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문제 정의
- 고농도 세포배양을 통한 분자진화 기술에 의하여 얻어진 음이온에 안정한 papain의 최적 발현 방법 개발하였다. Fed-batch 방법은 2-stage 방법으로 초기 성장 구간에서는 glucose, YE만 가지고 배양한 후 expression 구간에서 galactose, glucose, YE로 바꾸어 하여 실험을 하였다.
- 본 연구에서는 방향성 분자 진화기술 (directed molecular ev아ution)을 이용한 음이온에 안정한 papain의 개발을 연구 목표로 하고 있다.
- 이 연구의 최종 목표는 방향성 분자진화기술 (directed molecular evolution)을 이용한 음이온에 안정한 papain의 개발이다. 음이온 안정성 papain 생산을 위한 유전자의 방향성 분자진화 방법 개발이 이루어졌으며 분자진화된 음이온 안정성 papain의 스크리닝 방법 개발됐다.
제안 방법
- 10%를 유지하여 진행하였다. 초기에 C/N ratio가 3/2인 feeding solution을 feeding program을 이용하여 specific growth rate (μ)를 0.1 hr"로 유지하면서 600 rpm에서 O.D. 70까지 배양한 후 expression stage에 galactoseC-source shift 하여 최종 O.D. 90까지 fed-batch로 진행하였다.
- Error prone PCR 방법과 DNA shuffling을 통하여 분자 진화를 수행하였다. 그 결과 음이온 안정성 papain 유전자를 획득할 수 있었다.
- Filter paper 이용하는 방법을 선택하였다. 96 well 액체배지와 YDGS plate에 error prone 된 papain library의 transformation colony을 접종 후 4일 배양한 후 4℃ cold chamber에서 cell을 precipitation 시킨다.
- 9 ml에 희석하여 사용하였다. Papain을 1 g/L, 500 ㎎/L, 250 mg/L, 100 mg/L, 50 mg/L, 25 mg/L의 6가지 구간으로 정하여 실험하였다.
- 음이온성 고분자물질과 계면활성제 중 대표적으로 사용되는 3가지 시약 polyacrylamide, polyacrylic acid, polysorbate 를 대상으로 실험하였다. Skim milk agar plate (skim milk 0.5%)에 각각의 음이온 시약과 계면활성제를 1%를 첨가하여 사용하였다. 분자진화된 개량형 papain library들이 발현한 배양액 20 ㎕에 음이온 물질을 1% 첨가하여 30 hr 동안 방치한 후 이를 paper disk 위에 떨어뜨려 clear zone을 확인하였다.
- Skim milk agar plate를 이용하여, 활성 및 안정성이 뛰어난 개량형 papain의 screening 방법을 개발하여 분자진화된 음이온 안정성 papain의 Colony를 획득할 수 있었다. Colony 선별은 Fig.
- Staggered extension process는 선별된 papain 변이체 유전자를 같은 양으로 혼합 후 이것을 template로 하여 각 forward, reverse primer를 넣고 extension 시간 없이 denaturation, annealing만 반복적으로 PCR을 하였다.
- 증폭된 유전자를 이용하여 papain을 발현하는 YEGa-Papain Ⅳ (GAL promoter)와 pYIGP-Papain Ⅳ (GAP promoter) vectoi를 개발하였다. 또한 이들 vector를 S. cerevisiae Y2805에 형질 전환 하였고, papain 발현을 확인하였으며, 이들을 error prone PCR을 통한 papain library의 발현에 사용하였다.
- Skim milk agar plate 이용, 활성 및 안정성이 뛰어난 개량형 papain을 Filter papei.방법을 이용하여 screening 방법을 개발하였다.
