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문제 정의
- 또한 홍화씨 (종실 , 홍화자)에 는 essential oil, linoleic acid, glyceride, oleic acid가 함유되어 있으며 특히 linoleic acid가 특히 많이 함유되어 있어 콜레스테롤을 저하시키므로 고혈압, 동맥경화 치료 및 예방에 쓰인다고 보고되고 있으며(18, 19), 홍화씨에는 항산화 효과가 뛰어난 serotonin 화합물, 플라보노이 드 성 분인 ascetin 등을 함유한 것으로 밝혀졌다(20, 21). 따라서 본 연구는 생체내 당 이용 능력의 이상으로 일어나는 만성 대사성 질환으로서 고혈당 과 여러가지 합병증을 일으키는 당뇨병의 대표 증상인 지 질 대사 이상에 대하여 홍화씨와 당뇨에 전통적으로 이용되어 온 한약재 혼합 추출물이 미치는 영향에 대하여 조사하고자 실시하였다.
- 당뇨병은 생체내 당 이용 능력의 이상으로 일어나는 만성 대사성 질환으로서 심 혈관계 합병증이 일으키는 대표 증상 인 고혈당과 지질대사를 치료하기 위하여 많은 환자들이 민 간요법에 의존하고 있다. 이에 본 연구는 홍화씨와 한약재 혼합 추출물이 혈당강하와 지질상태 개선에 대한 효능을 검 증하고자 실시하였다. 당뇨는 streptozotocin(45 ㎎/㎏ B.
가설 설정
- 2)Values are means ±SD (n=12).
- 3)Values with the same superscript letter within the column are not significantly different (p<0.05).
- 3)Values with the same superscript letter within the column are not significantly different (p<0.05).
- 4)Values with the same superscript letter within the column are not significantly different (p<0.05).
제안 방법
- 그런 다음 채혈한 혈액을 3, 000 rpm에서 15분간 원심분리하여 혈장을 분리한 후 분석 시 까지 -70℃에 보관하였다. 간 조직 은 1.15% KC1 완충용액으로 관류시켜 적출하여 여러 번 세척한 다음 여과지로 수분을 완전히 제거시켜 간 조직의 무게를 측정하였다. 이 중 일부를 취해서 지질 성분 분석에 이용하였고, 나머지 일부는 초원심 분리로 마이크로솜 분획 을 수집 하여 지 질과산화물 함량 측정에 사용하였다.
- 홍화씨는 정선, 선별, 건조한 후 160~ 180℃ 온도에서 15 ~20분정도 약간 색이 나게 볶음 처리한 후 분쇄시켜 분말 상태로 만들었다. 그런 다음 여러 연구자들의 연구결과(22- 26)와 한의 원 에서 당뇨와 혈중 지 질성 분을 저 하시 키는데 보 편적으로 이용되고 있는 12가지 한약재(맥문동, 감초, 상엽, 백복령, 숙지 황, 비파엽, 독활, 대추, 산수유, 천화분, 목단피, 오미자)를 선정 하여 음건한 후 작은 절편으로 파쇄 하여 혼합 하였다. 그런 다음 진탕기 에 넣은 후 물 2000 mL와 혼합하여 4시간 동안 가열 추출하여 여 과시 킨 후 500 mL로 농축시 켜 서 홍화씨와 한약재 혼합추출액을 얻었다(Table 1).
- STZ 주 사 48시간 후 요당 시험용 strip을 이용하여 요당이 300 mg/dL 이상인 쥐의 경우 당뇨로 간주하여 사용하였다. 당 뇨 확인 후 4주 동안 홍화씨 와 한약재 혼합추출물의 투여 량 을 70 kg인 사람이 하루 먹는 양 200 mL를 기준으로 하여 체중 kg당 환산된 기준량의 2배로 하여서 매일 일정 시 각에 한 번씩 경구 투여하였으며 정상군은 0.9%의 생리적 식 염수 를 투여하였다. 실험기간 동안 식이와 물은 자유로이 섭취 시켰다.
- 이에 본 연구는 홍화씨와 한약재 혼합 추출물이 혈당강하와 지질상태 개선에 대한 효능을 검 증하고자 실시하였다. 당뇨는 streptozotocin(45 ㎎/㎏ B.W.) 으로 S.D.계 흰쥐에게 근육주사로 유도시킨 다음 주재료로 볶은 홍화씨 50 g, 100 g 각각에 부재 료로 맥문동, 감초, 상엽 , 백복령, 숙지황, 비파엽, 독활, 대추, 산수유, 목단피, 천화분, 오미 자를 섞 어 서 만든 한방 혼합 추출물을 당뇨 유도 쥐 에 게 체중 kg 당 100 mg, 200 mg의 홍화씨를 섭취할 수 있도록 각각 경구 투여 하였다. 당뇨쥐 의 고혈당 증상은 100 g의 홍 화씨를 넣고 추출한 한약재 혼합추출물의 투여로 정상수준 은 아니었지만 34% 낮아졌다(p<0.
