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문제 정의
- 솔잎착즙액 (PNE)은 엽록소 함유량(40.8 mg/100 g)이 높 고 비타민 C도 다량함유 (149 mg/100 g)하고 있어 기능성 식품으로 개발가능성이 높으며, 솔잎 발효액은 향미가 좋 아지고 기능성이 높아져서 고부가가치가 크므로 발효의 조건과 활성도를 조사 분석하여 고기능성 솔잎발효액 (SFPE)을 개발하고자 하였다. 솔잎자체발효 (SFPE)에 관여 하는 균을 발효단계에 따라 분리, 선발하고 동정하였다.
- 또한 항균, 항암 및 항산화 효 능을 측정하였으며 전기 생리학적 실험을 통하여 솔잎발효 액이 쥐의 혈관수축 이완에 미치는 효과를 분석하여 기능 성 식품으로 개발할 수 있는 가능성을 타진하였다. 솔잎 착 즙액의 자체발효에 우세한 이들 미생물을 이용하여 차후에 발효기간을 단축시키고 효능을 증대할 수 있는 가능성을 찾고자 한다. 또한 혈관이완 활성을 살펴봄으로써, 심근경 색이나 뇌경색과 같은 혈관 수축으로 발생된 질환 및 고혈 압치료 등에 활용될 가능성을 살펴보고자 하였으며, 천연 기능성 식품으로서의 응용가능성을 타진하고자 한다.
- 솔잎 착 즙액의 자체발효에 우세한 이들 미생물을 이용하여 차후에 발효기간을 단축시키고 효능을 증대할 수 있는 가능성을 찾고자 한다. 또한 혈관이완 활성을 살펴봄으로써, 심근경 색이나 뇌경색과 같은 혈관 수축으로 발생된 질환 및 고혈 압치료 등에 활용될 가능성을 살펴보고자 하였으며, 천연 기능성 식품으로서의 응용가능성을 타진하고자 한다.
- 1), 앞으로 발효균과 기존의 미생물과 의 생리 . 생화학적인 작용과 효율을 비교하고자 한다. PNE에 솔잎 발효 균주를 첨가함으로써, 앞선 실험에 의해 여러 효능이 입증된 좋은 SFPE로 단기간에 만들 수 있다는 가능성은 한국의 전통발효식품에서 그 예를 찾아볼 수 있다.
가설 설정
- The antibacterial activity of self fermented pine needle extract (SFPE) tested on paper disc. A. Effect of SFPE on E. coli was increased with increase in self-fermentation period and dose. Treatment (40 ㎕ white bar and 80 ㎕ black bar) B.
제안 방법
- 8 mg/100 g)이 높 고 비타민 C도 다량함유 (149 mg/100 g)하고 있어 기능성 식품으로 개발가능성이 높으며, 솔잎 발효액은 향미가 좋 아지고 기능성이 높아져서 고부가가치가 크므로 발효의 조건과 활성도를 조사 분석하여 고기능성 솔잎발효액 (SFPE)을 개발하고자 하였다. 솔잎자체발효 (SFPE)에 관여 하는 균을 발효단계에 따라 분리, 선발하고 동정하였다. GPYA배지에서 발효균을 스크린하여 Pichia galeiformis, Candida boidinii, Pichia species, Candida species 1, Candida species2, Candida ooidensis, Saccharomyces cerevisiae, Candida fazrawaiewii를 선발하였으며, 발효가 진행됨에 따라 2년차에는 Candida boidinii, Candida species2, Candida ooidensis, Saccharomyces cerevisiae7\ 선발되었고, 3년차에 는 Candida speciesl&2가 선발되어 Candida species2가 우점 종으로 나타났다.
- 본 연구에서는 솔잎 착즙액의 유효성분을 분석하고 저온 분리한 상징액으로 자체발효를 유도하였으며, 자체발효 중에 나타나는 미생물을 분리 동정하여 발효액의 생리적 및 약리적 변화를 비교하였다. 또한 항균, 항암 및 항산화 효 능을 측정하였으며 전기 생리학적 실험을 통하여 솔잎발효 액이 쥐의 혈관수축 이완에 미치는 효과를 분석하여 기능 성 식품으로 개발할 수 있는 가능성을 타진하였다.
- 일반성분 분석은 AOAC 방법에 준하여 실시하였다. 수 분은 적외선 수분측정장치를 이용하여, K)5℃에서 가열 건 조하여 무게 변화가 없는 상태를 수분 함량으로 결정하였으며, 조회분은 회화로에서 55O℃에서 회화하여 무게 변화가 없는 상태를 회분 함량으로 결정하였다. 조지방은 지방 추출 장치를 (Soxhlet 원리; Petroleum ether로 추출) 이용하여 지방 추출 후, 칭량하여 그 무게를 조지방 함량으로 결 정하였고, 조단백질은 시료를 황산, 분해 촉진제 등과 함께 가열하여 완전 분해 후, 증류장치를 이용해 질소량을 측정하고, 측정된 질소 함량은 단백 계수를 적용하여 단백 질로 환산하여 단백질 함량을 정하였다.
