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문제 정의
- 그리고, 골아세포에 영향을 미치는 생약성분의 추출방법을 규명하고, 이렇게 얻어진 천연추출물 이용에 의한 골분화 유도가 더 의미 있다고 할 수 있다. 따라서, 본 연구의 목적은 홍화와 홍화씨 추출물의 골분화에 영향을 주는 시기와 추출법에 따른 골분화 관련 유전자들의 발현 알아보기 위함이다.
- 단순 식품으로서의 연구뿐 아니라, 보다 자세한 홍화의 세포내 신호전달 작용기전에 대한 연구가 진행되어야 할 것이다. 이에 홍화와 홍화씨의 물과 에탄올 추출물이 마우스 조골세포인 MC3T3E1 세포의 골분화에 미치는 영향을 알아보기로 하였다. 홍화씨 추출물은 추출 방법에 무관하게 100 ng/ml 이상의 농도에서 세포독성을 나타낸 반면, 홍화추출물의 경우 200 ng/mL 농도까지 에서는 세포독성을 나타내지 않았다.
제안 방법
- MC3T3E1 세포는 ATCC(ATCC® CRL-2593TM, subclone 4)에서 분양 받았다. MC3T3E1 세포는 기본 배양액(10% 우태 혈청, 1% antibiotic-antimycotic 용액이 첨가된 Dulbecco’s modified eagle’s medium-high glucose(DMEM-HG))으로 2일에 한 번씩 갈아주며 배양하였다. 1차 배양된 MC3T3E1세포를 2×105 cells/well로 6 well 배양 용기에 첨가하여 12시간 이상 안정화 시킨 후, 기본 배양액에 100 nM dexamethasone, 10 mM β-glycerophosphate, 그리고 50 ug/ml ascorbic acid 가 함유된 골분화 유도액을 첨가하여 14일간 분화 유도하였다.
- 추출물질과 추출방법에 따른 골분화 초기에 미치는 영향을 알아보기 위한 실험으로, 각각의 추출물을 대조군과 함께 5일간 골분화 유도 한 뒤, ALP 활성을 측정하였다. 그 결과, 홍화 추출물의 경우 물과 에탄올 추출물을 처리한 두 그룹의 ALP 염색 및 활성이 대조군과 홍화씨 처리군에 비하여 각각 유의하게 높았으며, 홍화씨 에탄올 추출물의 경우 대조군에 비해 ALP 염색 및 활성이 유의하게 높았으나, 홍화 처리군에 비해 미미하였다(Fig.
- 골분화 유도된 MC3T3E1 세포로부터 RNeasy Mini Kit(QIAGENE, Hilden, Germany)를 사용하여 전체 RNA를 추출하였고, 역전사 중합효소 kit인 ominiscript RT Kit(QIAGENE)를 이용하여 37 ℃에서 90 분, 95 ℃에서 5분 조건으로 cDNA를 합성하였다. 합성된 cDNA를 주형으로 사용하여 2x qPCRBIO SyGreen Mix Hi-Rox(PCR Biosystems, London, UK)를 이용한 real-time PCR을 수행하였고, 유전자 발현양은 house keeping 유전자인 GAPDH에 대비한 CT값을 계산하여 산출하였다. Real time PCR에 사용된 골분화 관련 유전자의 primer 염기서열은 다음과 같다.
대상 데이터
- MC3T3E1 세포는 ATCC(ATCC® CRL-2593TM, subclone 4)에서 분양 받았다. MC3T3E1 세포는 기본 배양액(10% 우태 혈청, 1% antibiotic-antimycotic 용액이 첨가된 Dulbecco’s modified eagle’s medium-high glucose(DMEM-HG))으로 2일에 한 번씩 갈아주며 배양하였다.
- 홍화와 홍화씨는 세명대학교 부속 제천한방병원에서 구입했다. 홍화와 홍화씨 물 추출물은 95 ℃에서 150분간 물과 함께 끓인 뒤, Whatman 종이로 걸렀다.
데이터처리
- 각 군 간의 유의성 평가는 ANOVA & post-hot 분석을 이용하였다.
이론/모형
- ALP 염색은 fast violet B salt kit(Sigma Aldrich)로 30분간 반응시켰고, 다시 멸균수로 두 차례 씻어 주었다. ALP 활성은 colorimetric assay 법으로 실시하였고, 5일간 분화 유도한 세포를 차가운 PBS로 두 차례 씻어주고, 0.5 ml 50 mM Tris–HCl(pH 7.6)로 샘플링 하였다. 세포를 초음파 파쇄한 후, 12000 rpm으로 원심분리하였다.