- 사육하였다. 사육실의 온도와 습도 는 각각 20±2℃, 55 ±5%와 채 광은 8:00~ 20:00로 명 암주기 를 조절하였다. 실험식이는 Table 2처럼 AIN-76(27)을 기 본식 이로 만들어 4주 동안 적 응시 킨 후 당뇨를 유도한 다음 4주 동안 홍화와 한약재 혼합추출물을 투여 하였다.
- 사육실의 온도와 습도 는 각각 20±2℃, 55 ±5%와 채 광은 8:00~ 20:00로 명 암주기 를 조절하였다. 실험식이는 Table 2처럼 AIN-76(27)을 기 본식 이로 만들어 4주 동안 적 응시 킨 후 당뇨를 유도한 다음 4주 동안 홍화와 한약재 혼합추출물을 투여 하였다. STZ에 의한 실험동물의 당뇨 유발은 STZ를 신선한 0.
- 15% KC1 완충용액으로 관류시켜 적출하여 여러 번 세척한 다음 여과지로 수분을 완전히 제거시켜 간 조직의 무게를 측정하였다. 이 중 일부를 취해서 지질 성분 분석에 이용하였고, 나머지 일부는 초원심 분리로 마이크로솜 분획 을 수집 하여 지 질과산화물 함량 측정에 사용하였다.
- 혈장과 간 마이크로솜 내 지질과산화물 함량은 tiobar- bituric acid(TBA)와 반응하여 생성된 malondialdehyde (MDA) 양으로 측정하였다(29). 혈장 내 중성지질함량은 중 성 지 질 측정 용 kit(Embiel Co.
- 홍화씨 및 한약재 혼합추출물을 4주간 투여 한 흰쥐를 12 시간 절식시킨 후 에테르로 마취하여 복부 개복 즉시 대동맥 에서 헤파린으로 처리된 주사기로 채혈하였다. 그런 다음 채혈한 혈액을 3, 000 rpm에서 15분간 원심분리하여 혈장을 분리한 후 분석 시 까지 -70℃에 보관하였다.
대상 데이터
- 당뇨를 유도하기 위한 STZ 이외에 1, 1, 3, 3-tetraethoxypropane 그리고 thiobarbituric aicd(TBA)는 Sigma사(USA), 포도당 측정용 시약 (Glucose-E kit)은 영동저〕약(한국), 중성지질, 콜레스테롤, HDL-콜레스테롤, 인지질 그리고 유리지방산 측정용 시약 (kit)은 Embiel Co.(한국), 중성 지 방 표준액 인 trioleine Sig- ma사(USA), 인지질 표준액인 KHzPC”은 Wako사(Japan) 그리고 그 외 일반 시약과 유기용매는 일급 또는 특급품을 사용하였다.
- 3)에 용해시켜서 대퇴부에 Quan(28)의 방법에 따라 체중 kg당 45 mg의 근육 주사로 유도하였다. STZ 주 사 48시간 후 요당 시험용 strip을 이용하여 요당이 300 mg/dL 이상인 쥐의 경우 당뇨로 간주하여 사용하였다. 당 뇨 확인 후 4주 동안 홍화씨 와 한약재 혼합추출물의 투여 량 을 70 kg인 사람이 하루 먹는 양 200 mL를 기준으로 하여 체중 kg당 환산된 기준량의 2배로 하여서 매일 일정 시 각에 한 번씩 경구 투여하였으며 정상군은 0.
- Sprague-Dawley종의 이유한지 일주일 된 숫쥐 48마리를 바이 오제노믹 스에서 구입 하여 고형 사료로 4주 동안 적 응시킨 후 12마리씩 4군으로 나누어 stainless steel-bottomed cage에 한 마리씩 분리 .사육하였다.
