3T6 세포주 및 연골 초대배양세포의 Collagen 합성에 미치는 비타민 C의 영향 Effect of L-Ascorbic Acid on Collagen Synthesis in 3T6 Fibroblasts and Primary Cultured Cells of Chondrocytes원문보기
본 연구에서는 비타민 C의 배양세포 증식을 촉진하는 기능을 세포 간 결합조직의 주성분인 콜라겐 생합성에 초점을 맞추어 3T6 세포주 및 흰쥐에서 분리한 초대 연골세포를 이용하여, 세포 및 세포 외액 중의 콜라겐 함량의 분석과 콜라겐 생합성에 미치는 비타민 C의 영향을 각 농도별로 분석하여 콜라겐 생합성에 필요한 비타민 C의 적합한 첨가 농도를 검토하였다. 비타민 C를 1.0 mM 농도가 되도록 첨가하여 3T6 섬유아세포 및 초대연골 세포를 배양하였을때 양 세포 모두 콜라겐 양은 비타민 C를 첨가한 세포가 높은 수치를 나타내어 비타민 C에 의한 콜라겐 합성의 촉진효과가 현저하였으며 일수의 증가에 따라 그 합성량도 증가하였다. 비타민 C 무첨가의 경우 세포층의 콜라겐 합성량을 3T6 섬유아세포와 연골세포를 비교하였을 때 3T6 섬유아세포의 경우 배양일수의 경과와 더불어 콜라겐 양이 증가하였으나 연골세포의 경우 1일째부터 21일째까지 콜라겐양은 거의 변화하지 않아, 본 실험에 사용한 연골세포는 초대 배양세포로서 세포외로부터 비타민 C의 공급이 되지 않을 경우콜라겐 합성은 일어나지 않는 것으로 사료된다. 따라서 배양세포의 콜라겐 합성에 미치는 비타민 C의 영향을 검토하기 위하여 초대연골세포를 이용하여 비타민 C의 농도를 변화시켜 가면서 콜라겐 합성량을 측정하였다. 5 mM, 7 mM, 10 mM의 고농도의 비타민 C를 첨가한 경우 저 농도의 비타민 C 첨가 경우보다 plate 내의 총 콜라겐 함량은 적었다. 그러나 DNA 양에 대한콜라겐 함량을 비교하였을 때 5mM 이상의 비타민 C 첨가에서는 콜라겐 합성 증가량이 조금 낮은 경향을 보였으나, $0.1\~2mM$을 첨가하였을 때의 콜라겐 양과 최종적으로는 거의 비슷한 수치를 나타내었다. 0.5 mM 이상의 비타민 C 첨가는 콜라겐 합성을 저해한다는 기존의 보고와는 달리 본 연구에서는 세포독성을 억제할 목적으로 배지 중에 catalase 첨가하였으며, 그 결과 $0.1\~10mM$의 비타민 C 농도범위에서는 콜라겐 합성량에 차이가 크게 없는 것으로 나타나, $0.1\~10mM$의 비타민 C 농도로는 catalase를 첨가한 배지를 사용할 경우 세포내의 콜라겐 양에 대한 비타민 C 첨가농도별 차이는 크게 없는 것으로 추측된다.