- DNA sequencing을 하기 위해서는 screening으로 선별된 papain mutant P32-15 균주를 최소 액체 배지 또는 복합배지 5 ㎖에 접종하여 20시간 배양하였다. 배양 후 1 ㎖을 취하여 원심분리 후 상등액을 버리고 pellet을 genomic DNA purification kit를 이용하여 yeast에 있는 plasmid를 정제하였으며, 이를 이용하여 papain 유전자만을 PCR 하였고, 이 PCR product를 sequencing 하였다.
- Cystein protease 중의 하나인 papaine, 표피에 적용될 경우 박리된 표피의 각질을 이루는 케라틴 등의 단백질을 분해하여, 표피 신진대사를 원활하게 하여, 피부 기능의 정상화를 유지 할 수 있는 효소제로서, 현재 화장품 및 향장품의 첨가제로서 많이 이용되고 있으나 현재 화장품에 첨가 시에 보여지는 가장 큰 문제점으로는 제형 성분에 다량 존재하는 음이온성 고분자물질 (polyacrylicacid, polyacrylamide) 및 계면활성제 (sorbitan stearate, polysorbate)에 대한 불안정성으로 인하여 효소 활성의 상실이다. 본 연구에서는 분자 진화 방법을 이용하여, 음이온 환경에서 안정한 papain으로 개량하였다.
- 각 개량형 papain 변이체와 wild type papain을 대상으로 음이온 (polyacrylamide)을 첨가하지 않았을 때의 활성을 각각 100%로 기준 삼고 음이온 첨가시 노출 시간 기준으로 활성의 감소를 측정하였다. 분자진화 방법에 의하여 Polyacrylamide 첨가시 안정성을 지니는 개량형 papain을 얻고자 screening한 결과 skim milk plate에서 크고 선명한 clear zone을 형성하는 두 가지 개량형 papain candidate을 얻어 실제 actⅣity test를 수행하였다. 이 결과 음이온 첨가 35시간 경과 후에는 wild type의 papain 활성이 100%에서 약 2.
- 분자진화된 재조합 papain의 formulation 및 제품 적용화 기술개발이다, 연구 결과 Papain petidase Ⅳ 유전자의 확보 및 발현균주 개발하였고 음이온 안정성 papain 유전자를 얻기 위한 분자진화의 방법 개발 및 조건 확립하였다. 분자진화 방법으로 error prone PCR 방법 확립, DNA shuffling 을 통한 mutagenesis 방법 확립, staggered extension process 방법 확립 및 분자진화된 음이온성 안정성 papain의 효율적 스크리닝 방법 개발하였다. Skim milk agar plate 이용, 활성 및 안정성이 뛰어난 개량형 papain을 Filter papei.
- 5%)에 각각의 음이온 시약과 계면활성제를 1%를 첨가하여 사용하였다. 분자진화된 개량형 papain library들이 발현한 배양액 20 ㎕에 음이온 물질을 1% 첨가하여 30 hr 동안 방치한 후 이를 paper disk 위에 떨어뜨려 clear zone을 확인하였다.
- 음이온이 첨가된 skim milk agar plate에서 clear zone을 형성하는 파파인 생산 균주에 대해서 casein 활성 측정법으로 활성감소율을 측정하였고 선택된 분자진화된 개량형 papain 발현된 상등액을 20X 희석하여 음이온의 최종농도가 1%가 되도록 조제하였다. 음이온 첨가 후 5 hr, 10 hr, 15 hr, 20 hr, 24 hr, 30 hr, 35 hr 동안 각각 방치하여 sample을 취한 후 음이온을 넣지 않은 배양액을 control 100%로 하였을 때 음이온 첨가시의 활성을 %로 나타내었다.
- 음이온을 넣지 않은 각각의 papain 배양액을 100%를 기준으로 각 개량형 papain 변이체와 wild type papain을 대상으로 음이온 (polyacrylic acid)을 첨가하지 않았을 때의 활성을 각각 100%로 기준 삼고 음이온 첨가 시 노출시간 기준으로 활성의 감소를 측정하였다. Polyacrylic acid 첨가 후 35시간 경과 시 wild type의 papain 활성이 100%에서 4%로 감소된 반면 P38-10과 P32-15의 개량형 papain 활성은 각각 100 에서 40.
