 널리 분포되어 있으며 혈압 조절에 중요한 역할을 하는 Angiotensin-converting enzyme(ACE)은 아연을 함유하는 dipeptidase로서 angiotensin I을 가수분해하여 강력한 혈압상승제인 angiotensin II를 생성하는 효소이다. 최근에 돼지의 난소에서 ACE 활성이 측정되었으며, 돼지의 신장에서 ACE 단백질이 분리되어 그 특성이 알려졌다. 그러나 돼지의 어떠한 ACE DNA 염기서열도 아직까지 보고 된 바는 없다. 그러므로 본 연구에서 reverse transcriptase-polymerase chain reaction(RT-PCR)을 이용하여 돼지의 신장 ACE cDNA를 클로닝하고 그 염기서열을 분석하였다. ACE cDNA는 1309개의 아미노산으로 구성되어 있으며 그 분자량은 150kDa이다. 염기서열로부터 유추한 아미노산의 서열을 분석한 결과, N 말단의 33개 아미노산이 signal peptide 역할을 하는 것으로 보이며, C 말단 근처의 짧은 transmembrane 영역은 세포막에 anchor역할을 하는 것으로 보인다. 돼지 신장의 ACE에서 두 개의 매우 유사한 amino acid peptidase domain은 tandem duplication 되어 있으며, 각각의 domain은 다른 포유류의 체세포 ACE들과 마찬가지로 putative metal-binding site(His-Glu-Met-Gly-His)를 하나씩 가지고 있는 것으로 나타났다. 돼지 신장 ACE 서열과 인간, 토끼, 쥐 등과 같은 포유류의 ACE 아미노산 서열들과의 상동성 비교는 진화과정 중 두 domain이 매우 잘 보전되어 왔음을 보여주고 있다.
Angiotensin converting enzyme(ACE) is a zinc-containing dipeptidase widely distributed in mammalian tissues and is thought to play a significant role in blood pressure regulation by hydrolyzing angiotensin I to the potent vasoconstrictor, angiotensin II. Recently, the presence of ACE in pig ovary wa...
Angiotensin converting enzyme(ACE) is a zinc-containing dipeptidase widely distributed in mammalian tissues and is thought to play a significant role in blood pressure regulation by hydrolyzing angiotensin I to the potent vasoconstrictor, angiotensin II. Recently, the presence of ACE in pig ovary was reported and the ACE from pig kidney was isolated and characterized. However no nucleotide sequence of the ACE gene from pig is yet known. We report here the cloning of the ACE cDNA from pig kidney by using the reverse transcriptase-polymerase chain reaction. The complete amino acid sequence deduced from the cDNA contains 1309 residues with a molecular mass of 150 kDa, beginning with a signal peptide of 33 amino acids. Amino acid sequence analysis showed that pig kidney ACE is also probably anchored by a short transmembrane domain located near the C-terminus. This protein contains a tandem duplication of the two homologous amino acid peptidase domain. Each of these two domains bears a putative metal-binding site (His-Glu-Met-Gly-His) identified in mammalian somatic ACE. The alignment of pig ACE amino acid sequence with human, rabbit, and mouse reveals that both two domains have been highly conserved during evolution.
Angiotensin converting enzyme(ACE) is a zinc-containing dipeptidase widely distributed in mammalian tissues and is thought to play a significant role in blood pressure regulation by hydrolyzing angiotensin I to the potent vasoconstrictor, angiotensin II. Recently, the presence of ACE in pig ovary was reported and the ACE from pig kidney was isolated and characterized. However no nucleotide sequence of the ACE gene from pig is yet known. We report here the cloning of the ACE cDNA from pig kidney by using the reverse transcriptase-polymerase chain reaction. The complete amino acid sequence deduced from the cDNA contains 1309 residues with a molecular mass of 150 kDa, beginning with a signal peptide of 33 amino acids. Amino acid sequence analysis showed that pig kidney ACE is also probably anchored by a short transmembrane domain located near the C-terminus. This protein contains a tandem duplication of the two homologous amino acid peptidase domain. Each of these two domains bears a putative metal-binding site (His-Glu-Met-Gly-His) identified in mammalian somatic ACE. The alignment of pig ACE amino acid sequence with human, rabbit, and mouse reveals that both two domains have been highly conserved during evolution.