- 세포에 대한 추출물의 독성은 세포에 추출물을 다양한 농도로 처리 하여 48시간 동안 키우고, 세포의 생존력을 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide(MTT) reduction assay 로 측정하였다. 세포는 96 well plate에 1×104 cells/well 농도로 분주 후 24시간 동안 키운 후, 홍화와 홍화씨 추출물을 각각 다양한 농도로 첨가하거나 추출물이 없는 세포에 0.
- 홍화와 홍화씨 추출물에 의해 증가된 골분화능을 토대로, 각각의 추출물에 의한 골분화 관련 유전자들의 mRNA 발현변화를 알아보기 위해, real time PCR을 실시하였다. 그 결과, 앞선 ALP 활성 결과와 일치하게, 홍화 물 추출물에 의한 ALP 발현이 가장 높게 나타났으며(Fig.
성능/효과
- 추출물질과 추출방법에 따른 골분화 초기에 미치는 영향을 알아보기 위한 실험으로, 각각의 추출물을 대조군과 함께 5일간 골분화 유도 한 뒤, ALP 활성을 측정하였다. 그 결과, 홍화 추출물의 경우 물과 에탄올 추출물을 처리한 두 그룹의 ALP 염색 및 활성이 대조군과 홍화씨 처리군에 비하여 각각 유의하게 높았으며, 홍화씨 에탄올 추출물의 경우 대조군에 비해 ALP 염색 및 활성이 유의하게 높았으나, 홍화 처리군에 비해 미미하였다(Fig. 2A, 2B).
- 각각의 추출물이 골분화 후기에 미치는 영향을 알아보기 위해 추출물 처리와 함께 골분화 유도 14일 후, alizarin red S 염색을 시행하였다. 그 결과, 홍화와 홍화씨 추출물 모두 MC3T3E1 세포의 골석회화를 증가시켰으며, 특히, 홍화 에탄올 추출물이 골석회화를 가장 현저히 증가시켰고, 홍화씨 처리군의 경우, 대조군에 비해 석회화가 증가되었지만, 홍화 추출물에 비해 그 영향이 다소 적음을 확인하였다(Fig. 3A).
- 이 결과는 홍화가 홍화씨 보다 건강식품이나 약제로 사용되기 좋은 가능성을 제시한다. 또한, 조골세포의 골분화력을 살펴 본 실험결과, 홍화와 홍화씨 물 추출물과 에탄올 추출물 모두에서 대조군에 비해 높은 골 분화능을 확인 하였고, 홍화씨 보다 홍화 추출물이 추출법에 무관하게 높은 골분화력을 보였다. 특히, 홍화씨 에탄올 추출물의 경우, 골분화 초기에 관여하는 ALP의 발현에는 홍화의 영향에 미치지 못하였으나, 석회화 관련 유전자인 Ocn발현에는 가장 효능을 나타내었고, 반면 홍화 물 추출물 처리한 군에서, 골분화 관련 모든 유전자들의 발현이 가장 증가하였음을 관찰하였다.
- 이러한 결과를 검증하기 위해 각 추출물의 성분 비교분석을 통한 정확한 핵심 요소를 밝히는 연구가 진행될 필요가 있으며, 골다공증과 밀접한 골분화와 지방분화의 균형에서 홍화와 홍화씨 추출물이 미치는 영향에 대해 연구가 필요할 것으로 사료된다. 본 연구는 마우스 조골세포인 MC3T3E1 세포의 골 분화 과정 중 홍화와 홍화씨 추출물이 미치는 시기가 다름을 확인하였고, 홍화 추출물의 영향이 홍화씨에 비해 유의하게 우수함을 확인하였다. 이러한 결과는 한의학에서 골관련 질환 처방의 홍화와 홍화씨 추출물 적용에 있어서 기초적인 자료로 제공 될 수 있을 것이다.
- 홍화씨 추출물은 추출 방법에 무관하게 100 ng/ml 이상의 농도에서 세포독성을 나타낸 반면, 홍화추출물의 경우 200 ng/mL 농도까지 에서는 세포독성을 나타내지 않았다. 이 결과는 홍화가 홍화씨 보다 건강식품이나 약제로 사용되기 좋은 가능성을 제시한다. 또한, 조골세포의 골분화력을 살펴 본 실험결과, 홍화와 홍화씨 물 추출물과 에탄올 추출물 모두에서 대조군에 비해 높은 골 분화능을 확인 하였고, 홍화씨 보다 홍화 추출물이 추출법에 무관하게 높은 골분화력을 보였다.
