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문제 정의
- 본 연구에서는 젖소 유방염 치료용 천연항균치료제 개발을 위한 연구 일환으로 여러 생약추출물 중 항균효과가 탁월한 소목을 선발하였으며, 주요 유방염원인균에 대한 소목메탄올추출물과 소목의 주요성분인 brazilin의 최소발육억제농도를 조사하였다.
- 우리나라에서도 비유기 유방염의 치료와 건유기 유방염 예방을 위해서 매우 다양한 항생제를 사용하고 있으며 이로 인한 약제 내성문제가 심각하게 대두되고 있는실정이다(16). 따라서 이 연구에서는 항생제내성문제와 식품안정성 문제를 해결하면서 항생제를 대체할 수 있는 유방염 치료용 천연항균치료제 개발을 위한 연구 일환으로 유방염 원인균에 대한 생약 추출물의 항균력을 검사하였다.
제안 방법
- 생약재 추출은 구입한 생약재를 microfine glinder (MF 10, 1KA®, Malaysia)로 세절하여 환류냉각관이 부착된 flasH 넣고 5배의 메탄올을 첨가하여 혼합한 후 70℃ 맨틀에서 3시간 동안 3회 환류 추출하였다. 추출액은 100에서400메쉬 채 (Chung gye sang gong sa, Korea)로 일차 거른다음 여과지 (No.
- 5%) 을 얻었다. 에칠아세테이트분획(EtOAc 추출물)에서 brazilin 을 분리하기 위하여 preparatorty HPLC(Silica column 2.5 X 0.3 m; mobile phase; CH2CL2: MeOH= 10:0^ CH2CL2:MeOH= 1:9)시행하여 활성이 가장 높은 단일물질을 얻어냈다. 분리된 단일 물질은 이화여대 약대에서 제공받은 brazilin 표준품과 LC-MASS를 실시하여 추출된 단일 물질이 brazilin임을 확인하였다.
- 공시균주는 typtic soy broth(Difco, USA)에서증균하여 MacFarland 0.5 탁도로 맞준 다음 mueller-hinton agar (Difco, USA)에 골고루 도말하고 말린 후, ml당 2 mg 역가로 준비한 각각의 생약추출물 용액 20㎕ 씩을 접종한antibiotic assay disc(Whatman®, England)를 배지중앙에 올리고 24시간 배양한 후 형성된 발육억제크기를 측정하였다. 세균발육억제크기는 다음과 같이 5단계로 분류하였다.
- 세균발육억제크기는 다음과 같이 5단계로 분류하였다. 평원반의 크기를 포함하여 직경 8 mm 이하는 항균력이 없는 것 (-), 8-12 mm는 항균력이 약한 것(+), 12-16 mm는 항균력이중간인 것(++), 16-20 mm는 항균력이 강한 것(나+), 20 mm 는 이상 항균력이 매우 강한 것(++++Q 분류하였다.
- 5X leCFU/ml)로 맞춘다음 각 well에 10 ㎕1씩 접종한 후 24시간 배양하였다. 최소억제농도는 ELISA reader(Spectra-rainbow, Tecan, Australia)로 600nm에서 균 미접종구와 흡광도를 비교 측정하였다.
- 소목추출물분획에 대한 항균활성이 이(21)는 에탄올추출물에서 더 높은 활성을 보인다 하였으나 대부분의 연구자(8, 14, 19)는 MeOH추출물과 소목의 주요성분인 brazilin을 포함한 EtOAc추출물의 항균활성이 높다고 하였다. 본 연구에서는 유방염의 주요 원인균을 대상으로 소목의 주요성분이며 항균작용이 매우 높다고 알려진 brazilin(15)과 소목의 MeOH추출물의 MIC를 측정하였다. 그결과 비록 그람음성간균에 대해선 MeOH추출물과 brazilin의 MIC 농도가 비슷하였지만 그람양^ 구균 및 간균에 대한 MIC는 MeOH추출물보다 brazilin에서 낮게 나타내고 있어젖소 유방염 원인균에 대해서도 brazilin이 소목의 주요한 항균성분인 것을 확인하였다.
대상 데이터
- 생약재는 우리나라에서 보편적으로 사용되고 있고, 사람의유옹(乳癱)에 사용되었거나 또는 문헌상 항균력이 있다고 알려진 30종을 선발하여 한약재료상으로부터 구입하여 사용하였다. 생약재 추출은 구입한 생약재를 microfine glinder (MF 10, 1KA®, Malaysia)로 세절하여 환류냉각관이 부착된 flasH 넣고 5배의 메탄올을 첨가하여 혼합한 후 70℃ 맨틀에서 3시간 동안 3회 환류 추출하였다.