- 음이온이 첨가된 skim milk agar plate에서 clear zone을 형성하는 파파인 생산 균주에 대해서 casein 활성 측정법으로 활성감소율을 측정하였고 선택된 분자진화된 개량형 papain 발현된 상등액을 20X 희석하여 음이온의 최종농도가 1%가 되도록 조제하였다. 음이온 첨가 후 5 hr, 10 hr, 15 hr, 20 hr, 24 hr, 30 hr, 35 hr 동안 각각 방치하여 sample을 취한 후 음이온을 넣지 않은 배양액을 control 100%로 하였을 때 음이온 첨가시의 활성을 %로 나타내었다.
- 재용해 후 크로마토그래피 공정으로 넘어가기 전에 염과 저분자량의 배지성분들을 제거하였다. 이러한 저분자량의 불순물을 제거하기 위해서 dialysis를 하였다. 크로마토그래피 공정에는 heparin-Sepharose affinity column, CM column과 DEAE column을 사용하여 정제하였다.
- 파파야 열매에서 RNA를 뽑아내어 cDNA를 합성하였고 이를 이용하여 PCR에 의해서 papain 유전자를 증폭하였다. 증폭된 유전자를 이용하여 papain을 발현하는 YEGa-Papain Ⅳ (GAL promoter)와 pYIGP-Papain Ⅳ (GAP promoter) vectoi를 개발하였다. 또한 이들 vector를 S.
- 이러한 저분자량의 불순물을 제거하기 위해서 dialysis를 하였다. 크로마토그래피 공정에는 heparin-Sepharose affinity column, CM column과 DEAE column을 사용하여 정제하였다. 크로마토그래피로 얻어진 파파인은 Sephadex G-100 column으로 gel filtration을 수행하였다.
- 크로마토그래피 공정에는 heparin-Sepharose affinity column, CM column과 DEAE column을 사용하여 정제하였다. 크로마토그래피로 얻어진 파파인은 Sephadex G-100 column으로 gel filtration을 수행하였다.
- 파파야 열매에서 RNA를 뽑아내어 cDNA를 합성하였고 이를 이용하여 PCR에 의해서 papain 유전자를 증폭하였다. 증폭된 유전자를 이용하여 papain을 발현하는 YEGa-Papain Ⅳ (GAL promoter)와 pYIGP-Papain Ⅳ (GAP promoter) vectoi를 개발하였다.
- 혼합 DNA 1 ㎕, 각 primer 30 pmol, Taq buffer 10 ㎕, 10 mM dNTP 2 ㎕, Taq polymerase 2.5 unit를 넣고 전체 부피 100 ㎕가 되도록 D.W로 채운 후 PCR 기기로 반응을 하였다. PCR의 시간 및 온도 조건은 94℃ 5 min을 한 후 extension 구간이 없이 94℃ 30 sec, 52℃ 5 sec를 80 cycle로 반복하여 반응하였다.
대상 데이터
- Papain의 정량 분석 방법 확립은 Sigma로부터 Papain (14 unit/mg), Casein N, N서imethylated (5 g) 과 Picrylsulfonic acid (2, 4, 6-trinitrobenzenesulfonic acid, 10 ml)를 각각 구입했다.
- cerevisiae BJ5465 (MATa ura3-52 leu2-3 leu2- 12 his4-419 wc2-9)를 사용하였다. 또한 plasmid 구축 및 증폭을 위한 E. coli 숙주세포는 XLLBlue와 DH5a를 사용하였다. 효모 S.
