Bacillus subtilis BB-1 (KFCC l1344P)으로부터 분리된 혈전용해효소 유전자 (BCF-1)를 대량발현 벡터인 pEB 벡터에 크로닝하여 순수분리 된 혈전용해효소를 rat 경구 투여하여 출혈시간, 혈액의 응고, serum의 혈전용해능 등에 대한 in vivo 실험을 실시하였으며, 혈전용해효소의 단회경구투여에 따른 독성을 검사하였다. 효소의 경구투여에 따른 rat의 출혈시간에서는 대조군에 비하여 모든 경구 투여군에서 출혈시간이 유의적으로 약 1.75배 이상 길게 나타남을 확인하였고(P<0.05), 혈액의 출혈시간 또한 활발히 진행됨을 관찰하였다. 혈액으로부터 분리된 serum의 혈전용해작용 있어서는 경구투여 후 1시간부터 채혈한 혈액 내에서 혈전용해효소의 활성이 검출되기 시작하여 3시간째까지 높은 활성을 보였으며 4시간째부터 서서히 활성이 감소하는 것을 확인하였고 혈액의 응고 역시 대조군에 비하여 경구 투여군에서 상당히 지연되는 것을 알 수 있었다. Western blot에 의한 효소 검출에서는 경구 투여군에서 30,000 Da 크기의 단일밴드를 확인하였으며, 혈전용해효소의 rat에 대한 단회경구투여 독성실험에서 중량의 변화, 장기의 이상여부, 사망률 등에서 어떠한 이상이나 병변이 발견되지 않았다. 이상의 결과로 동물실험을 통한 혈전용해 효소의 경구투여에 의한 작용을 혈액 내에서 확인 할 수 있었으며, 본 효소의 단회 경구투여 시의 독성은 전혀 없음을 확인할 수 있었다.
Bacillus subtilis BB-1 (KFCC l1344P)으로부터 분리된 혈전용해효소 유전자 (BCF-1)를 대량발현 벡터인 pEB 벡터에 크로닝하여 순수분리 된 혈전용해효소를 rat 경구 투여하여 출혈시간, 혈액의 응고, serum의 혈전용해능 등에 대한 in vivo 실험을 실시하였으며, 혈전용해효소의 단회경구투여에 따른 독성을 검사하였다. 효소의 경구투여에 따른 rat의 출혈시간에서는 대조군에 비하여 모든 경구 투여군에서 출혈시간이 유의적으로 약 1.75배 이상 길게 나타남을 확인하였고(P<0.05), 혈액의 출혈시간 또한 활발히 진행됨을 관찰하였다. 혈액으로부터 분리된 serum의 혈전용해작용 있어서는 경구투여 후 1시간부터 채혈한 혈액 내에서 혈전용해효소의 활성이 검출되기 시작하여 3시간째까지 높은 활성을 보였으며 4시간째부터 서서히 활성이 감소하는 것을 확인하였고 혈액의 응고 역시 대조군에 비하여 경구 투여군에서 상당히 지연되는 것을 알 수 있었다. Western blot에 의한 효소 검출에서는 경구 투여군에서 30,000 Da 크기의 단일밴드를 확인하였으며, 혈전용해효소의 rat에 대한 단회경구투여 독성실험에서 중량의 변화, 장기의 이상여부, 사망률 등에서 어떠한 이상이나 병변이 발견되지 않았다. 이상의 결과로 동물실험을 통한 혈전용해 효소의 경구투여에 의한 작용을 혈액 내에서 확인 할 수 있었으며, 본 효소의 단회 경구투여 시의 독성은 전혀 없음을 확인할 수 있었다.
A fibrinolytic enzyme gene (BCF-1) was subcloned to the pEB vector which is high expression vector in the Bacillus host. The enzyme was purified by using FPLC after ammonium sulfate precipitation. The enzyme was oral-administrated to the rat and checked the bleeding time, blood clotting time and fib...