- Bacillus spp., Pseudomonas aeruginosc를 사용하였다. 소목 MeOH 추출물과 brazilin에 대한 최소발육억제농도 측정은 국립수의과학검 역 원으로부터 분양받은 표준균주인 Staphylococcusaureus 305, Staphylococcus epidermis ATCC 12228, Streptococcus uberis ATCC 27958, Streptococcus agalactiae ATCC 13813, Escherichia coll 055, Bacillus subtilis ATCC1024와 야외분리주를 사용하였다.
- , Pseudomonas aeruginosc를 사용하였다. 소목 MeOH 추출물과 brazilin에 대한 최소발육억제농도 측정은 국립수의과학검 역 원으로부터 분양받은 표준균주인 Staphylococcusaureus 305, Staphylococcus epidermis ATCC 12228, Streptococcus uberis ATCC 27958, Streptococcus agalactiae ATCC 13813, Escherichia coll 055, Bacillus subtilis ATCC1024와 야외분리주를 사용하였다.
- 실시하였다. 본 연구에 공시한 소목 MeOH추출물과 brazilin 1 g을 증류수와 DMSO 로 녹여 0.211m 필터 (Millipore, USA)로 제균한 다음 최종농도가 1 mg/ml이 되도록 준비하였다. Mueller-hinton broth 를 96 well plate (Coming, USA)에 100 ㎕ 1 씩 분주한 후준비한 MeOH추출물과 brazilin을 농도별로 다단계 희석하였다.
이론/모형
- 소목(Caesalpinia sappan, China)에서 brazilin의 추출은 Kim 등(9)의 방법에 준하여 다음과 같이 추출하였다. 세절한소목 500kg에 10배의 MeOH을 첨가하여 상온에서 각 3일간 4회 추출하여 MeOH추출물 64 kg (12.
- 유방염원인균에 대한 생약추출물의 항균력검사는 김 등(17) 의 방법에 따라 한천배지확산법 (agar diffusion method)으로실시하였다. 공시균주는 typtic soy broth(Difco, USA)에서증균하여 MacFarland 0.
- 젖소 유방염 원인균에 대한 최소발육억제농도(minimum inhibitory concentration; MIC)는 Xu와 Lee(15)의 방법에준하여 broth dilution methods. 실시하였다.
성능/효과
- 3 m; mobile phase; CH2CL2: MeOH= 10:0^ CH2CL2:MeOH= 1:9)시행하여 활성이 가장 높은 단일물질을 얻어냈다. 분리된 단일 물질은 이화여대 약대에서 제공받은 brazilin 표준품과 LC-MASS를 실시하여 추출된 단일 물질이 brazilin임을 확인하였다.
- 유방염에 이환된 분방으로부터 분리된 그람양성균, 그람음성균과 Bacillus spp. 등 7종에 대하여모두 항균효과를 가진 것은 소목, 가자와 황련추출물이었으며 그 중 소목추출물의 항균효과가 가장 강하게 나타났다. 그외 유근피와 연교 등이 비교적 항균효과가 우수하였다.
- 그외 유근피와 연교 등이 비교적 항균효과가 우수하였다. 균별항균효과를 보면 Staphylococcus aweus에는 가자, 소목, 황련등의 추출물이, Streptococcus uberis에는 소목과 황련 주줄물이, E. 에는 소목추출물이, Bacillus spp에는 가자, 소목, 연교, 천화분, 황련 추출물이, Pseudomonas aeruginosdee가자, 금앵자, 백작약, 금은화, 소목, 호장근 추출물이, Staphylococcus epidermidis 에는 선복화, 소목, 호장근, 황련 주줄물이 그리고 Klebsiella pneumoniae 소목추출물이 항균력이 강한 것이 나타났다. 그러나 공시한 생약추출물중골담초, 우방자, 우슬 및 천화분추출물은 유방염원인균에 대해 항균효과를 전혀 나타내지 못했다.
- Table 2에 나타내었다. 소목추출물의 최소발육억제농도는 표준균주 및 야외균주에서 비슷한 경향을나타내었으며, 그람양성균에 대한 MeOH추출물과 brazilin의최소발육억제농도는 각각 4-125 Rg/ml와 4-63 ㎍/ml 이었고그람음성균은 1,000 ㎕/ml 또는 그 이상에서 최소발육억제농도를 나타내었다.