- 특히, 홍화씨 에탄올 추출물의 경우, 골분화 초기에 관여하는 ALP의 발현에는 홍화의 영향에 미치지 못하였으나, 석회화 관련 유전자인 Ocn발현에는 가장 효능을 나타내었고, 반면 홍화 물 추출물 처리한 군에서, 골분화 관련 모든 유전자들의 발현이 가장 증가하였음을 관찰하였다. 이러한 결론들을 토대로 홍화 물 추출물은 골분화 초기부터 말기에 이르기까지 지속적인 영향을 주는 것으로 사료되고, 홍화씨 에탄올 추출물의 경우, 분화 초기보다는 후기에 영향을 미치는 것으로 사료된다.
- 또한, 조골세포의 골분화력을 살펴 본 실험결과, 홍화와 홍화씨 물 추출물과 에탄올 추출물 모두에서 대조군에 비해 높은 골 분화능을 확인 하였고, 홍화씨 보다 홍화 추출물이 추출법에 무관하게 높은 골분화력을 보였다. 특히, 홍화씨 에탄올 추출물의 경우, 골분화 초기에 관여하는 ALP의 발현에는 홍화의 영향에 미치지 못하였으나, 석회화 관련 유전자인 Ocn발현에는 가장 효능을 나타내었고, 반면 홍화 물 추출물 처리한 군에서, 골분화 관련 모든 유전자들의 발현이 가장 증가하였음을 관찰하였다. 이러한 결론들을 토대로 홍화 물 추출물은 골분화 초기부터 말기에 이르기까지 지속적인 영향을 주는 것으로 사료되고, 홍화씨 에탄올 추출물의 경우, 분화 초기보다는 후기에 영향을 미치는 것으로 사료된다.
후속연구
- 따라서 홍화 추출물을 골분화 관련 특히, 한의학계 영역에서의 응용 및 신약개발에 적용시키는 연구는 지극히 중요하고 필요하다고 할 수 있다. 단순 식품으로서의 연구뿐 아니라, 보다 자세한 홍화의 세포내 신호전달 작용기전에 대한 연구가 진행되어야 할 것이다. 이에 홍화와 홍화씨의 물과 에탄올 추출물이 마우스 조골세포인 MC3T3E1 세포의 골분화에 미치는 영향을 알아보기로 하였다.
- 하지만, 아직 한의학계에는 이에 대한 연구나 개발이 부족한 실정이고, 특히, 홍화를 이용한 여러 분야의 연구는 극히 미흡한 실정이다26. 따라서 홍화 추출물을 골분화 관련 특히, 한의학계 영역에서의 응용 및 신약개발에 적용시키는 연구는 지극히 중요하고 필요하다고 할 수 있다. 단순 식품으로서의 연구뿐 아니라, 보다 자세한 홍화의 세포내 신호전달 작용기전에 대한 연구가 진행되어야 할 것이다.
- 하지만 비스포스포네이트의 경우 사용상의 번거로움과 다소 낮은 치료효과 및 부작용의 사례가 나타났고21, 또한 에스트로겐 처방은 골량 유지에는 효과적이나 60세 이상의 고령층에서는 골량 감소 억제효과가 폐경 초기에 비하여 낮으며, 최소 5년 이상의 장기 치료를 요하고 있으며, 불규칙한 자궁 출혈, 유방암, 자궁내막암 및 고혈압 발생 빈도 증가 등의 합병증에 대한 위험이 있는 것으로 보고되었다17,22. 때문에 골다공증과 같은 골대사 질환의 예방과 치료에 관련된 약물들을 개발하려고 노력하고 있다. 따라서 현재 골다공증의 예방과 치료는 골형성 증가에 많은 연구가 집중되고 있으며, 최근 한의학에서 사용되던 몇몇 생약제재에 대한 효능 및 효과를 근거로 골조직 재생능력에 미치는 영향 등에 대한 과학적인 접근이 시도되고 있다23,24.
- 본 연구는 마우스 조골세포인 MC3T3E1 세포의 골 분화 과정 중 홍화와 홍화씨 추출물이 미치는 시기가 다름을 확인하였고, 홍화 추출물의 영향이 홍화씨에 비해 유의하게 우수함을 확인하였다. 이러한 결과는 한의학에서 골관련 질환 처방의 홍화와 홍화씨 추출물 적용에 있어서 기초적인 자료로 제공 될 수 있을 것이다.
- 이러한 결과를 검증하기 위해 각 추출물의 성분 비교분석을 통한 정확한 핵심 요소를 밝히는 연구가 진행될 필요가 있으며, 골다공증과 밀접한 골분화와 지방분화의 균형에서 홍화와 홍화씨 추출물이 미치는 영향에 대해 연구가 필요할 것으로 사료된다. 본 연구는 마우스 조골세포인 MC3T3E1 세포의 골 분화 과정 중 홍화와 홍화씨 추출물이 미치는 시기가 다름을 확인하였고, 홍화 추출물의 영향이 홍화씨에 비해 유의하게 우수함을 확인하였다.
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