본 연구에서는 비타민 C의 배양세포 증식을 촉진하는 기능을 세포 간 결합조직의 주성분인 콜라겐 생합성에 초점을 맞추어 3T6 세포주 및 흰쥐에서 분리한 초대 연골세포를 이용하여, 세포 및 세포 외액 중의 콜라겐 함량의 분석과 콜라겐 생합성에 미치는 비타민 C의 영향을 각 농도별로 분석하여 콜라겐 생합성에 필요한 비타민 C의 적합한 첨가 농도를 검토하였다. 비타민 C를 1.0 mM 농도가 되도록 첨가하여 3T6 섬유아세포 및 초대연골 세포를 배양하였을때 양 세포 모두 콜라겐 양은 비타민 C를 첨가한 세포가 높은 수치를 나타내어 비타민 C에 의한 콜라겐 합성의 촉진효과가 현저하였으며 일수의 증가에 따라 그 합성량도 증가하였다. 비타민 C 무첨가의 경우 세포층의 콜라겐 합성량을 3T6 섬유아세포와 연골세포를 비교하였을 때 3T6 섬유아세포의 경우 배양일수의 경과와 더불어 콜라겐 양이 증가하였으나 연골세포의 경우 1일째부터 21일째까지 콜라겐양은 거의 변화하지 않아, 본 실험에 사용한 연골세포는 초대 배양세포로서 세포외로부터 비타민 C의 공급이 되지 않을 경우콜라겐 합성은 일어나지 않는 것으로 사료된다. 따라서 배양세포의 콜라겐 합성에 미치는 비타민 C의 영향을 검토하기 위하여 초대연골세포를 이용하여 비타민 C의 농도를 변화시켜 가면서 콜라겐 합성량을 측정하였다. 5 mM, 7 mM, 10 mM의 고농도의 비타민 C를 첨가한 경우 저 농도의 비타민 C 첨가 경우보다 plate 내의 총 콜라겐 함량은 적었다. 그러나 DNA 양에 대한콜라겐 함량을 비교하였을 때 5mM 이상의 비타민 C 첨가에서는 콜라겐 합성 증가량이 조금 낮은 경향을 보였으나, $0.1\~2mM$을 첨가하였을 때의 콜라겐 양과 최종적으로는 거의 비슷한 수치를 나타내었다. 0.5 mM 이상의 비타민 C 첨가는 콜라겐 합성을 저해한다는 기존의 보고와는 달리 본 연구에서는 세포독성을 억제할 목적으로 배지 중에 catalase 첨가하였으며, 그 결과 $0.1\~10mM$의 비타민 C 농도범위에서는 콜라겐 합성량에 차이가 크게 없는 것으로 나타나, $0.1\~10mM$의 비타민 C 농도로는 catalase를 첨가한 배지를 사용할 경우 세포내의 콜라겐 양에 대한 비타민 C 첨가농도별 차이는 크게 없는 것으로 추측된다.
L-Ascorbic acid (AsA) is an essential nutrient for prevention of scurvy in humans, primates and guinea pigs that lack $L-gulono-\gamma-lactone$ oxidase which is required for the final step of AsA biosynthesis. AsA participates in various hydroxylation reactions involved in the biosynthesi...
L-Ascorbic acid (AsA) is an essential nutrient for prevention of scurvy in humans, primates and guinea pigs that lack $L-gulono-\gamma-lactone$ oxidase which is required for the final step of AsA biosynthesis. AsA participates in various hydroxylation reactions involved in the biosynthesis of collagen. The purpose of this study is to clarify the role of AsA on collagen synthesis in 3T6 fibroblasts and primary cultured cells of chondrocytes. Cells were cultured in medium supplemented with catalase and AsA at various concentration. Supplement of AsA induced collagen synthesis in 3T6 fibroblasts and primary cultured cells of chondrocytes. The most remarkable induction of collagen synthesis by AsA was found in primary cultured chondrocytes. The content of collagen representing the amounts of extracellular matrix significantly increased in the cells of which growth was stimulated by AsA, while it decreased with increasing passage numbers of subculture in cells. It showed that the content of collagen decreased in the medium which contained AsA at the concentration higher than 5.0 mM. However, the contents of collagen to DNA were not different among various AsA concentrations. Supplementing with AsA resulted in enhancement of collagen formation and extracellular matrix. Therefore, there might be a Positive correlation between the activity of catalase and the AsA concentration. Moreover, it can be assumed that AsA stimulates the collagen synthesis by optimizing the cell-culture environment.
L-Ascorbic acid (AsA) is an essential nutrient for prevention of scurvy in humans, primates and guinea pigs that lack $L-gulono-\gamma-lactone$ oxidase which is required for the final step of AsA biosynthesis. AsA participates in various hydroxylation reactions involved in the biosynthesis of collagen. The purpose of this study is to clarify the role of AsA on collagen synthesis in 3T6 fibroblasts and primary cultured cells of chondrocytes. Cells were cultured in medium supplemented with catalase and AsA at various concentration. Supplement of AsA induced collagen synthesis in 3T6 fibroblasts and primary cultured cells of chondrocytes. The most remarkable induction of collagen synthesis by AsA was found in primary cultured chondrocytes. The content of collagen representing the amounts of extracellular matrix significantly increased in the cells of which growth was stimulated by AsA, while it decreased with increasing passage numbers of subculture in cells. It showed that the content of collagen decreased in the medium which contained AsA at the concentration higher than 5.0 mM. However, the contents of collagen to DNA were not different among various AsA concentrations. Supplementing with AsA resulted in enhancement of collagen formation and extracellular matrix. Therefore, there might be a Positive correlation between the activity of catalase and the AsA concentration. Moreover, it can be assumed that AsA stimulates the collagen synthesis by optimizing the cell-culture environment.