- 토종 홍화씨는 의성에 주재해 있는 우리 홍화인 영농조합 에서 제공 받아 주원료로 이용하였으며 부재료로는 당뇨병 에 보편적으로 이용되고 있는 맥문동, 감초, 백복령, 숙지황, 비파엽, 독활, 대추, 산수유, 목단피, 오미자를 대구 약령시장 에서 구입하여 사용하였다. 실험식이에 이용된 casein과eelclose 는 Sigma사(USA), 비타민과 무기질은 Teklad사 (USA)로부터 구입하여 사용하였다. 당뇨를 유도하기 위한 STZ 이외에 1, 1, 3, 3-tetraethoxypropane 그리고 thiobarbituric aicd(TBA)는 Sigma사(USA), 포도당 측정용 시약 (Glucose-E kit)은 영동저〕약(한국), 중성지질, 콜레스테롤, HDL-콜레스테롤, 인지질 그리고 유리지방산 측정용 시약 (kit)은 Embiel Co.
- 토종 홍화씨는 의성에 주재해 있는 우리 홍화인 영농조합 에서 제공 받아 주원료로 이용하였으며 부재료로는 당뇨병 에 보편적으로 이용되고 있는 맥문동, 감초, 백복령, 숙지황, 비파엽, 독활, 대추, 산수유, 목단피, 오미자를 대구 약령시장 에서 구입하여 사용하였다. 실험식이에 이용된 casein과eelclose 는 Sigma사(USA), 비타민과 무기질은 Teklad사 (USA)로부터 구입하여 사용하였다.
데이터처리
- Values are means ±SD. I'hose different superscript letters are significantly different at p<0.05 by Duncan's multiple range test.
- Values are means ±SD. Those different superscript letters are significantly different at p<0.05 by Duncan's multiple range test.
- 실험 결과들은 SPSS 통계 package를 이용하여 실험군 당 평균土표준편차로 표시하였다. 실험군 간의 평균치 통계 적 유의성은 p<0.
- 실험 결과들은 SPSS 통계 package를 이용하여 실험군 당 평균土표준편차로 표시하였다. 실험군 간의 평균치 통계 적 유의성은 p<0.05 수준에서 Duncan's multiple test로 검 정하였다.
이론/모형
- 실험식이는 Table 2처럼 AIN-76(27)을 기 본식 이로 만들어 4주 동안 적 응시 킨 후 당뇨를 유도한 다음 4주 동안 홍화와 한약재 혼합추출물을 투여 하였다. STZ에 의한 실험동물의 당뇨 유발은 STZ를 신선한 0.1 M citrate buffer(pH 4.3)에 용해시켜서 대퇴부에 Quan(28)의 방법에 따라 체중 kg당 45 mg의 근육 주사로 유도하였다. STZ 주 사 48시간 후 요당 시험용 strip을 이용하여 요당이 300 mg/dL 이상인 쥐의 경우 당뇨로 간주하여 사용하였다.
- 0 mL과 잘 섞은 혼합액을 시료로 사용하여 측정하였고, 이때 표준용 액으로는 triolein을 사용하였다. 간 조직 내 콜레스테롤 함량은 Zlatkis와 Zak(34)의 방법으로 측정하였으며, 간 조직 내 인지질함량은 총 지질 성분 중 일부를 취해서 glacial acetic acid 3.0 mL와 잘 섞은 혼합액을 시료로 사용하여 측정한다. 이때 표준시약은 KH2PO4를 사용하여 조제하였다.
- 간의 총 지질함량은 chloroform:methanol(2:l, v/v)을 이용하여 Folch 등(32)의 방법으로 추출하여 측정하였고, 간 조직 중의 중성지질은 Mendez 등(33)의 방법을 이용하여 총 지질 추출물 중 일부를 취 해서 isopropanol 용액 2.0 mL과 잘 섞은 혼합액을 시료로 사용하여 측정하였고, 이때 표준용 액으로는 triolein을 사용하였다. 간 조직 내 콜레스테롤 함량은 Zlatkis와 Zak(34)의 방법으로 측정하였으며, 간 조직 내 인지질함량은 총 지질 성분 중 일부를 취해서 glacial acetic acid 3.
- 이때 표준시약은 KH2PO4를 사용하여 조제하였다. 단백질 정 량은 bovine serum albumin 표준 단백질 용액 을 사용하여 Lowry 등(35)의 방법으로 실시하였다.
- )를 사용하여 측정하였으며 LDL-콜 레스테롤은 Friedewald법(30)에 의하여 LDL-콜레스테롤 =총 콜레 스테 롤 - HDL-콜레 스테 롤 - (중성 지 방/5) 식 으로 계 산하였다. 동맥 경 화지 수(atherogenic index: AI)는 Hagluand (31)법 에 준하여 AI=(toatal cholesterol—HDL-cholesterol)/ HDL-cholesterol 식으로 계산하였다.