- 분자진화 방법으로는 Error prone PCR 방법 확립 정제된 papain PCR product, 10X mutagenic buffer (70 mg MgCh, 500 mM KCl, 100 mM Tris-HCl (pH 8.3 at 25℃), 0.1% (wt/vol) gelatin), 10X dNTP mix (2 mM dGTP, 2 mM dATP, 10 mM dCTP, 10 mM dTTP) 및 5 mM MnCl2 용액을 준비하였다. PCR tube에 10X mutagenic buffer 10 ㎕, 10X dNTP mix 10 ㎕ 각 primer 30 pmol, template DNA 1 ㎕, Taq polymerase 5 unit, enor rate를 조절하기 위해서 MnCL을 0.
- 연구의 범위는 음이온 안정성 papain 생산을 위한 유전자의 방향성 분자진화와 분자 진화된 음이온 안정성 papain의 스크리닝, 분자 진화된 papain의 아미노산 서열 및 특성 분석, 분자진화된 재조합 papain의 생산방법 기술 개발 확립이다.
- 음이온성 고분자물질과 계면활성제 중 대표적으로 사용되는 3가지 시약 polyacrylamide, polyacrylic acid, polysorbate 를 대상으로 실험하였다. Skim milk agar plate (skim milk 0.
- cerevisiae 숙주세포와 plasmids를 Table 1에 정리하였으며, papain 유전자의 경우는 papaya 열매에서 얻었다. 재조합 papain 발현용 S. cerevisiae 균주는 모두 uracil 영양 요구성 변이주이며 haploid로 S. cerevisiae 2805 (MATa pep4::HIS3 prbl-1.6R canl GAL2, his3 -200 ura3 - 52)와 S. cerevisiae BJ5465 (MATa ura3-52 leu2-3 leu2- 12 his4-419 wc2-9)를 사용하였다. 또한 plasmid 구축 및 증폭을 위한 E.
- coli 숙주세포는 XLLBlue와 DH5a를 사용하였다. 효모 S. c纣印&*에서 papain 발현 vector는 유도성 발현 vector로써는 GAL promoter# 가진 YEGoHIR525와 GAP promoter# 가진 pYIGP vector를 사용하였다. 이 vector들은 형질 전환효소의 선택표지로 URA 3 (orotidine- 5, - phosphate decarboxylase) 유전자를 가지며, 효모 복제원으로 2 μm replication origin을 이용하여 복제한다.
데이터처리
- 5%)에서 재확인하였다. Ens prone 하여 얻어진 변이체에 대해서도 동일한 실험으로 O.D 값을 측정하여 Papain과 비교분석하여 정량하였다. 분석 결과는 Fig.
이론/모형
- Papain의 정제 방법을 확립하기 위해 파파인의 일차 분리에 ammonium sulfate를 이용한 침전법을 사용하였다. 침전물은 5 mM Tris buffer (pH 7.
성능/효과
- Error prone 된 파파인 생산균주의 발현 배양액을 paper disk에 떨어뜨린 결과 활성이 증가된 colony의 경우 clear zone이 다른 colony에 비하여 선명함을 확인하였고 선택된 균주에 대해서 flask로 배양하여 skim milk agar plate (skim milk 0.5%)에서 재확인하였다. Ens prone 하여 얻어진 변이체에 대해서도 동일한 실험으로 O.
- P32-15에 대해서 sequencing을 한 결과 전체 1047개의 염기 서열 중 7개가 바뀌었으며, 이 중에서 아미노산의 변화에 영향을 준 염기는 5개이었고, 이로 인해 4개의 아미노산의 서열이 바뀐 것을 알 수 있었다.
- P38-10에 대해서 sequencing을 한 결과 전체 1047개의 염기 서열 중 9개가 바뀌었으며, 이 중에서 아미노산의 변화에 영향을 준 염기는 7개이었고, 이로 인해 6개의 아미노산의 서열이 바뀐 것을 알 수 있었다.