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문제 정의
1-2 mM을 첨가하였을 때의 콜라겐 양과 최종적으로는 거의 비슷한 수치를 나타내었다. 0.5 mM 이상의 비 타민 C 첨 가는 콜라겐 합성을 저해한다는 기존의 보고와는 달리 본 연구에서는 세포독성을 억제할 목적으로 배지 중에 catalase 첨 가하였으며 , 그 결과 0.1 ~ 10 mM의 비 타민 C 농도범위 에서는 콜라겐 합성량에 차이가 크게 없는 것으로 나타나, 0.1 — 10 mM의 비 타민 C 농도로는 catalase를 첨가한 배지를 사용할 경우 세포내의 콜라겐 양에 대한 비타민 C 첨가농도별 차이는 크게 없는 것으로 추측된다.
고농도의 비 타민 C는 세포독성을 발현하므로 콜라겐을 연구하는 경우 세포실험에 적합하지 않기 때문이다. 그러나 전보(22)에서 비타민 C의 세포독성은 catalase를 사 용하는 것에 의해 제거될 수 있음을 확인하였으므로 생체 내를 반영한 환경에서 배양하기 위해 catalase를 첨가하여 세포독성을 억제해야 할 것으로 사료되어, 본 실험에서는 catalase를 첨가하여 세포독성을 억제한 경우 콜라겐 합성에 미치는 비타민 C의 영향을 검토하였다. 그 결과 배양 7일째 이후에는 비타민 C의 농도와 관계없이 무 첨가보다 높은 콜라겐 합성량을 나타냈다(Fig.
연골세포는 연골형 proteoglycan 및 콜라겐 생합성 등 분화기능 발현 뿐만 아니라 DNA 합성, 세포증식, 성장인자 및 호르몬 등의 작용을 연구하기 위한 재료로 적합하고 세포 외 결합조직의 주성분 인 콜라겐 합성에는 비타민 C가 필수이므로 연골세포는 비타민 C와 세포증식과의 관계를 연구하는 데 적합한 것으로 예상된다(14-20). 따라서 본 연구에서는 비타민 C의 배양세포 증식을 촉진하는 기능을 세포 간 결합조직의 주성분인 콜라겐 생합성에 초점을 맞추어, 세포로는 계대배양이 가능하며 콜라겐 합성능을 가지는 세포주인 3T6섬유아세포(21) 와 초대배양세포로서 콜라겐 합성이 가능한 흰쥐 연골세포 를.이용하였다.
콜라겐은 세포 간 결합조직의 주성분이며, 세포 간 결합조직은 세포접착, 증식, 분화 및 분화한 세포의 기능과 형태유 지를 위해 중요한 역할을 하고 있으므로 중요한 생체 성분으 로 주목받고 있다. 본 실험에서는 비타민 C의 세포증식촉진 효과를 밝히려 는 수단으로 세포 간 결합조직에 착목하여 콜라겐 합성량에 대하여 조사하였다.
제안 방법
콜라겐 합성에 미치는 세포종의 차이를 알아내기 위하여 3T6 섬유아세포는 배양 후 2, 4, 6, 8일째의 세포를 시료로 하였고, 흰쥐에서 분리한 연골세포는 AsA-Na 및 catalase를 첨가하지 않고 DMEM-5만으로 4일간 배양한 후 AsA-Na 첨가를 개시하였다. AsA 첨가 개시 후 1, 3, 7, 11, 21일 째의 세포를 시료로 하였다. 또한 콜라겐 합성에 미치는 비타민 C의 영향을 검토하고자 1회 계대 배양한 연골세포에 각 농도의 AsA-Na을 첨가하여 실험하였다.