- , 한국)를 사용하였다. 혈장 내 인지질과 유리지 방산 함량은 효소법을 이용한 kit(Embiel Co., 한국)로 분석하였다. 혈청 내 HDL-콜레스테롤함량은 HDL-콜레스테롤 측정용 kit(Embiel Co.
- , 한국)로 분석하였다. 혈청 내 HDL-콜레스테롤함량은 HDL-콜레스테롤 측정용 kit(Embiel Co.)를 사용하여 측정하였으며 LDL-콜 레스테롤은 Friedewald법(30)에 의하여 LDL-콜레스테롤 =총 콜레 스테 롤 - HDL-콜레 스테 롤 - (중성 지 방/5) 식 으로 계 산하였다. 동맥 경 화지 수(atherogenic index: AI)는 Hagluand (31)법 에 준하여 AI=(toatal cholesterol—HDL-cholesterol)/ HDL-cholesterol 식으로 계산하였다.
성능/효과
- 이 와는 상반되 게 LDL-콜레스테롤 함량은 정상군에서 가장 낮은 함량을 보인데 비하여 당뇨군들은 정상군의 2배 가까운 함량을 보였다. HDL-콜레스테롤과 총 콜레스테롤비에 있어서는 정 상군이 당뇨군 모두 p<0.05 수준에서 유의적인 증가를 보임 에 따라서 홍화씨와 한약재 혼합추출물이 콜레스테롤 저하 에는 도움을 주지 못한 것으로 나타났다.
- 혈장내 지질과산화물 함량은 정상군과 당뇨군들 사이에 유 의적인 차이는 없었으며 홍화씨와 한약재 혼합추출물의 투여로 지질과산화물 함량 저하에 도움이 되지 못하였다. 그러나 간 마이크로좀의 지 질과산화물 함량은 정상군은 6.20 + 2.25 nmol/mg protein, 당뇨군은 7.74 ± 1.49 nmol/mg pro- tein으로 당뇨군이 p<0.05 수준에서 더 높았으며 100 g의 홍화씨를 첨가시켜 만든 한약재 혼합추출물 투여군에서 5.85± 1.33 nmol/mg protein으로 가장 낮은 함량을 보였다.
- 또한 지질과산화물에 의한 혈관 내 LDL-콜레스테롤 산화로 당뇨병 혈관 합병증 이 유발될 수 있으므로 당뇨 유발 및 합병증 발병 에 지질과 산화 반응이 미치는 영향을 클 것으로 여겨진다. 그러나 본 실험에서 당뇨로 인한 혈장과 간 마이크로좀 내 지질과산화 물 증가에 대하여 홍화씨와 한약재 혼합추출물이 보호효과를 보였다. 홍화씨의 뛰어난 항산화 효과는 serotonin 유도 처], flavonoid 성분인 acacetin 그리고 phenol 화합물이 존재 한다고 Kim 등(47)과 Kim 등(48)이 밝혔다.
- 05). 그러나 혈액과 간 조직 내 유리지방산, 총콜레스 테롤과 인지질함량은 실험 전 군에서 유의적인 차이를 볼 수 없었고, 정상군에 비하여 당뇨군에서 혈장내 LDL-콜레 스테롤과 동맥 경 화지수가 유의적으로 높은 반면에 HDL-콜 레스테롤은 낮았으며 홍화씨와 한약재 혼합추출물이 이들 함량 변화에 미치는 효과는 관찰되지 않았다. 이상의 본 실 험결과는 당뇨에 의한 혈당, 지질과산화물 그리고 중성지방 증가는 홍화씨 와 한약재 혼합추출물의 투여로 다소 완화되었다.
- 혈장 콜레스테롤과 더불어 중성지방 수준의 증가는 고지혈증을 일으키는데, 그 원인 은 콜레스테롤과 중성지방의 과잉섭취 및 지단백의 생합성 증가 또는 분해 감소, 혈장에서의 지단백 제거 속도의 지연 과 같은 지단백 대사의 이상에 의해 발생한다. 본 실험에서 있어서 혈장과 간 조직 에서 당뇨 유도로 증가된 중성 지방은 홍화씨와 한약재 혼합추출물의 투여로 저하시 켰으나 콜레 스테롤 함량에는 별다른 영향을 미치지 못한 것으로 나타났다. 이러한 결과는 홍화씨에는 중성지방의 저하를 유도하는 기능성 성분들이 존재할 것으로 생각되며 이것은 향후에 보다 자세한 연구들이 수행되어야 하겠다.