- 수 분은 적외선 수분측정장치를 이용하여, K)5℃에서 가열 건 조하여 무게 변화가 없는 상태를 수분 함량으로 결정하였으며, 조회분은 회화로에서 55O℃에서 회화하여 무게 변화가 없는 상태를 회분 함량으로 결정하였다. 조지방은 지방 추출 장치를 (Soxhlet 원리; Petroleum ether로 추출) 이용하여 지방 추출 후, 칭량하여 그 무게를 조지방 함량으로 결 정하였고, 조단백질은 시료를 황산, 분해 촉진제 등과 함께 가열하여 완전 분해 후, 증류장치를 이용해 질소량을 측정하고, 측정된 질소 함량은 단백 계수를 적용하여 단백 질로 환산하여 단백질 함량을 정하였다. 엽록소분석을 위해 엽록소의 추출은 85% 아세톤으로 녹색이 없어질 때까 지 추출하여 일정량으로 정용하고 이 중 일부를 분획여두 (separating funnel)에서 에테르로 지용성 성분을 분획하여 에테르층은 물층을 통과시켜 아세톤을 제거하였다.
- 조지방은 지방 추출 장치를 (Soxhlet 원리; Petroleum ether로 추출) 이용하여 지방 추출 후, 칭량하여 그 무게를 조지방 함량으로 결 정하였고, 조단백질은 시료를 황산, 분해 촉진제 등과 함께 가열하여 완전 분해 후, 증류장치를 이용해 질소량을 측정하고, 측정된 질소 함량은 단백 계수를 적용하여 단백 질로 환산하여 단백질 함량을 정하였다. 엽록소분석을 위해 엽록소의 추출은 85% 아세톤으로 녹색이 없어질 때까 지 추출하여 일정량으로 정용하고 이 중 일부를 분획여두 (separating funnel)에서 에테르로 지용성 성분을 분획하여 에테르층은 물층을 통과시켜 아세톤을 제거하였다. 이 과정을 5-10회 반복하여 완전히 아세톤을 제거한 에테르층만 을 모아 무수 아황산 나트륨으로 탈수시키고, 흡광 광도계 로 엽록소의 양을 측정 하였으며, 이때 파장은 660 및 642.
- 엽록소분석을 위해 엽록소의 추출은 85% 아세톤으로 녹색이 없어질 때까 지 추출하여 일정량으로 정용하고 이 중 일부를 분획여두 (separating funnel)에서 에테르로 지용성 성분을 분획하여 에테르층은 물층을 통과시켜 아세톤을 제거하였다. 이 과정을 5-10회 반복하여 완전히 아세톤을 제거한 에테르층만 을 모아 무수 아황산 나트륨으로 탈수시키고, 흡광 광도계 로 엽록소의 양을 측정 하였으며, 이때 파장은 660 및 642.5 nm에서 측정하여 총 엽록소, 엽록소 a, 엽록소 b 함 량을 산출하였다. 특수성분 및 미량성분분석으로 비타민 C는 2, 4-dinitrophenyl hydrazine (DNP) 비색법은 5% 메타인산 으로 추출하여, water bath에서 비색 반응 후, 520 nm에서 흡광도를 측정하여 정량하였으며 HPLC 측정은, 5% 메타 인산으로 추출한 후, 헥산으로 비극성 성분을 제거한 후 분석하였다.
- 5 nm에서 측정하여 총 엽록소, 엽록소 a, 엽록소 b 함 량을 산출하였다. 특수성분 및 미량성분분석으로 비타민 C는 2, 4-dinitrophenyl hydrazine (DNP) 비색법은 5% 메타인산 으로 추출하여, water bath에서 비색 반응 후, 520 nm에서 흡광도를 측정하여 정량하였으며 HPLC 측정은, 5% 메타 인산으로 추출한 후, 헥산으로 비극성 성분을 제거한 후 분석하였다. 이동상은 acetonitrile 30%, 0.
- SFPE의 발효가 진행됨으로써 변화하는 균의 양상을 확 인하기 위하여 각 발효액을 500배 희석하여 GPYA배지에 도말하고 28℃에서 3일 경과 후, 콜로니의 모양을 형태학 적으로 확인하였다. 이때 최종적으로 확인된 솔잎 발효균 을 여러 배지 (GPYA, Yeast malt broth, Bennett's broth, Nutrient agar, Nutrient agar + SFPE 25%)에 분주하여 28℃ 에서 배양함으로써 솔잎 발효균이 잘 자라는 배지를 선택 하였고, SFPE를 25% 첨가한 Nutrient agar에 PNE와 SFPE 를 도말하여 37℃와 28℃에서 성장하는 정도를 비교하였다.