또한 콜라겐 합성에 미치는 비타민 C의 영향을 검토하고자 1회 계대 배양한 연골세포에 각 농도의 AsA-Na을 첨가하여 실험하였다. AsA-Na 은 0, 0.1, 1, 2, 5, 7 및 10 mM 농도로 첨가하였고, 배양 2, 4, 7, 9, 12, 15, 21일째의 세포를 시료로 하였다.
방법 : PBS(-)로 세정 후 C액을 A액으로 200배 희석한 용액을 가하여 37°C에서 1시간 가온한 후 세포를 파쇄하여 B액을 A액 으로 10, 000배로 희석 하여 첨가하고 잘 혼합하여 여기 파장 350 nm, 형광파장 452 nm에서 형광광도를 측정 하 였다. 검량선은 D액을 A액으로 희석하여 표준 송아지흉선 DNA가 40, 20, 10, 5 Hg/mL 되도록 하여 작성하였다.
비 타민 C 무첨가의 경우 세포층의 콜라겐 합성량을 3T6 섬유아세포와 연골세포를 비교하였을 때 3T6 섬유아세포의 경우 배양일수의 경과와 더불어 콜라겐 양이 증가하였으나 연골세포의 경우 1일째부터 21일째까지 콜라겐양은 거의 변 화하지 않아, 본 실험에 사용한 연골세포는 초대 배양세포로서 세포외로부터 비타민 C의 공급이 되지 않을 경우 콜라겐 합성은 일어나지 않는 것으로 사료된다. 따라서 배양세포의 콜라겐 합성에 미치는 비타민 C의 영향을 검토하기 위하여 초대연골세포를 이용하여 비타민 C의 농도를 변화시켜 가면서 콜라겐 합성량을 측정 하였다. 5 mM, 7 mM, 10 mM의 고농도의 비타민 C를 첨가한 경우 저농도의 비타민 C 첨가 경우보다 plate 내의 총 콜라겐 함량은 적었다.
본 실험에 사용한 연골세포는 초대배양세포로서 세포외로 부터 비타민 C의 공급이 되지 않을 경우 콜라겐 합성은 일어 나지 않는 것으로 사료된다. 따라서 배양제포의 콜라겐 합성에 미치는 비타민 C의 영향을 검토하기 위하여 초대연골세 포를 이용하여 비타민 C의 농도를 변화시켜 가면서 콜라겐 합성량을 측정하였다.
이용하였다. 또한 콜라겐 생합성에 미치는 비타민 C의 영향을 검토하기 위하여 세포 및 세포 외액 중의 콜라겐 함량의 분석과 콜라겐 생합성에 미치는 비타민 C의 영향을 각 농도별로 분석 하여 콜라겐 생합성에 필요한 비타민 C의 적합한 첨가 농도를 검토하였다.
AsA 첨가 개시 후 1, 3, 7, 11, 21일 째의 세포를 시료로 하였다. 또한 콜라겐 합성에 미치는 비타민 C의 영향을 검토하고자 1회 계대 배양한 연골세포에 각 농도의 AsA-Na을 첨가하여 실험하였다. AsA-Na 은 0, 0.
방법 : PBS(-)로 세정 후 C액을 A액으로 200배 희석한 용액을 가하여 37°C에서 1시간 가온한 후 세포를 파쇄하여 B액을 A액 으로 10, 000배로 희석 하여 첨가하고 잘 혼합하여 여기 파장 350 nm, 형광파장 452 nm에서 형광광도를 측정 하 였다. 검량선은 D액을 A액으로 희석하여 표준 송아지흉선 DNA가 40, 20, 10, 5 Hg/mL 되도록 하여 작성하였다.
본 실험에 사용한 3T6 mouse 섬유아세포주는 ATCC (American Type Culture Collection)로부터 구입 하였고, 흰쥐에서 분리한 초대연골세포를 060mm dish에 5x 104 cells/ dish 되도록 접종하였다. 배지는 FBS를 5% 첨가한 DMEM (DMEM-5)를 사용하였고, sodium ascorbic acid(AsA-Na) 는 0.5 mM 농도로, catalase는 750 U/mL 활성이 되도록 조제하였다. 콜라겐 합성에 미치는 세포종의 차이를 알아내기 위하여 3T6 섬유아세포는 배양 후 2, 4, 6, 8일째의 세포를 시료로 하였고, 흰쥐에서 분리한 연골세포는 AsA-Na 및 catalase를 첨가하지 않고 DMEM-5만으로 4일간 배양한 후 AsA-Na 첨가를 개시하였다.