A fibrinolytic enzyme gene (BCF-1) was subcloned to the pEB vector which is high expression vector in the Bacillus host. The enzyme was purified by using FPLC after ammonium sulfate precipitation. The enzyme was oral-administrated to the rat and checked the bleeding time, blood clotting time and fibrinolytic effect of the serum. In the bleeding time retardation test, it was longer about 1.7 fold in the feeding rat than without feeding. The serum of rat feeded with the enzyme had the fibrinolytic activity from 1 hour to 3 hours after oral-administration. After 3 hours from feeding, the fibrinolytic activity was decreased gradually. Also blood clotting time after bleeding was longer than that of control rat. The enzyme could be detected at band of 30,000 Da in the blood by western blotting. The enzyme was not harmful to the all internal organs of the rats. Taken together, the enzyme originated from B. subtilis BB-1 can be a candidate to develop the drug for thrombosis, arteriosclerosis and myocardial infarction.
A fibrinolytic enzyme gene (BCF-1) was subcloned to the pEB vector which is high expression vector in the Bacillus host. The enzyme was purified by using FPLC after ammonium sulfate precipitation. The enzyme was oral-administrated to the rat and checked the bleeding time, blood clotting time and fibrinolytic effect of the serum. In the bleeding time retardation test, it was longer about 1.7 fold in the feeding rat than without feeding. The serum of rat feeded with the enzyme had the fibrinolytic activity from 1 hour to 3 hours after oral-administration. After 3 hours from feeding, the fibrinolytic activity was decreased gradually. Also blood clotting time after bleeding was longer than that of control rat. The enzyme could be detected at band of 30,000 Da in the blood by western blotting. The enzyme was not harmful to the all internal organs of the rats. Taken together, the enzyme originated from B. subtilis BB-1 can be a candidate to develop the drug for thrombosis, arteriosclerosis and myocardial infarction.
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문제 정의
우리나라에서도 일본의 natto와 마찬가지로 콩을 원료로 하여 발효시킨 전통식품인 청국장, 된장, 젓갈, 김치 등에서 혈전용해작용이 우수한 것을 보고한 바도 있으며(10, 13-16, 33), 특히 Jeong 등은 멸치액젓에서 생체 내 혈전용해작용에 대하여 보고한 바 있다(9). 이에 본 연구에서는 혈전 관련 질환예방 및 혈류개선을 목적으로 Bacillus subtilis BB-1 (KFCC 11344P)로부터 분리된 혈전용해효소 유전자 (BCF-1)를 대량발현 벡터인 pEB 벡터에 크로닝하여 순수분리된 혈전용해효소가 rat에 경구투여 시 효소가 장내로 흡수됨에 따라 혈액내의 혈전을 분해시킬 수 있는 효과를 가질 수 있는지를 동물실험을 통하여 검토하였으며, 혈전용해효소 단회경구투여에 따른 rat 의 사망률, 장기의 이상여부, 중량 등을 측정하여 효소의 1차적 안전성을 확인하였다.
제안 방법
Astrup와 Hullertz의 방법(2)을 변형하여 사용하였다. 0.
채취된 혈액은 즉시 원심분리 (13, 000 X g, 15 min, 4℃)하여 상층의 serum 부분을 회수하여 -20℃에 보관하였다. control군의 혈액과 경구투여 후 각 시간별로 채혈한 군의 혈액으로부터 분리한 serum 100 以를 fibrin plate에서 반응 시켜 분해정도를 면적으로서 측정하였으며, 각 시간별로 채취된 혈액의 응고시간을 측정하기 위하여 control과 경구 투여군의 혈액을 각각 100 /现씩 dish에 떨어뜨려 상온에서 혈액의 응고시간과 응고모습을 육안으로 관찰하였다.
암수 각 1마리씩은 control로서 효소가 함유되지 않은 saline solution 1 圳을 경구 투여하였다. 그리고 나머지 암수 4마리씩은 3일 동안 매일 효소액 1 m« (1 mg/n 粉을 경구 투여한 후 마지막 날에 각 시간별 (1, 2, 3, 4시간) 로에틸 에테르로 마취하여 심장을 통하여 혈액을 채취하였다. 채취된 혈액은 즉시 원심분리 (13, 000 X g, 15 min, 4℃)하여 상층의 serum 부분을 회수하여 -20℃에 보관하였다.