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제안 방법
0), 10 mM of MgCl2, 5 mM DTT, 10% glycerol, 2mM 0-mercaptoethanol] 에 匸}시녹였다. 균현탁액 10 m;를 4。(3에서 30% pulse cycled 30초간ultrasonication 처리를 한 다음 total protein extract를 loading dye와 1:1 로 혼합하여 3분간 가열 후 8% sodiumdodesylsulfate (SDS)-polyacrylamide gel electrophoresis(PAGE)> 수행하여 과발현된 단백질의 크기를 확인하였다.
부위가있다.2。)그러므로 돼지 신장의 ACE에서 이러한 부위들을 조사하기 위해 TMHMM(CBS, Denmark) 프로그램을 사용하여 분석하였다. 그 결과 N 말단의 앞쪽 33개의 소수성 아미노산 잔기들은 signal peptideS 보이며 C-말단의 뒤쪽 20개의 소 수성 아미노산 잔기들은 세포막에 anchor되는 부위로 보여진다(Fig.
ACE cDNA 클로닝을 위한 5'-end primer, 3'-end primer 및 internal primer들의 염기서열은 이미 발표된 다른 종의 ACE 염기서열들을 비교하여 degenerated primer를 합성하였다(Table 1). 예상되는 ACE cDNA의 크기가 4kh로 한번의 PCR로 얻기에는 합성에 어려움이 있어 여러 작은 단편의 DNA로 증폭시키고 연결하고자 내부의 잘 보존된 염기서열을 이용하여 internal primer를 합성하였다.
0 프로그램을 이용하目 전체 염기서열에 대한 제한효소의 restriction map을 구하였다(data not shown). Pig kidney ACE와 기존에 발표된 다른 종과의 상동성을 분석하기 위해 Clustal W 프로그램勺을 이용하여 protein multiple sequence alignr皿ent를 시행하였다.
합성된 cDNA 혼합물로부터 ACE DNA 단편을 증폭시키기 위한 PCR 반응조건은 다음과 같다. Taq DNA polymerase (5 U/p/) 0.5 讨, 10 x PCR buffer 5 p, /, 25 mM dNTP mixture(2.5 mM each) 8.0卩/ template cDNA, degenerated primers lOpmol 에멸균수를 첨가하여 전체 50 卩/로 하였다. 혼합액을 95P에서 1 분간 반응시킨 후, 95°C 30초 (denaturation), 55°C 30초 (annealing), 72°C 2분(polymerization)의 순환과정을 35 cycle 반복하고 마지막으로 72°C 5분을 행하였다.
cDNA 합성 및 subcloning. cDNA synthesis kit를 사용하여 돼지의 신장에서 추출한 total RNA로부터 cDNA를 합성하였다. total RNA 4赋2S 昭)을 0.
"'7) Human의 경우는 단일 폴리펩티드 사슬로 이루어진 endothelial ACE와 testicular ACE가 알려져 있으며 testicular ACE의 아미노산 서열은 endothelial ACE의 C- 말단 부위와 동일한 것으로 밝혀졌다「°网 최근 돼지 난자에서 ACE 활성이 알려지고 신장의 ACE 단백질이 분리 정제되어 그 생화학적 특성이 보고 된 바 있으나 아직 돼지의 어떤 ACE 염기서열도 알려지지는 않았다.淄 따라서 본 연구에서는 돼지의 신장에서 total mRNA를 분리한 다음 RT-PCR을 이용하여 ACE cDNA를 합성하고 그 염기서열을 결정하여 기존에 밝혀진 다른 동물의 ACE 염기서열과 비교하였다.
5 Dye Termination Cycle Sequencing Kit를 사용하였다. 각 plasmid에 클론된 ACE DNA 단편들의염기서열을 모두 결정한 다음 그 서열들을 중복하여 돼지 신장의 ACE cDNA의 최종 염기서열을 결정하였다. 앞서 구성한 recombinant plasmid에 삽입된 ACE DNA 단편들을 서로 직접연결시키기 위해 Webcutter 2.
ACE의 과발현. 돼지 신장의 ACE가 대장균에서 잘 발현되는지 확인하기 위하여 전체 cDNA가 클로닝된 pTP12 plasmid를 E. coli NovaBlue에 도입하였다. 형질전환체가 대수기에 도달했을 때 IPTG를 최종농도 0.