3, 4). 본 실험에 사용한 DMEM 배지에는 비타민 C가 함유되어 있지 않으며, 혈청중의 비 타민 C 함량을 측정 하기 위하여 HPLC를 사용하여 분석하였으나 검출되지 않았다. 비타민 C를 첨가하지 않았음에도 불구하고 3T6섬유아세포에서 콜라겐 합성이 이루어 졌다는 것은 3T6세포의 비타민 C에 대한 감수성이 매우 높은 까닭에 혈청 중에 비 타민 C가 검출되 지 않을 정도의 미량 으로 존재하여도 콜라겐 합성이 이루어진 것으로 추측된다.
본 연구에서는 비타민 C의 배양세포 증식을 촉진하는 기능을 세포 간 결합조직의 주성분인 콜라겐 생합성에 초점을 맞추어 3T6 세포주 및 흰쥐에서 분리한 초대 연골세포를 이용하여, 세포 및 세포 외액 중의 콜라겐 함량의 분석과 콜라겐 생합성에 미치는 비타민 C의 영향을 각 농도별로 분석하여 콜라겐 생합성에 필요한 비타민 C의 적합한 첨가 농도를 검토하였다. 비 타민 C를 1.
5 mM 농도로, catalase는 750 U/mL 활성이 되도록 조제하였다. 콜라겐 합성에 미치는 세포종의 차이를 알아내기 위하여 3T6 섬유아세포는 배양 후 2, 4, 6, 8일째의 세포를 시료로 하였고, 흰쥐에서 분리한 연골세포는 AsA-Na 및 catalase를 첨가하지 않고 DMEM-5만으로 4일간 배양한 후 AsA-Na 첨가를 개시하였다. AsA 첨가 개시 후 1, 3, 7, 11, 21일 째의 세포를 시료로 하였다.
대상 데이터
3주령의 Sprague-Dawley계(60~70 g 전후) 흰쥐에 마취 약(sodium pentobarbital, 일본제 약)을 복강 내 투여하여 마취하고 염화 benzalcornium액으로 소독하였다. 흉부로부터 늑골을 적출한 후 늑 연골을 하나씩 분리하고 주위의 연 조 직을 제거한 후 성장연골만을 잘게 잘랐다.
본 실험에 사용한 3T6 mouse 섬유아세포주는 ATCC (American Type Culture Collection)로부터 구입 하였고, 흰쥐에서 분리한 초대연골세포를 060mm dish에 5x 104 cells/ dish 되도록 접종하였다. 배지는 FBS를 5% 첨가한 DMEM (DMEM-5)를 사용하였고, sodium ascorbic acid(AsA-Na) 는 0.
비타민 C를 첨가하지 않았음에도 불구하고 3T6섬유아세포에서 콜라겐 합성이 이루어 졌다는 것은 3T6세포의 비타민 C에 대한 감수성이 매우 높은 까닭에 혈청 중에 비 타민 C가 검출되 지 않을 정도의 미량 으로 존재하여도 콜라겐 합성이 이루어진 것으로 추측된다. 본 실험에 사용한 연골세포는 초대배양세포로서 세포외로 부터 비타민 C의 공급이 되지 않을 경우 콜라겐 합성은 일어 나지 않는 것으로 사료된다. 따라서 배양제포의 콜라겐 합성에 미치는 비타민 C의 영향을 검토하기 위하여 초대연골세 포를 이용하여 비타민 C의 농도를 변화시켜 가면서 콜라겐 합성량을 측정하였다.
데이터처리
실험의 분석결과는 각각의 처리별로 평균치와 표준편차 (mean士SD)를 사용하여 표기하였으며, 유의성 검정에는 Student*s f-test를 이용하였다.
이론/모형
Hydroxyproline의 측정은 Woessner법 (21)을 이용하였고, 얻어진 hydroxyproline량으로부터 콜라겐량을 환산하였다. 시료용액 2 mL에 chloramine T 용액 1 mL 첨가하여 혼합하고 20분간 방치 후 과염소산용액 1 mL 가하여 혼합한 다음 G0°C에서 20분간 가온하여 560 nm에서 흡광도를 측정하였다.