단회경구투여 독성시험실험동물인 랫드는 6주령 (체중; 수컷 160 ± 5 g, 암컷 수컷 160 ± 5 g)을 5마리씩 사용하였으며, 투여용량은 경구투여효과에서 확인된 효소 1 双 (1 mg/i戒)의 용량으로 경구투여용 카테터를 이용하여 강제경구 투여하였다. 일반증상 및 사망동물은 투여당일 투여후 1, 3그리고 6시간 간격으로, 투여 익일부터 14일까지는매일 1회 이상씩 일반증상의 변화, 독성증상 및 사망동물의 유무를 대조구와 비교 관찰하였고 중량의 변화는 2일단위로 측정하였으며, 부검은 투여 후 14일째 에테르 마취하에서 복대정맥을 통해 채혈하여 안락사 시킨 후 육안으로 모든 장기를 검사하였다.
암수 각 1마리씩은 control로서 효소가 함유되지 않은 saline solution 1 圳을 경구 투여하였다. 그리고 나머지 암수 4마리씩은 3일 동안 매일 효소액 1 m« (1 mg/n 粉을 경구 투여한 후 마지막 날에 각 시간별 (1, 2, 3, 4시간) 로에틸 에테르로 마취하여 심장을 통하여 혈액을 채취하였다.
에틸에테르로 흰쥐를 마취시킨 후 꼬리 끝부분의 3~5 mm되는 곳을 절단하고 37℃의 생리식염수 용액에 꼬리 끝부분으로부터 5 cm 되는 부분까지 침지시켜 지혈될 때까지의시간 (sec)을 stop watch로써 측정하였다.
Merck, Germany)에 녹인 후 직경 87 x 15 mm petri-dish에 10 诫 넣은 후 thrombin (1,000 unit/戒 Sigma, USA) 20 imit를 첨가하여 잘 혼합한 후 실온에서 30분간 반응하여 응고시켰다. 응고된 fibrin plate에 각 시료를 적당량 점적하여 37℃ 에서 반응시켜 생성된 혈전이 분해된 분해면적을 측정하였으며 표준 혈전분해효소로 1 unit의 plasmin (25 unit/m£. Sigma, USA)을 사용하여 비교하였다.
, USA)를 1 : 2,000 (v/v)로 희석하여 4시간 동안 상온에서 rotator-8- 이용하여 흔들면서 반응시켰다. 이를 PBS buffer로 15분간 3회 세척한 뒤 15 mg 4-chloro-l- naphtol, 45 mi Tris-Cl (pH 7.4), 90 成, 氏0로 구성된 발색용액에 10분간 반응시킨 후 증류수로서 세척하고건조하여 생성된 밴드를 육안으로 관찰하여 사진 촬영하였다.
투여하였다. 일반증상 및 사망동물은 투여당일 투여후 1, 3그리고 6시간 간격으로, 투여 익일부터 14일까지는매일 1회 이상씩 일반증상의 변화, 독성증상 및 사망동물의 유무를 대조구와 비교 관찰하였고 중량의 변화는 2일단위로 측정하였으며, 부검은 투여 후 14일째 에테르 마취하에서 복대정맥을 통해 채혈하여 안락사 시킨 후 육안으로 모든 장기를 검사하였다.
정제된 혈전용해효소 대신 saline만 투여한 contr이군의혈액과 경구투여 후 각 시간별로 채혈한 rat군의 혈액의 serum 100 以를 fibrin plate에서 반응시켜 분해정도를 측정하였다. 측정한 결과는 Fig.
혈전용해효소에 경구투여에 의한 rat의 출혈시간 측정
정제된 효소의 경구투여에 따른 출혈시간을 측정하기위하여 수컷흰쥐 4마리와 암컷흰쥐 4마리를 사용하였으며이중 각 2마리씩은 대조군으로 나머지는 실험군으로 하여정제효소 1 I戒씩을 (1 mg/mO 경구투여용 카테터를 이용하여 3일간 매일 1회씩 위까지 경구투여한 후 실험종료일에 McDonald 등의 방법(19)으로 출혈시간을 측정하였다. 에틸에테르로 흰쥐를 마취시킨 후 꼬리 끝부분의 3~5 mm되는 곳을 절단하고 37℃의 생리식염수 용액에 꼬리 끝부분으로부터 5 cm 되는 부분까지 침지시켜 지혈될 때까지의시간 (sec)을 stop watch로써 측정하였다.