- 음이온을 넣지 않은 각각의 papain 배양액을 100%를 기준으로 각 개량형 papain 변이체와 wild type papain을 대상으로 음이온 (polyacrylic acid)을 첨가하지 않았을 때의 활성을 각각 100%로 기준 삼고 음이온 첨가 시 노출시간 기준으로 활성의 감소를 측정하였다. Polyacrylic acid 첨가 후 35시간 경과 시 wild type의 papain 활성이 100%에서 4%로 감소된 반면 P38-10과 P32-15의 개량형 papain 활성은 각각 100 에서 40.8%와 100에서 22.94%로 활성감소가 줄어들음을 알 수 있었다. 이 결과 P38-1O의 경우 wild type에 비하여 음이온 존재 시 35시간 후에는 활성이 10.
- 각 개량형 papain 변이체와 wild type papain을 대상으로 음이온 (Polysorbate)을 첨가하지 않았을 때의 활성을 각각 100%로 기준 삼고 음이온 첨가 시 노출 시간 기준으로 활성의 감소를 측정하였다. Polyoxyethylenesorbitan monooleate 첨가 후 35시간 경과 시 wild type의 papain 활성이 100%에서 4%로 감소된 반면 P38-1O과 P32-15의 개량형 papain 활성은 각각 100에서 40.4%와 100에서 25.3%로 활성감소가 줄어들음을 알 수 있었다. 이 결과 P38-1O의 경우 wild type에 비하여 음이온 존재 시 35시간 후에는 활성이 10배 유지되며, P32-15는 wild type에 비해 약 6배 유지됨을 확인하였다.
- 각 개량형 papain 변이체와 wild type papain을 대상으로 음이온 (Polysorbate)을 첨가하지 않았을 때의 활성을 각각 100%로 기준 삼고 음이온 첨가 시 노출 시간 기준으로 활성의 감소를 측정하였다. Polyoxyethylenesorbitan monooleate 첨가 후 35시간 경과 시 wild type의 papain 활성이 100%에서 4%로 감소된 반면 P38-1O과 P32-15의 개량형 papain 활성은 각각 100에서 40.
- 각 개량형 papain 변이체와 wild type papain을 대상으로 음이온 (polyacrylamide)을 첨가하지 않았을 때의 활성을 각각 100%로 기준 삼고 음이온 첨가시 노출 시간 기준으로 활성의 감소를 측정하였다. 분자진화 방법에 의하여 Polyacrylamide 첨가시 안정성을 지니는 개량형 papain을 얻고자 screening한 결과 skim milk plate에서 크고 선명한 clear zone을 형성하는 두 가지 개량형 papain candidate을 얻어 실제 actⅣity test를 수행하였다.
- 결과적으로 음이온 물질에 의하여 파파인의 활성이 매우 저해됨을 알 수 있었고, 특히 35 hr 정도 음이온에 노출되었을 때 wild type의 파파인은 그 활성이 거의 대부분 없어지는 것으로 확인되었다(2~4% 활성만 잔류). 그러나 본 분자진화 방법에 의하여 구한 P32-15, P38-10 개량형 papain 변이체의 경우는 이러한 음이온 첨가 후 35시간이 경과 후 wild type에 비해 활성이 10-15배 정도로 높게 유지됨을 알 수 있었다.
- Error prone PCR 방법과 DNA shuffling을 통하여 분자 진화를 수행하였다. 그 결과 음이온 안정성 papain 유전자를 획득할 수 있었다.
- 결과적으로 음이온 물질에 의하여 파파인의 활성이 매우 저해됨을 알 수 있었고, 특히 35 hr 정도 음이온에 노출되었을 때 wild type의 파파인은 그 활성이 거의 대부분 없어지는 것으로 확인되었다(2~4% 활성만 잔류). 그러나 본 분자진화 방법에 의하여 구한 P32-15, P38-10 개량형 papain 변이체의 경우는 이러한 음이온 첨가 후 35시간이 경과 후 wild type에 비해 활성이 10-15배 정도로 높게 유지됨을 알 수 있었다.