- SFPE의 발효가 진행됨으로써 변화하는 균의 양상을 확 인하기 위하여 각 발효액을 500배 희석하여 GPYA배지에 도말하고 28℃에서 3일 경과 후, 콜로니의 모양을 형태학 적으로 확인하였다. 이때 최종적으로 확인된 솔잎 발효균 을 여러 배지 (GPYA, Yeast malt broth, Bennett's broth, Nutrient agar, Nutrient agar + SFPE 25%)에 분주하여 28℃ 에서 배양함으로써 솔잎 발효균이 잘 자라는 배지를 선택 하였고, SFPE를 25% 첨가한 Nutrient agar에 PNE와 SFPE 를 도말하여 37℃와 28℃에서 성장하는 정도를 비교하였다. SFPE에 존재하는 솔잎 발효균을 동정하기 위하여 멸 균한 SFPE를 25% 첨가 (5000 rpm에서 30분 동안 원심 분 리하여 상징액 만을 분리)한 Nutrient agar (peptone 5 g/L, beef extract 3 g/L) 배지에 SFPE를 도말한 후 배양하였다.
- 이때 최종적으로 확인된 솔잎 발효균 을 여러 배지 (GPYA, Yeast malt broth, Bennett's broth, Nutrient agar, Nutrient agar + SFPE 25%)에 분주하여 28℃ 에서 배양함으로써 솔잎 발효균이 잘 자라는 배지를 선택 하였고, SFPE를 25% 첨가한 Nutrient agar에 PNE와 SFPE 를 도말하여 37℃와 28℃에서 성장하는 정도를 비교하였다. SFPE에 존재하는 솔잎 발효균을 동정하기 위하여 멸 균한 SFPE를 25% 첨가 (5000 rpm에서 30분 동안 원심 분 리하여 상징액 만을 분리)한 Nutrient agar (peptone 5 g/L, beef extract 3 g/L) 배지에 SFPE를 도말한 후 배양하였다. 생성된 솔잎 균주의 단일 콜로니를 선택하여 액체배지에 계대배양 하고, genomic DNA를 분리한 후, 26S rDNA D1/D2 region을 증폭하여 확인하였다.
- SFPE에 존재하는 솔잎 발효균을 동정하기 위하여 멸 균한 SFPE를 25% 첨가 (5000 rpm에서 30분 동안 원심 분 리하여 상징액 만을 분리)한 Nutrient agar (peptone 5 g/L, beef extract 3 g/L) 배지에 SFPE를 도말한 후 배양하였다. 생성된 솔잎 균주의 단일 콜로니를 선택하여 액체배지에 계대배양 하고, genomic DNA를 분리한 후, 26S rDNA D1/D2 region을 증폭하여 확인하였다. genomic DNA와 universal primer (5'-GCATATCAATAAGCGGAGGAAAAG-3‘, 5'-GGTCCGTGTITCAAGACGG-3')를 사용하여 이전에 알려진 조건(24)에 따라 PCR을 수행하여 5七partial 26S rRNA (rRNA coding gene)를 증폭하였다.
- 생성된 솔잎 균주의 단일 콜로니를 선택하여 액체배지에 계대배양 하고, genomic DNA를 분리한 후, 26S rDNA D1/D2 region을 증폭하여 확인하였다. genomic DNA와 universal primer (5'-GCATATCAATAAGCGGAGGAAAAG-3‘, 5'-GGTCCGTGTITCAAGACGG-3')를 사용하여 이전에 알려진 조건(24)에 따라 PCR을 수행하여 5七partial 26S rRNA (rRNA coding gene)를 증폭하였다. 증폭된 partial 26S rRNA 는 PCR product purification kit (Qiagen 사)를 사용하여 정 제한 후 sequencing 반응에 이용하였다, 염기서열 결정은 Genetic analyzer 310 (Perkin-Elmer 사)을 이용하였으며 염 기서열의 분석은 주로 CLUSTALW 프로그램, PHYLIP 프로그램 및 자체 개발한 프로그램을 사용하였다.
- genomic DNA와 universal primer (5'-GCATATCAATAAGCGGAGGAAAAG-3‘, 5'-GGTCCGTGTITCAAGACGG-3')를 사용하여 이전에 알려진 조건(24)에 따라 PCR을 수행하여 5七partial 26S rRNA (rRNA coding gene)를 증폭하였다. 증폭된 partial 26S rRNA 는 PCR product purification kit (Qiagen 사)를 사용하여 정 제한 후 sequencing 반응에 이용하였다, 염기서열 결정은 Genetic analyzer 310 (Perkin-Elmer 사)을 이용하였으며 염 기서열의 분석은 주로 CLUSTALW 프로그램, PHYLIP 프로그램 및 자체 개발한 프로그램을 사용하였다.