- 또한 인슐린비의존형 당뇨병 환자에게서 증가된 혈장 내 지질 과산화물의 주된 원인은 생체막 지질의 산화와 혈액 내 LDL-콜레스테롤 등 지단백질의 산화적 변형이 관련된다고 Freitas 등(46)은 보고하였다. 위의 연구내용과 본 연구결과를 연결시켜 볼 때 본 연구결과는 당뇨 유도 초기의 결과이 므로 당뇨군의 지질과산화물 증가는 지질과산화 반응이 당 뇨초기에 일어나는 것으로 여겨진다. 또한 지질과산화물에 의한 혈관 내 LDL-콜레스테롤 산화로 당뇨병 혈관 합병증 이 유발될 수 있으므로 당뇨 유발 및 합병증 발병 에 지질과 산화 반응이 미치는 영향을 클 것으로 여겨진다.
- 그러나 혈액과 간 조직 내 유리지방산, 총콜레스 테롤과 인지질함량은 실험 전 군에서 유의적인 차이를 볼 수 없었고, 정상군에 비하여 당뇨군에서 혈장내 LDL-콜레 스테롤과 동맥 경 화지수가 유의적으로 높은 반면에 HDL-콜 레스테롤은 낮았으며 홍화씨와 한약재 혼합추출물이 이들 함량 변화에 미치는 효과는 관찰되지 않았다. 이상의 본 실 험결과는 당뇨에 의한 혈당, 지질과산화물 그리고 중성지방 증가는 홍화씨 와 한약재 혼합추출물의 투여로 다소 완화되었다. 이러한 결과를 바탕으로 체내 혈당조절에 의한 당뇨병 의 예방 및 치유효과가 있는 홍화씨와 같은 천연물질의 기능 성 성 분에 대하여 향후에 보다 심층 있는 연구를 통하여 건 강 기능성 식품 소재로 활용하는 것이 매우 중요할 것으로 여겨진다.
- 간 조직 내 지질함량은 Table 7과 같다. 총 지질함량은 정상군에 비하여 당뇨 유도로 34%정도 증가되 었으며 , 이때 첨가된 홍화씨 량의 수준별 차이 없이 홍화씨 와 한약재 혼합 추출물이 정상군 수준까지 크게 저하시켰다(p<0.05). 또한 정상군(105.
- 05). 총 콜 레스테롤과 인지질함량은 모든 실험군에서 유의적인 차이는 관찰되지 않았다. 이러한 결과는 Cho 등(17)이 난소를 제거 시켜 체내 estrogen이 저하된 실험군에게 홍화박을 공 급시 킨 결과 공급시 키지 않은 군에 비하여 혈장 중성 지 방과 콜레스테롤이 낮았으며 분변으로 배설되는 담즙산이나 콜 레스테롤의 현저한 배설 증가로 체내 콜레스테롤의 pool이 감소되었다는 보고와는 차이를 보였다.
- 5). 혈장 내 지질과산화 물 함량은 정상군과 당뇨 유도군 간에 유의한 차이는 없었으 나, 간 마이크로좀의 지 질과산화물 함량은 정 상군은 6.20 + 2.25 nmol/mg protein에 비하여 당뇨군은 7.74 nmol/mg protein로 p<0.05 수준에서 높았다. 그러나 100 g의 홍화씨 를 첨가하여 만든 한약재 혼합추출물 투여 했을 때 5.
후속연구
- 본 실험에서 있어서 혈장과 간 조직 에서 당뇨 유도로 증가된 중성 지방은 홍화씨와 한약재 혼합추출물의 투여로 저하시 켰으나 콜레 스테롤 함량에는 별다른 영향을 미치지 못한 것으로 나타났다. 이러한 결과는 홍화씨에는 중성지방의 저하를 유도하는 기능성 성분들이 존재할 것으로 생각되며 이것은 향후에 보다 자세한 연구들이 수행되어야 하겠다.
- 이상의 본 실 험결과는 당뇨에 의한 혈당, 지질과산화물 그리고 중성지방 증가는 홍화씨 와 한약재 혼합추출물의 투여로 다소 완화되었다. 이러한 결과를 바탕으로 체내 혈당조절에 의한 당뇨병 의 예방 및 치유효과가 있는 홍화씨와 같은 천연물질의 기능 성 성 분에 대하여 향후에 보다 심층 있는 연구를 통하여 건 강 기능성 식품 소재로 활용하는 것이 매우 중요할 것으로 여겨진다.
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