- 분자진화된 papain의 아미노산 서열 및 특성 분석과 분자진화된 재조합 papain 의 생산방법 확립되었다. 분자진화된 재조합 papain의 formulation 및 제품 적용화 기술개발이다, 연구 결과 Papain petidase Ⅳ 유전자의 확보 및 발현균주 개발하였고 음이온 안정성 papain 유전자를 얻기 위한 분자진화의 방법 개발 및 조건 확립하였다. 분자진화 방법으로 error prone PCR 방법 확립, DNA shuffling 을 통한 mutagenesis 방법 확립, staggered extension process 방법 확립 및 분자진화된 음이온성 안정성 papain의 효율적 스크리닝 방법 개발하였다.
- 94%로 활성감소가 줄어들음을 알 수 있었다. 이 결과 P38-1O의 경우 wild type에 비하여 음이온 존재 시 35시간 후에는 활성이 10.2배 유지되며, P32-15는 wild type에 비해 약 5.7배 유지됨을 확인하였다.
- 3%로 활성감소가 줄어들음을 알 수 있었다. 이 결과 P38-1O의 경우 wild type에 비하여 음이온 존재 시 35시간 후에는 활성이 10배 유지되며, P32-15는 wild type에 비해 약 6배 유지됨을 확인하였다.
- 분자진화 방법에 의하여 Polyacrylamide 첨가시 안정성을 지니는 개량형 papain을 얻고자 screening한 결과 skim milk plate에서 크고 선명한 clear zone을 형성하는 두 가지 개량형 papain candidate을 얻어 실제 actⅣity test를 수행하였다. 이 결과 음이온 첨가 35시간 경과 후에는 wild type의 papain 활성이 100%에서 약 2.7%로 감소된 반면 P38-10과 P32-15의 개량한 papain은 활성이 각각 100%에서 41.99%와 28% 정도로 활성 감소가 되었음을 알 수 있었다. 이 결과는 P38-10의 경우 wild type과 비하여 음이온 첨가 후 약 35시간에서 측정한 결과 활성이 약 15배 정도로 유지됨을 확인하였으며 P32-15는 wild type에 비해 약 10배 정도로 유지됨을 확인하였다.
- 99%와 28% 정도로 활성 감소가 되었음을 알 수 있었다. 이 결과는 P38-10의 경우 wild type과 비하여 음이온 첨가 후 약 35시간에서 측정한 결과 활성이 약 15배 정도로 유지됨을 확인하였으며 P32-15는 wild type에 비해 약 10배 정도로 유지됨을 확인하였다.
- Papain의 정제 방법을 확립하기 위해 파파인의 일차 분리에 ammonium sulfate를 이용한 침전법을 사용하였다. 파파인의 분자량은 33 kDa이며, silver gel 상에서 순수한 발현 band를 확인하였다.
후속연구
- 화장품의 적용 대상인 피부는, 다른 신체 조직과 마찬가지로 외부의 환경 변화에 따른 다양한 생리작용이 지속적으로 진행되고 있으며, 대부분의 최종 생리대사는 효소에 의해 직접적으로 이루어지어 있다. 따라서 효소 자체를 화장품 원료로 사용할 경우에는, 기존의 단순 첨가 원료가 가질 수 없는 원하는 특정 대사 과정을 보유한 화장품의 개발이 가능해질 것으로 기대된다.
- 본 기술의 중요성은 화장품 첨가제로서의 단일 효소의 개량뿐만 아니라, 동일 기술이 화장품으로 상용이 가능한 다양한 효소들에 적용될 수 있는 기반 기술로 응용될 수가 있다는 점이다. 특히 개발 시 장기간을 소요하며, 위험 부담이 높은 의약품의 신개발과는 다르게, 개발 기간 및 적용이 상대적으로 유리한 화장품 원료용 개량 효소류의 생산은, 기술의 적용 또한 용이하다.
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