- SFPE의 항균력은 디스크 확산법(25)에 의해 측정하였다. SFPE 1 (Self-fermented pine needle extract 1 year old), SFPE 4 (Self-fermented pine needle extract 4 years old), SFPE 7 (Self-fermented pine needle extract 7 years old)년의 시료를 5,000 rpm에서 30분간 원심분리 하여 상징액을 사용하였다. 각 시료를 paper disk에 40 就, 80 就를 적신 후 E.
- SFPE 1 (Self-fermented pine needle extract 1 year old), SFPE 4 (Self-fermented pine needle extract 4 years old), SFPE 7 (Self-fermented pine needle extract 7 years old)년의 시료를 5,000 rpm에서 30분간 원심분리 하여 상징액을 사용하였다. 각 시료를 paper disk에 40 就, 80 就를 적신 후 E. coll (KTCC1932), Bacillus subtilis (ATCC6633)를 도말한 Nutrient agar (beef extract 3 g, peptone 5 g, bacto agar 15 g/1 L)위에 올려놓고 37℃ 에서 배양하면서 발육저지환의 크기를 즉정하였으며, Staphylococcus aureus (ATCC6538P)는 SFPE1과 SFPE 7년의 시료를 각각 40 迎와 120 成를 paper disk 에 분주하여 37℃ 에서 배양하면서 발육저지환의 크기를 측정하였다.
- 항산화 활성은 NBT법에 의하여 시료의 Superoxide anion radical 소거능력을 측정하였다. 이 분석법은 Xanthine/ xanthine oxidase system 에 의해 발생하는 superoxide anion radical을 항산화제가 제거시키는 정도를 확인하는 실험으 로써 Nitro Blue Tetrazolium (NBT)의 감소 정도를 통하여 항산화능력을 측정한다. 50 mM KH2PO4와 50 mM KOH를 동량 섞어 만든 시약에 15 mM NazEDTA를 넣어 완충액을 만든다.
- 15 mM NazEDTA가 포함된 완충액을 96-웰 플레이 트에 20 以를 넣는다. 각 웰에 0.6 mM NBT 50 成를 첨가 하고, 3 mM Hypoxanthine 30 成를 첨가한 후, SFPE 1 , SFPE 4, SFPE 7를 각 농도별로 증류수에 희석한 시료를 50 jil 첨가하고, 1 unit의 Xanthine oxidase 50 成를 첨가하여 반응시켰다. Spectrophotometer를 이용하여 570 nm에서 흡광도를 5분 단위로 측정하였다.
- SFPE의 혈관이완반응을 확인하기 위해 체중 150-200 g 의 흰쥐를 pentobarbital-Na (40 ㎎/㎏, i.p.)로 마취한 후 개 복하여 흉부대동맥을 적출하였다. 적출한 혈관은 실온에서 95% 6와 5% C6로 포화된 Krebs-Ringer 용액 (NaCl 112 mM, KC1 5 mM, NaHCO3 25 mM, KH2PO4 1.
- )로 마취한 후 개 복하여 흉부대동맥을 적출하였다. 적출한 혈관은 실온에서 95% 6와 5% C6로 포화된 Krebs-Ringer 용액 (NaCl 112 mM, KC1 5 mM, NaHCO3 25 mM, KH2PO4 1.2 mM, MgSQi 1.2 mM, calcium disodium ethylenediamine-tetra acetic acid (EDTA) 0.026 mM, CaCh 2.5 mM, glucose 11.5 mM, pH 7.4)이 든 준비용기 속에서 혈관 내 혈액을 제거 하고 미세가위를 이용하여 주위조직을 깨끗이 박리한 후 5 mm 길이의 ring 형태의 혈관절편들을 만들었다. 이 절편 들을 37℃ 에서 95% 6와 5% C6로 포화된 Krebs-Ringer 용액이 들어있는 15 ml 용량의 수직형 실험 용기에 옮겨 한쪽 단은 근육 고정기에 반대 단은 근수축 변환기 (force transducer, Grass FT03)에 연결하여 생리적 기록기에서 등 장성 수축을 기록하였다.
- 4)이 든 준비용기 속에서 혈관 내 혈액을 제거 하고 미세가위를 이용하여 주위조직을 깨끗이 박리한 후 5 mm 길이의 ring 형태의 혈관절편들을 만들었다. 이 절편 들을 37℃ 에서 95% 6와 5% C6로 포화된 Krebs-Ringer 용액이 들어있는 15 ml 용량의 수직형 실험 용기에 옮겨 한쪽 단은 근육 고정기에 반대 단은 근수축 변환기 (force transducer, Grass FT03)에 연결하여 생리적 기록기에서 등 장성 수축을 기록하였다. Bath액은 20분 간격으로 새로운 영양액으로 갈아주었으며 피동장력 (passive tension)이 3 g 이 되게 절편의 길이를 늘여 주었다.