성능/효과
3T6 섬유아세포 및 초대연골 세포의 배양일수를 X축으로 세포층에 형성한 콜라겐 양을 y축으로 하여 1 차식 에 적용하였을 때 비타민 C를 첨가하지 않은 연골세포를 제외하고 모두 r=0.95 이상의 상관계수가 나타나 콜라겐 양은 배양일 수에 비례하여 증가하는 것으로 나타났다(Table 1). 이러한 1차식의 기울기를 1일당 콜라겐 합성량으로 보았을 때 3T6 섬유아세포의 비타민 C 첨가군의 콜라겐 생성량(0.
1 ~2 mM을 첨 가 하였을 때의 콜라겐 양과 최종적으로는 거의 비슷한 수치를 나타내었다. 따라서 catalase를 첨가한 배지를 사용할 경우 세포내의 콜라겐 합성량에 대한 비타민 C 첨가 농도에 따른 차이는 크게 없는 것을 알 수 있었다.
034)의 약 5배였다. 또한 연골세포의 콜라겐 생성량(0.807)은 3T6 섬유아세포(0.171)의 약 5배로 연골세 포에서의 콜라겐 합성속도는 3T6 섬유아세포보다 빠른 것으로 나타났다. 이상의 실험 결과로부터 비타민 첨 가에 의 해 세포의 콜라겐 합성량은 증가하는 것으로 밝혀졌고, 3T6 섬유아세포와 초대연골세포를 비교하면 생성되는 콜라겐 양에서도 차이가 나는 것을 알 수 있었다.
본 연구에서는 비타민 C의 배양세포 증식을 촉진하는 기능을 세포 간 결합조직의 주성분인 콜라겐 생합성에 초점을 맞추어 3T6 세포주 및 흰쥐에서 분리한 초대 연골세포를 이용하여, 세포 및 세포 외액 중의 콜라겐 함량의 분석과 콜라겐 생합성에 미치는 비타민 C의 영향을 각 농도별로 분석하여 콜라겐 생합성에 필요한 비타민 C의 적합한 첨가 농도를 검토하였다. 비 타민 C를 1.0 mM 농도가 되도록 첨 가 하여 3T6 섬유아세포 및 초대연골 세포를 배양하였을 때 양 세포 모두 콜라겐 양은 비 타민 C를 첨가한 세포가 높은 수치를 나타내어 비 타민 C에 의한 콜라겐 합성의 촉진효과 가 현저 하였으며 일수의 증가에 따라 그 합성량도 증가하였다. 비 타민 C 무첨가의 경우 세포층의 콜라겐 합성량을 3T6 섬유아세포와 연골세포를 비교하였을 때 3T6 섬유아세포의 경우 배양일수의 경과와 더불어 콜라겐 양이 증가하였으나 연골세포의 경우 1일째부터 21일째까지 콜라겐양은 거의 변 화하지 않아, 본 실험에 사용한 연골세포는 초대 배양세포로서 세포외로부터 비타민 C의 공급이 되지 않을 경우 콜라겐 합성은 일어나지 않는 것으로 사료된다.
비타민 C를 1.0 mM 농도가 되도록 첨가하여 3T6 섬유아 세포 및 초대연골 세포를 배양하였을 때 두 세포 모두에서 콜라겐 양은 비타민 C를 첨가한 세포가 높은 수치를 나타내어 비타민 C에 의한 콜라겐 합성의 촉진효과가 현저하였으 며 일수의 증가에 따라 그 합성량도 증가하였다(Fig. 1, 2). 또한 3T6 섬유아세포는 배양 6~8일에 접촉 증식제어 현상이 일어나 8일째 이후 세포가 plate에서 박리되었으나, 연골 세포는 증식을 계속하는 것으로 나타났다.
171)의 약 5배로 연골세 포에서의 콜라겐 합성속도는 3T6 섬유아세포보다 빠른 것으로 나타났다. 이상의 실험 결과로부터 비타민 첨 가에 의 해 세포의 콜라겐 합성량은 증가하는 것으로 밝혀졌고, 3T6 섬유아세포와 초대연골세포를 비교하면 생성되는 콜라겐 양에서도 차이가 나는 것을 알 수 있었다.
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