2 kb의 DNA 단편을 정제하였다. 또한 ACE gene의 3, -말단부위를 포함하는 pTP-72 plasmid를 역시 동일한제한효소로 처리한 후 이 1.2kb DNA 단편을 접합시켜 약 4 kb의 전체 ACE 유전자를 포함하는 pTP-12 plasmid를 구성하였다(Fig. 1). 이 접합과정에서 전체 ACE gene의 5, -말단과 3'- 말단 부위를 제외하고는 내부의 연결부위중 degenerate primer 염기서열이 포함된 부분은 제거되었다.
이 8종의 plasmicHl 클론된 ACE DNA 단편들의 염기서열을 모두 결정하였다. 부분적으로 클로닝된 ACE DNA 단편을 연결하기 위하여 ACE gene의 5, -말단부위를 포함하는 pTP-114 plasmid를 제한효소 Xho I과 BstP I 으로 절단하여 1.2 kb의 DNA 단편을 정제하였다. 또한 ACE gene의 3, -말단부위를 포함하는 pTP-72 plasmid를 역시 동일한제한효소로 처리한 후 이 1.
각 plasmid에 클론된 ACE DNA 단편들의염기서열을 모두 결정한 다음 그 서열들을 중복하여 돼지 신장의 ACE cDNA의 최종 염기서열을 결정하였다. 앞서 구성한 recombinant plasmid에 삽입된 ACE DNA 단편들을 서로 직접연결시키기 위해 Webcutter 2.0 프로그램을 이용하目 전체 염기서열에 대한 제한효소의 restriction map을 구하였다(data not shown). Pig kidney ACE와 기존에 발표된 다른 종과의 상동성을 분석하기 위해 Clustal W 프로그램勺을 이용하여 protein multiple sequence alignr皿ent를 시행하였다.
여러 primer들을 조합하여 합성된 8개의 ACE DNA 단편들을 pTOPO vector에 각각 ligation 시킨 후 E. coli DH5a에형질전환 하였다. E.
1). 예상되는 ACE cDNA의 크기가 4kh로 한번의 PCR로 얻기에는 합성에 어려움이 있어 여러 작은 단편의 DNA로 증폭시키고 연결하고자 내부의 잘 보존된 염기서열을 이용하여 internal primer를 합성하였다.
2 kb)을 얻었다. 이단편들을 pTOPO vectoi에 클로닝하여 각각 pTP-36, pTP-18, pTP-52, pTP-312, pTP-114, pTP-74, pTP-32 및 pTP-72 plasmid를 구성흐}였다(Fig. 1). 이 8종의 plasmicHl 클론된 ACE DNA 단편들의 염기서열을 모두 결정하였다.
대장균에서 과발현. 전체 cDNA가 cloning된 pTP12 plasmid 를 E. coli NovaBlue에 도입시키고 LB 액체배지에서 배양하여 A硕이 약 0.8이 되었을 때 최종농도 0.5 mM이 되도록 IPTG를첨가하였다. A硕이 약 1.
coli NovaBlue에 도입하였다. 형질전환체가 대수기에 도달했을 때 IPTG를 최종농도 0.5 mM이 되도록 첨가하여 ACE protein을 과발현시켰다. 과발현시킨 형질전환체의 total protein extracts를 SDS-polyacrylamide gel에서 확인한 결과 IPTG를 처리하지 않은 형질전환체에 비해 새로이 생성된 약 150kDa의 protein band를 확인할 수 있었다(Fig.
데이터처리
9kDa 의 ACE가 알려져 있다.17)이와 같이 기존의 알려진 human, mouse, rabbit 등의 서 열과 돼지 신장 ACE의 염 기서열과 deduced 아미노산 서열을 비교분석하기 위하여 Clustal W program을 이용하여 multiple sequence alignment를 시행하고 그 결과를 Table 2에 정리하였다.
이론/모형
분리 및 primer 제작. 시료를 막자사발에 5 g 정도 넣고 액화질소를 넣어가며 막자로 미세하게 마쇄시킨 다음, total RNA는 AGTC(acid guanidium thiocyanate) 법")에 따라 분리하였다.
coli DH5a에형질전환 하였다. E. co”에서 plasmid DNA의 분리와 정제는 alkali lysis 방법을 사용하였다.西
염기서열 분석. 염기서열 분석은 APB사의 SEQ 4x4 personal sequencing system을 이용하였다. Sequencing 반응은 Thermo Sequenase Cy5.