- 이후 1시간 정도 회 복시킨 후 실험을 시행하였다(26). 수축을 유도한 뒤 SFPE 를 첨가하여 등장성 수축을 기록해 혈관 이완 정도를 측정하였다.
대상 데이터
- 솔잎은 아황산가스의 오염을 최소화하기 위해 해발 350 m 이상에서 자란 청정지역의 건강한 소나무를 선택하여 영양상태가 좋은 가지부분을 채취한 후 싱싱하고 푸른 잎 만을 선별하였다. 솔잎의 불순물이 녹아 나오도록 흐르는 물에 담근 후, 맑은 물이 나올 때까지 3-4회 세척하고 다시 숯을 우려낸 물로 1회 세척한다.
- Effect of SFPE on Staphylococcus aureus was increased with increase in self-fermentation period and dose. Treatment (40 ㎕ white bar and 120 ㎕ black bar). SFPE 1: Self-fermented pine extract 1 year old; SFPE 4: Self-fermented pine needle extract 4 years old; SFPE 7: Self-fermented pine needle extract 7 years old.
- Effect of SFPE on Staphylococcus aureus was increased with increase in self-fermentation period and dose. Treatment (40 ㎕ white bar and 120 ㎕ black bar). SFPE 1: Self-fermented pine extract 1 year old; SFPE 4: Self-fermented pine needle extract 4 years old; SFPE 7: Self-fermented pine needle extract 7 years old.
- SFPE의 혈관이완활성을 확인하기 위해 흰쥐의 흉부대동 맥 혈관절편을 이용하였다. 수축성 물질인 Phenylephrine (PE) (106 M)으로 유발된 수축반응에 대해 SFPE를 0.
이론/모형
- 일반성분 분석은 AOAC 방법에 준하여 실시하였다. 수 분은 적외선 수분측정장치를 이용하여, K)5℃에서 가열 건 조하여 무게 변화가 없는 상태를 수분 함량으로 결정하였으며, 조회분은 회화로에서 55O℃에서 회화하여 무게 변화가 없는 상태를 회분 함량으로 결정하였다.
- SFPE의 항균력은 디스크 확산법(25)에 의해 측정하였다. SFPE 1 (Self-fermented pine needle extract 1 year old), SFPE 4 (Self-fermented pine needle extract 4 years old), SFPE 7 (Self-fermented pine needle extract 7 years old)년의 시료를 5,000 rpm에서 30분간 원심분리 하여 상징액을 사용하였다.
- 항산화 활성은 NBT법에 의하여 시료의 Superoxide anion radical 소거능력을 측정하였다. 이 분석법은 Xanthine/ xanthine oxidase system 에 의해 발생하는 superoxide anion radical을 항산화제가 제거시키는 정도를 확인하는 실험으 로써 Nitro Blue Tetrazolium (NBT)의 감소 정도를 통하여 항산화능력을 측정한다.
성능/효과
- 솔잎 착즙액은 엽록소 a와 b를 100 g당 40.8 mg을 함유 하였고, 동결건조를 했을 경우에는 178.5 mg의 높은 비율 로 함유하고 있으며, 착즙액의 비타민 C 함량은 100 g당 349.0 mg이고, 동결건조를 하였을 경우 569.8 mg를 함유하고 있어서(Table 1A), 고기능성 식품으로 개발가능성을 모 색할 수 있었다. 동결건조한 솔잎착즙액의 엽록소를 시금 치와 비교해보았을 경우, 시금치의 엽록소 a 는 82.
- 7 배 높은 함량을 나타내었다(27). 또한 솔잎 착즙액이 함유 하고 있는 비타민 C의 함량을 산지별로 시판중인 녹차와 비교해 본 결과, 솔잎 착즙액은 녹차 산지 중에서 가장 높은 비타민 C 함량을 보였던 보성의 257 mg/100g보다 약 1.4배 높은 함량이었고, 동결건조를 한 솔잎 착즙액의 경우 약 2.2배 높은 비율로 비타민 C를 함유하고 있었다(28). 더불어 솔잎의 유효성분 중 비타민C는 a-tocopherol의 지질 과산화 억제 작용을 돕는 water-soluble peroxidation chainbreaking mtioxidant로써 작용하며 이것은 구리 이온과 결합 하여 효소 불활성화를 일으켜 ROS (relative oxygen species) 의 활성을 억제하는 역할을 하므로(29) 솔잎은 혈액정화 및 항괴혈병성, 스트레스에 대한 저항력에 대한 효과가 있을 것으로 여겨지며 특히 엽록소 또한 그 함유량이 높아 콜레스테롤 감소, 당뇨 등에 효과적일 것이라 생각된다.