혈전용해효소에 경구투여에 의한 rat의 출혈시간 측정항 혈전작용 중의 생체 내 실험의 하나인 출혈시간을 측정하기 위하여 3일간 매일 1회 정제된 혈전용해효소 1 1戒 (1 mg/ii粉을 경구투여한 후 조사된 출혈시간은 실험군 과대 조 군으로 구분 분리하여 실시하였으며, 대조군 (116.25 ± 6.88 sec)에 비하여 모든 실험군 (203.75 ± 7.46 sec)에서 출혈 시간이 유의적으로 약 1.75배 이상 길게 나타남을 확인하였고 (P<0.05), 혈액의 출혈 또한 대조군보다 활발히 진행됨을 Fig. 1과 같이 관찰하였다. 출혈시간의 측정은 혈액 응고와 관련한 항 혈전 작용의 연구에 있어서 하나의 측정변수가 되고 있으며 출혈시간이 길어진다는 것은 혈관 내의 혈액이 혈전이나 기타 불순물에 의해 흐름이 방해받지 않고 혈류를 따라 원활하게 순환된다는 의미인 동시에 혈액이 맑고 혈관 내에 불순물이 없는 깨끗함을 의미(8)하는 것을 알 수 있으며 정제된 본 혈전용해효소를 경구투여 하였을 때 혈액 중에서 항 혈전작용 및 기생성된 혈전의 분해 작용이 동시에 이루어지는 것으로 판단되었다.
대상 데이터
각 실험에 사용한 동물은 체중 160 g 내외 (생후 6주령) 의 Sprague Dawely Strain 수컷 흰쥐와 암컷 흰쥐를 대한 실험동물센터(주)에서 구입하여 사용하여 각각 대조군과 실험군으로 나누어 실험하였으며 전 실험기간 동안 온도 25 + 1℃ 및 습도 55 ± 1%로 조정된 항온항습장치 내에서 사육하였고, 물을 자유롭게 섭취할 수 있도록 하였으며, 1주일간 실험실 환경에 적응시킨 후 실험에 사용하였다.
본 연구에 사용된 혈전용해효소는 Lee 등(17)이 보고한 B. subtilis BB-1 (KFCC 11344P)에서 크로닝하여 얻어진 BCF-1 유전자에 의해 대량생산 및 정제된 혈전 용해 효소를 사용하였으며, 본 실험에서 사용된 fibrinogen, thrombin 그리고 plasmin 등의 모든 시약은 특급 또는 1급 시약을 사용하였다.
정제된 효소의 rat에 대한 경구투여효과를 측정하기 위하여 정제효소 (1 rng/m幻를 saline solution에 , 녹여 시료로 사용하였다. 암수 각 1마리씩은 control로서 효소가 함유되지 않은 saline solution 1 圳을 경구 투여하였다.
이론/모형
순수분리된 혈전용해효소를 이용하여 제조된 항체는 Lee 등(17)이 제조한 것을 사용하였으며, Western 비ote Towbin 등의 방법(32)을 이용하여 rat의 혈액에서 채취, 분리한 serum을 전기영동한 후 단백질을 nitrocellulose membrane (Millipore Co., USA)에 250 mA로 1시간 30분간 tra脈fer하였다. 그 후 이 막을 pH 7.
성능/효과
않았다. 그리고 암, 수 모두 정제효소 투여군에서 정상적인 체중증가가 관찰되었으며(Fig. 5), 시험 전 기간 동안 아무런 임상증상이 관찰되지 않았다(Table 1). 또한 부검시의 암, 수 모두 육안적 이상소견이 Fig.