성능/효과
지닌 것으로 알려져 있다.'令 돼지 신장의 ACE의 경우도 BLAST 프로그램을 통해 매우 동일한 2개의 domain으로 구성되어 있고 각각 독립적인 putative catalytic site를 갖는다는 것을 확인할 수 있었다(Fig. 2). 돼지 신장의 ACE 동일 분자내에 두 N domain과 C domain 사이의 구조적 유사성을 Clustal W 프로그램으로 분석한 결과 81%의 유사성을 보였으며 다른 종과의 아미노산 비교에서와 마찬가지로 putative active site 부위에서는 95%의 높은 유사성을 보였다 (Fig.
isozyme이 있다.7,8) endothelial isozyme은 매우 유사한두개의 domain으로 구성되어 있으며 각각 catalytic site 추정부위를 지니고 있는 반면 작은 크기의 testicular isoz可me은 endothelial isozyme의 C-말단 domain에 해당하며 하나의 catalytic site 만을 가지고 있다. 이들은 대부분 세포막에 걸려있으며 C-말단 부근에 위치한 일련의 소수성 폴리펩티드들이막을 관통하여 매달려 있고 N-glycosylation이 광범위하게 분포되어 있으며 testicular isozqme은 O-glycosylation 되어 있기도하다.
5 mM이 되도록 첨가하여 ACE protein을 과발현시켰다. 과발현시킨 형질전환체의 total protein extracts를 SDS-polyacrylamide gel에서 확인한 결과 IPTG를 처리하지 않은 형질전환체에 비해 새로이 생성된 약 150kDa의 protein band를 확인할 수 있었다(Fig. 4).
2。)그러므로 돼지 신장의 ACE에서 이러한 부위들을 조사하기 위해 TMHMM(CBS, Denmark) 프로그램을 사용하여 분석하였다. 그 결과 N 말단의 앞쪽 33개의 소수성 아미노산 잔기들은 signal peptideS 보이며 C-말단의 뒤쪽 20개의 소 수성 아미노산 잔기들은 세포막에 anchor되는 부위로 보여진다(Fig. 2).
2). 돼지 신장 ACE는 단일 폴리펩티드 사슬로 구성되어 있으며 등전점은 6.03, 분자량은 150kDa에 해당하는 것으로 계산되었다. Human의 경우 endothelial ACE는 1306개의 아미노산 잔기로 이루어진 단일 폴리펩티드 사슬로 분자량은 146.
돼지 신장 ACE의 cDNA 염기서열과 아미노산서열은 비교한서열들과 각각 82-83% 및 81-84%의 유사성을 나타냈다. 또한돼지 신장 ACE는 비교한 서열 중 rabbit의 염기서열과는 83%, rabbit의 아미노산 서열과는 84%로 가장 높은 유사성을 보였다.
2). 돼지 신장의 ACE 동일 분자내에 두 N domain과 C domain 사이의 구조적 유사성을 Clustal W 프로그램으로 분석한 결과 81%의 유사성을 보였으며 다른 종과의 아미노산 비교에서와 마찬가지로 putative active site 부위에서는 95%의 높은 유사성을 보였다 (Fig. 3). 이러한 결과는 다른 endothelial ACE와 마찬가지로 돼지 신장의 ACE 역시 두 domain0] duplication되어 구성되고 그 활성부위가 잘 보존되어 왔음을 나타낸다고 볼 수 있다
돼지 신장 ACE eDNA의 클로닝. 돼지의 신장으로부터 total RNA를 분리 정제한 다음 RFPCR로 cDNA를 만들고 degenerate primer 및 internal primer> 이용하여 모두 8개의 ACE DNA 단편(0.7, 0.77, 1.0, 1.1, 1.3, 1.5, 1.7 및 3.2 kb)을 얻었다. 이단편들을 pTOPO vectoi에 클로닝하여 각각 pTP-36, pTP-18, pTP-52, pTP-312, pTP-114, pTP-74, pTP-32 및 pTP-72 plasmid를 구성흐}였다(Fig.
또한돼지 신장 ACE는 비교한 서열 중 rabbit의 염기서열과는 83%, rabbit의 아미노산 서열과는 84%로 가장 높은 유사성을 보였다.
염기서열 및 아미노산서열의 분석. 염기서열 분석 결과 돼지신장의 ACE cDNA는 3930개의 염기로 구성되어 있으며 (GenBank accession number: EF121312) 모두 1309개의 아미노산을 암호화하고 있는 것으로 나타났다(Fig. 2). 돼지 신장 ACE는 단일 폴리펩티드 사슬로 구성되어 있으며 등전점은 6.
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