- 더불어 솔잎의 유효성분 중 비타민C는 a-tocopherol의 지질 과산화 억제 작용을 돕는 water-soluble peroxidation chainbreaking mtioxidant로써 작용하며 이것은 구리 이온과 결합 하여 효소 불활성화를 일으켜 ROS (relative oxygen species) 의 활성을 억제하는 역할을 하므로(29) 솔잎은 혈액정화 및 항괴혈병성, 스트레스에 대한 저항력에 대한 효과가 있을 것으로 여겨지며 특히 엽록소 또한 그 함유량이 높아 콜레스테롤 감소, 당뇨 등에 효과적일 것이라 생각된다. 솔잎 착즙액과 솔잎 착즙액을 동결 건조하여 필수아미노 산을 포함한 기타 구성아미노산의 함량을 분석한 결과, Cysteine 100 g당 1.36 g, Lysinee 0.84 g, Prolinee 0.83 g, Aspartic acid는 0.82 g(Table IB) 등 우리 몸의 구성성분 이 되는 필수아미노산을 풍부하게 함유하고 있으므로 항 상성유지에도 큰 도움이 될 것으로 사료된다.
- 솔잎 자체 발효에 관여하는 솔잎 발효균을 분리 및 동 정하기 위하여 SFPE를 발효시키기 시작한 연도 별로 분리 하여 존재하는 균주를 확인한 결과 Pichia galeiformis, Candida boidinii, Pichia species, Candida species' Candida species2, Candida ooidensis, Saccharomyces cerevisiae, Candida karawaiewiiSt}- 같은 8종의 균주를 확인할 수 있었다. 또한, SFPE의 발효가 진행됨으로써 달라지는 8종의 균 의 양상을 확인해 보자면, 최근 2005년도에 발효시킨 SFPE 1 에서는 Pichia galeiformis, Candida boidinii, Pichia species, Candida species 1, Candida species2, Candida ooidensis, Saccharomyces cerevisiae, Candida karawaiewiie 8 종의 균이 모두 발견되었지만, 2004년에 발효를 시작한 SFPE 2, 2003년에 발효를 시작한 SFPE 3, 2002년에 발효 를 시작한 SFPE 4에서는 균의 종류에 따라 발효액의 환경 이 변화함에 따라 달라지는 양상을 확인할 수 있었다.
- 솔잎 자체 발효에 관여하는 솔잎 발효균을 분리 및 동 정하기 위하여 SFPE를 발효시키기 시작한 연도 별로 분리 하여 존재하는 균주를 확인한 결과 Pichia galeiformis, Candida boidinii, Pichia species, Candida species' Candida species2, Candida ooidensis, Saccharomyces cerevisiae, Candida karawaiewiiSt}- 같은 8종의 균주를 확인할 수 있었다. 또한, SFPE의 발효가 진행됨으로써 달라지는 8종의 균 의 양상을 확인해 보자면, 최근 2005년도에 발효시킨 SFPE 1 에서는 Pichia galeiformis, Candida boidinii, Pichia species, Candida species 1, Candida species2, Candida ooidensis, Saccharomyces cerevisiae, Candida karawaiewiie 8 종의 균이 모두 발견되었지만, 2004년에 발효를 시작한 SFPE 2, 2003년에 발효를 시작한 SFPE 3, 2002년에 발효 를 시작한 SFPE 4에서는 균의 종류에 따라 발효액의 환경 이 변화함에 따라 달라지는 양상을 확인할 수 있었다. 하 지만, Candida species2를 다른 7종의 Pichia galeiformis, Candida boidinii, Pichia species, Candida species 1, Candida ooidensis, Saccharomyces cerevisiae, Candida karawaiewiie:^}- 비교하였을 때, 우위적으로 콜로니가 많았을 뿐만 아니라, 2003년의 SFPE 3에서까지 균의 존재를 확인할 수 있었다 (Table 2A).
- 또한, SFPE의 발효가 진행됨으로써 달라지는 8종의 균 의 양상을 확인해 보자면, 최근 2005년도에 발효시킨 SFPE 1 에서는 Pichia galeiformis, Candida boidinii, Pichia species, Candida species 1, Candida species2, Candida ooidensis, Saccharomyces cerevisiae, Candida karawaiewiie 8 종의 균이 모두 발견되었지만, 2004년에 발효를 시작한 SFPE 2, 2003년에 발효를 시작한 SFPE 3, 2002년에 발효 를 시작한 SFPE 4에서는 균의 종류에 따라 발효액의 환경 이 변화함에 따라 달라지는 양상을 확인할 수 있었다. 하 지만, Candida species2를 다른 7종의 Pichia galeiformis, Candida boidinii, Pichia species, Candida species 1, Candida ooidensis, Saccharomyces cerevisiae, Candida karawaiewiie:^}- 비교하였을 때, 우위적으로 콜로니가 많았을 뿐만 아니라, 2003년의 SFPE 3에서까지 균의 존재를 확인할 수 있었다 (Table 2A). 발효의 최종단계에서 스크린한 Candida species'?를 GPYA, Yeast malt broth, Bennett's broth, Nutrient agar + SFPE 25% 배지에서 배양 시켜 관찰 한 결과 전반적으로 GPYA 배지에서 균주들이 잘 자랐으 며 Nutrient 배지에서는 잘 자라지 않았다.