- coli 대해 높은 항균성을 보인다고 하였다. 본 결과에서도 30종의 생약추출물중 소목이 유방염에 이환된 젖소에서 유래된 그람양성 및 그람음성의 유방염 원인균에 대하여 항균효과가 가장 우수한 것으로 나타나 동물유래 병원균에 대한 항균력 역시 높을 것으로 사료된다. 한편 강 등(16)은 여러가지 생약추출물중 젖소 유방염균과사람 및 젖소 유래 메치실린내성 황색포도상구균 (MRSA)에대해 가자추출물이 높은 항균효과를 보인다고 했다.
- 한편 강 등(16)은 여러가지 생약추출물중 젖소 유방염균과사람 및 젖소 유래 메치실린내성 황색포도상구균 (MRSA)에대해 가자추출물이 높은 항균효과를 보인다고 했다. 본 연구에서도 가자추출물의 항균력이 그람 양성균 및 음성균에서 높게 나타났으며, 그 외 황련추출물도 강한 항균력을 나타내었다.
- 본 연구에서는 유방염의 주요 원인균을 대상으로 소목의 주요성분이며 항균작용이 매우 높다고 알려진 brazilin(15)과 소목의 MeOH추출물의 MIC를 측정하였다. 그결과 비록 그람음성간균에 대해선 MeOH추출물과 brazilin의 MIC 농도가 비슷하였지만 그람양^ 구균 및 간균에 대한 MIC는 MeOH추출물보다 brazilin에서 낮게 나타내고 있어젖소 유방염 원인균에 대해서도 brazilin이 소목의 주요한 항균성분인 것을 확인하였다. 또한 유방염 원인균주 즉, 표준균주 및 야외분리균주에 대한 brazilin의 MIC 농도에서도 비슷한 결과를 나타내고 있어 야외분리균주에서도 탁월한 항균효과가 있는 것으로 사료된다.
- 그결과 비록 그람음성간균에 대해선 MeOH추출물과 brazilin의 MIC 농도가 비슷하였지만 그람양^ 구균 및 간균에 대한 MIC는 MeOH추출물보다 brazilin에서 낮게 나타내고 있어젖소 유방염 원인균에 대해서도 brazilin이 소목의 주요한 항균성분인 것을 확인하였다. 또한 유방염 원인균주 즉, 표준균주 및 야외분리균주에 대한 brazilin의 MIC 농도에서도 비슷한 결과를 나타내고 있어 야외분리균주에서도 탁월한 항균효과가 있는 것으로 사료된다. 따라서 본 연구결과와 brazilin의 면역조절효능(2) 그리고 소목추출물을 항생제에 추가하였을 경우 병 원균의 최 소발육억 제 농도를 감소시 키 고 MRSA균이 점막세포 침입을 방지하는 효과(9)가 있음을 감안할 때 젖소 유방염 치료용 항생제 대체물질로 소목의 주성분인 brazilin을 이용한 치료제 개발이 가능 할 것으로 사료된다.
- 젖소 유방염 치료용 항생제를 대체할 수 있는 천연항균치료제 개발을 위하여 7종의 유방염원인균에 대하여 30종의 생약 MeOH추출물의 항균력을 조사한 결과 그 중 소목추출물의 항균효과가 가장 강하였으며, 가자와 황련 추출물에서도 높은 항균력을 나타내었다. 또한 소목의 MeOH추출물과 EtOAc추출물분획으로 부터 추출한 brazilin에 대하여 주요 유방염 원인균 8종에 대하여 MIC를 측정한 바 MeOH추출물보다 brazilin에서 낮게 나타나 소목의 주 성분인 brazilin을 세균성 유방염의 생약치료제로 사용이 가능할 것으로 사료된다.
후속연구
- 또한 유방염 원인균주 즉, 표준균주 및 야외분리균주에 대한 brazilin의 MIC 농도에서도 비슷한 결과를 나타내고 있어 야외분리균주에서도 탁월한 항균효과가 있는 것으로 사료된다. 따라서 본 연구결과와 brazilin의 면역조절효능(2) 그리고 소목추출물을 항생제에 추가하였을 경우 병 원균의 최 소발육억 제 농도를 감소시 키 고 MRSA균이 점막세포 침입을 방지하는 효과(9)가 있음을 감안할 때 젖소 유방염 치료용 항생제 대체물질로 소목의 주성분인 brazilin을 이용한 치료제 개발이 가능 할 것으로 사료된다.
- 항균력을 나타내었다. 또한 소목의 MeOH추출물과 EtOAc추출물분획으로 부터 추출한 brazilin에 대하여 주요 유방염 원인균 8종에 대하여 MIC를 측정한 바 MeOH추출물보다 brazilin에서 낮게 나타나 소목의 주 성분인 brazilin을 세균성 유방염의 생약치료제로 사용이 가능할 것으로 사료된다.
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