따라서 본 효소는 경구투여 후 혈액으로 흡수는 확실히 섭취 후 3시간까지는 활발히 효소활성이 유지됨을 확인하였다. 그리고 혈전용해효소 경구투여에 의한 혈액의 응고를 측정한 결과 Fig. 3과 같이 1시간째에는 대조군 403.75 ± 9.43 sec와 실험군 2489.75 ± 6.89 sec, 2시간째 대조군 502.01 + 3.39 sec와 실험군 2484.5 ± 3.84 sec 그리고 3시간째에는 대조군 499.04 + 4.14 sec 와 실험군 2485.75 ± 4.13 sec 로 나타났으며 4시간째에는 대조군 499.00 ± 4.20 sec와 실험군 948.25 ± 7.45 sec로 각 시간대별로 대조군에 비하여 경구 투여군에서의 유의적으로 혈액응고시간이 상당히 지연되는 것을 나타내었다(P<0.05). 이 결과에서 볼 때 본 혈전용해효소는 혈액 내에서의 상당한항 혈전작용이 있음을 관찰할 수 있었다.
이것으로 본 연구결과를 비교해 볼때 본 효소는 1시간째부터 3시간째까지 모두 강한 활성을나타내었으며 4시간째부터 서서히 활성이 감소하는 것을 알 수 있었다. 따라서 본 효소는 경구투여 후 혈액으로 흡수는 확실히 섭취 후 3시간까지는 활발히 효소활성이 유지됨을 확인하였다. 그리고 혈전용해효소 경구투여에 의한 혈액의 응고를 측정한 결과 Fig.
05). 이 결과에서 볼 때 본 혈전용해효소는 혈액 내에서의 상당한항 혈전작용이 있음을 관찰할 수 있었다.
urokinase를 경구 투여하였을 때, 2시간에서 최고활성을 기록하여 3시간째부터활성 저 하가 나타났다고 보고하였으며 , 멸치액 젓에서 분리한 조효소액에서는 1시간부터 활성이 검출되었으나 2시간째에는 급격한 증가의 폭을 보이지 않고 3시간째 가장 높은 활성을 나타내었다. 이것으로 본 연구결과를 비교해 볼때 본 효소는 1시간째부터 3시간째까지 모두 강한 활성을나타내었으며 4시간째부터 서서히 활성이 감소하는 것을 알 수 있었다. 따라서 본 효소는 경구투여 후 혈액으로 흡수는 확실히 섭취 후 3시간까지는 활발히 효소활성이 유지됨을 확인하였다.
1과 같이 관찰하였다. 출혈시간의 측정은 혈액 응고와 관련한 항 혈전 작용의 연구에 있어서 하나의 측정변수가 되고 있으며 출혈시간이 길어진다는 것은 혈관 내의 혈액이 혈전이나 기타 불순물에 의해 흐름이 방해받지 않고 혈류를 따라 원활하게 순환된다는 의미인 동시에 혈액이 맑고 혈관 내에 불순물이 없는 깨끗함을 의미(8)하는 것을 알 수 있으며 정제된 본 혈전용해효소를 경구투여 하였을 때 혈액 중에서 항 혈전작용 및 기생성된 혈전의 분해 작용이 동시에 이루어지는 것으로 판단되었다.
측정한 결과는 Fig. 2에서 보는 바와 같이 경구투여 후 1시간째부터 채혈한 혈액 내에서 혈전용해효소의활성이 검출되기 시작하여 3시간째 채혈한 혈액까지 높은활성을 보였다. 이 결과는 Sumi 등(29)에 의해 보고된 urokinase를 이용하여 mouse에 실험한 결과와 Jeong 등(9)의멸치액젓에서 분리한 조효소액을 이용한 rat에 시험한 결과와 비교할 때 다소 차이를 보였다.
혈전용해효소 경구투여에 의한 rat의 혈액에서 혈전 용해 효소 검출 여부를 확인하기 위하여 채취, 분리된 serum 20 以를 항원으로 하고 혈전용해효소를 이용하여 토끼를 통해 제작된 항체에 의한 항원항체 반응을 분석한 결과 혈전 용해 효소를 섭취하지 않은 대조군에서는 아무런 밴드가 관찰되지 않았으며, 경구투여를 실시한 투여군에서는 육안으로확인시 30, 000 Da에서 아주 약한 밴드가 검출되었다(Fig. 4).
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