- 하 지만, Candida species2를 다른 7종의 Pichia galeiformis, Candida boidinii, Pichia species, Candida species 1, Candida ooidensis, Saccharomyces cerevisiae, Candida karawaiewiie:^}- 비교하였을 때, 우위적으로 콜로니가 많았을 뿐만 아니라, 2003년의 SFPE 3에서까지 균의 존재를 확인할 수 있었다 (Table 2A). 발효의 최종단계에서 스크린한 Candida species'?를 GPYA, Yeast malt broth, Bennett's broth, Nutrient agar + SFPE 25% 배지에서 배양 시켜 관찰 한 결과 전반적으로 GPYA 배지에서 균주들이 잘 자랐으 며 Nutrient 배지에서는 잘 자라지 않았다. 하지만 SFPE를 25% 첨가한 Nutrient agar에서 균주의 생장률이 좋아 특이 적으로 솔잎의 성분을 주성분으로 사용하여 생장을 한다.
- 는 결과를 알 수 있었다(Table 2B-C), 또한, 생리학적 . 형 태적인 분석을 위해 유사성이 가장 높은 Candida emo沛오+ 비교실험을 수행한 결과 형태적으로 모양은 구형이었다. 솔잎 발효균의 선발 과정을 통하여 선발된 Candida species2는 Candida ernobli NRRL Y-17782T 및 Candida karawaiewii NRRL Y-17784T와 26S rRNA D1/D2 domain에서 모두 2개의 염기서열의 차이만 보였다.
- 형 태적인 분석을 위해 유사성이 가장 높은 Candida emo沛오+ 비교실험을 수행한 결과 형태적으로 모양은 구형이었다. 솔잎 발효균의 선발 과정을 통하여 선발된 Candida species2는 Candida ernobli NRRL Y-17782T 및 Candida karawaiewii NRRL Y-17784T와 26S rRNA D1/D2 domain에서 모두 2개의 염기서열의 차이만 보였다. 또한 Pichia holstii NRRL Y-2155T와 4개의 염 기서열 차이를 보였고, 그 외 Candida ishiwadae NRRL Y-17654T와 11개의 염기서 열 차이를 보여(Fig.
- 솔잎 발효균의 선발 과정을 통하여 선발된 Candida species2는 Candida ernobli NRRL Y-17782T 및 Candida karawaiewii NRRL Y-17784T와 26S rRNA D1/D2 domain에서 모두 2개의 염기서열의 차이만 보였다. 또한 Pichia holstii NRRL Y-2155T와 4개의 염 기서열 차이를 보였고, 그 외 Candida ishiwadae NRRL Y-17654T와 11개의 염기서 열 차이를 보여(Fig. 1), 앞으로 발효균과 기존의 미생물과 의 생리 . 생화학적인 작용과 효율을 비교하고자 한다.
- coli, Bacillus siibtilis와 Staphylococcus a"re"s에 대해서 항균활성을 가지고 있는데, 특히 Bacillus s"质液s에 대해서 높은 항 균활성을 확인하였다. 또한 SFPE 1에서 SFPE 4, 7로 발효 가 진행됨에 따라 항균활성이 높아짐을 본 실험을 통하여 짐작할 수 있었다(Fig. 2). 더불어 Staphylococcus aureus 경우 식품 독성 유발균의 일종으로써 SFPE를 합성방부제 대신 천연방부제로써 사용할 수 있는 가능성에 대해서 기 대해 볼 수 있다.
- SFPE의 항산화 활성능력을 측정하기 위하여 NBT 방법에 의하여 Superoxide anion radical 소거능력을 측정한 결과 SFPE 1, 4, 7 모두 항산화능력이 높음을 확인 하였다. SFPE 1, 4, 7을 0.
- SFPE의 항산화 활성능력을 측정하기 위하여 NBT 방법에 의하여 Superoxide anion radical 소거능력을 측정한 결과 SFPE 1, 4, 7 모두 항산화능력이 높음을 확인 하였다. SFPE 1, 4, 7을 0.025 成问의 농도로 처리하였을 경우 SFPE 1은 37.5%, SFPE 4는 34%, SFPE 7은 33%의 NBT scavenging 의 활성을 보여주었고, 0.15 岡ml의 농도로 처리 하였을 경우에는 SFPE 1은 75%, SFPE 4는 77.8%, SFPE 7은 78%의 NBT scavenging 활성을 보여주었다. 또한 0.
- SFPE의 혈관이완활성을 확인하기 위해 흰쥐의 흉부대동 맥 혈관절편을 이용하였다. 수축성 물질인 Phenylephrine (PE) (106 M)으로 유발된 수축반응에 대해 SFPE를 0.15 mg/ml을 첨가하였을 때 반응이 나타났으며, 다시 수축되었 다가 0.3 mg/ml을 첨가하였을 때 혈관이 다시 이완된 것을 볼 수 있었다(Fig. 4A). 그리고 SFPE의 혈관이완반응은 ATP-민감성 K* 통로 차단제인 glibenclamide (10'5 M)을 전 처리하였을 때 차단되었다.
- 솔잎자체발효 (SFPE)에 관여 하는 균을 발효단계에 따라 분리, 선발하고 동정하였다. GPYA배지에서 발효균을 스크린하여 Pichia galeiformis, Candida boidinii, Pichia species, Candida species 1, Candida species2, Candida ooidensis, Saccharomyces cerevisiae, Candida fazrawaiewii를 선발하였으며, 발효가 진행됨에 따라 2년차에는 Candida boidinii, Candida species2, Candida ooidensis, Saccharomyces cerevisiae7\ 선발되었고, 3년차에 는 Candida speciesl&2가 선발되어 Candida species2가 우점 종으로 나타났다. 그러나 발효 4년차에는 어떤 균도 선발 되지 않았다.
- 65% 의 homology 를 보였다. E. coli, Bacillus subtilis 와 Staphylococcus aureus0^ 대해서 SFPE를 농도별로 처리하였 을 때 높은 항균활성을 확인하였다. SFPE 1, 4, 7의 항산 화 활성은 0.
- coli, Bacillus subtilis 와 Staphylococcus aureus0^ 대해서 SFPE를 농도별로 처리하였 을 때 높은 항균활성을 확인하였다. SFPE 1, 4, 7의 항산 화 활성은 0.025 以/ml의 농도로 처리하였을 경우 SFPE 1, 4, 7이 약 34.8%의 NBT scavenging의 활성을 보여주었고, 0.2 必/ml~0.3 以/ml의 농도에서는 SFPE 1, 4, 7이 약 90% 에 달하는 NBT scavenging 의 활성능력을 확인할 수 있었다. 또한 전기생리학적 실험을 통하여 솔잎발효액이 쥐의 혈관수축 이완에 미치는 효과를 분석한 결과 Phenylephrine (PE) (IO』M)으로 유발된 수축반응에 대해 SFPE를 0.
- 3 以/ml의 농도에서는 SFPE 1, 4, 7이 약 90% 에 달하는 NBT scavenging 의 활성능력을 확인할 수 있었다. 또한 전기생리학적 실험을 통하여 솔잎발효액이 쥐의 혈관수축 이완에 미치는 효과를 분석한 결과 Phenylephrine (PE) (IO』M)으로 유발된 수축반응에 대해 SFPE를 0.15 mg/ml과 0.3 mg/ml을 첨가하였을 때 혈관이 다시 이완되었 으며, ATP 민감성 K* 채널 억제제인 glibenclamide (1(广 M) 을 처리하였을 때 SFPE 7 효과가 나타나지 않은 것으로 보아 SFPE의 혈관 이완작용이 세포막 ATP-민감성 K* 통 로를 활성화시켜 이루어짐을 확인하였다.
후속연구
- 한 가지 비슷한 예로써 우리나라의 대표적인 조미식 품인 간장의 발효에 관여하는 Pediococcus halophilus, Zygosaccharomyces ms浦와 Torulopsis versatilis, Candida etch이Isii를 고정화시켜 cohinni형 발효조를 이용하여 간장 발효기간을 단축시키는 연구를 시도한 바 있다(30). 따라서 향후에는 솔잎 발효 균주를 이용해 발효 기간을 단축시킬 수 있으며 SFPE의 상품화와 대량생산 가능성을 연구하고 자 한다.
- 이런 결과로 SFPE의 항산화 활성 능력을 확인할 수 있었다. 활성 산소의 연쇄반응으로 효소 불활성, 세포노화, 동 맥경화, 당뇨병, 뇌졸중, 암 등의 질병을 유발하게 만드는 데(25, 32), 이들 성인병에 대한 치료는 한계가 있으므로 항산화 효과가 풍부한 SFPE의 생체조절 기능에 대한 효과를 병행하는 방법 등을 다양하게 검토해야 할 것을 실험을 통하여 확인하였다.
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