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문제 정의
- 본 연구는 어린 연령의 소아에서 선천성 면역력의 중요한 인자인 MBL2 유전자의 다형성 및 일배 체형의 분포를 환자 대조군 연구를 통하여 분석함으로써, MBL2 유전자의 다형성이 소아 RSV 감염 증의 발생과 예후에 기여하는지를 밝히고자 하였다.
- 하지만, 연구마다 각기 방법과 대상 환자에 차이가 있고 특히, 질환의 중증도에 대한 정의가 통일되지 않아서 이러한 인자들이 RSV 감염증의 중증도에 미치는 영향이 아직 정확하게 검증되지 않았다. 본 연구에서는 바이러스 아형(A 또는 B 아형)과 유전형에 따른 RSV 감염증의 예후를 직접적으로 분석하지는 않았다. 그러나, 과거의 연구에서 9년의 유행기 동안(1990∼1999년) 분리된 바이러스 아형 및 유전형이 RSV 감염증의 예후와 직접적으로 연관되지 않았다26).
제안 방법
- . MBL2 유전 자의 다형성 중 본 연구에서는 mannose binding protein의 구조적인 결함 및 기능적인 변화를 야기하는 부위로 알려진 promoter -221X/Y 다형성과 exon 1의 구조 변이(대립유전자 O; B, C, 그리고 D)를 분석하였다21). Promoter -221X/Y 다형성은 MBL 발현의 조절 기능을 변화시키며, exon 1의 구조 변이 부위는 collagen domain의 정상적인 소중 합체(oligomer) 구조를 약화시킴으로써 혈청내 단백의 농도 저하, 옵소닌화의 저하, 고전 보체계 연쇄 반응 등의 기능적인 장애를 초래한다.
- MBL2 유전자의 다형성 중 promoter -221 X/Y 다형성과 exon 1에서 아미노산 서열의 변화를 초래하는 codon 52(대립유전자 D), 54(대립유전자 B), 그리고 57(대립유전자 C)의 3가지 코딩 변이를 분석하였다. 이 중 3개의 codon에서 모두 변이가 없는 경우를 대립 유전자 “A”로 표시하였으며, 후자의 3가지 코딩 부위의 다형성을 하나라도 소유한 경우를 모두 합하여 구조 변이(structural variants) “O”로 표시하였다8).
- 중합효소 연쇄반응(Polymerase Chain Reaction, PCR)에 사용한 시발체는 Table 1과 같다. PCR 반응은 gDNA를 10∼50 ng을 사용하였으며, 10X reaction buffer 1 µL, MgCl 2 2.0 mM, dNTP mix 0.2 mM, 전시발체와 역시발체 각각 20 pmol, AmpliTaq Gold DNA polymerase 2.5 units(Applied Biosystems, Inc, Foster City, CA, USA)를 혼합하여 PCR을 시행하였다. 증폭된 각 PCR 생산물은 1.
- 비인두 흡인물의 도말에서 RSV에 대한 단클론 항체를 이용한 면역형광 염색으로써 항원을 검출하거나, 비인두 흡인물을 HEp-2 단층세포에 접종하여 RSV의 배양을 시도하였다. RSV 감염 증은 면역형광 염색 양성 또는 배양 양성인 경우에 진단하였다.
- RSV 감염증의 중증도 및 위험 인자의 동반 여부를 확인하기 위하여 RSV 감염증이 확인된 예들의 의무 기록을 검토하여, 환자들의 연령, 임상 증상 및 입원 경과 등을 분석하였다. 입원의 기준은 청색증, 연령기준에 따른 빈호흡, 10초 이상의 무호흡, 그리고 경구섭취 감소가 있는 경우로 하였다.
- 대상 환자 99명의 비인두 흡인물은 바이러스 진단 이후 -70℃에 보관하였으며, 이를 해동하여 modified salt precipitation 방법을 이용하여 genomic DNA(gDNA)를 추출하였다(Gentra, Inc. Mineapolis, MN, USA)10). gDNA 추출 과정 중 충분한 양의 gDNA 침전물을 얻지 못한 경우는 glycogen을 사용하여 핵산의 양을 최대화하였다.
- 염기서열 반응은 BigDye™ Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction Kit(Applied Biosystems, Inc, Foster City, CA, USA)를 사용하여 dideoxy chain termination법으로 DNA Engine(MJ research, Waltham, MA, USA)에서 96℃ 2분 [94℃ 30초, 55℃ 30초, 60℃ 4분] cycle을 25회 시행하였다. 반응 후에 산물을 Sephadex column을 이용하여 정제한 후에 ABI 3100 automated sequencer(Applied Biosystems, Inc, Foster City, CA, USA)에서 전기영동한 후 자료는 Sequencing analysis v3.3(Applied Biosystems, Inc, Foster City, CA, USA)으로 분석하였다. 염기 서열의 변이 분석에는 Sequencher 4.
- 폐렴과 세기관지염의 임상적 진단하에 입원한 소아 중 응급실 치료 중 또는 입원 후 2일 이내에 환아의 비강에서 비인두 흡인물을 채취하여 4℃에 보관하였다. 비인두 흡인물의 도말에서 RSV에 대한 단클론 항체를 이용한 면역형광 염색으로써 항원을 검출하거나, 비인두 흡인물을 HEp-2 단층세포에 접종하여 RSV의 배양을 시도하였다. RSV 감염 증은 면역형광 염색 양성 또는 배양 양성인 경우에 진단하였다.
- 염기서열 반응은 BigDye™ Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction Kit(Applied Biosystems, Inc, Foster City, CA, USA)를 사용하여 dideoxy chain termination법으로 DNA Engine(MJ research, Waltham, MA, USA)에서 96℃ 2분 [94℃ 30초, 55℃ 30초, 60℃ 4분] cycle을 25회 시행하였다. 반응 후에 산물을 Sephadex column을 이용하여 정제한 후에 ABI 3100 automated sequencer(Applied Biosystems, Inc, Foster City, CA, USA)에서 전기영동한 후 자료는 Sequencing analysis v3.
- 일배체형을 분석하기 위하여 각 부위의 유전형 데이타를 일배체형 분석 프로그램인 PHASE v2.0 (http://www.stat.washington.edu/stephens/phase.html)을 이용하여 일배체형의 구조를 분석하였다11).
- 1 (Gene Codes Co, Ann Arbor, MI, USA)를 사용하였다. 정상 대조군 48명의 gDNA(96 염색체)를 무작 위로 선정하여 한국인에도 이러한 유전적 변이가 존재하는지 염기 서열 분석법으로 스크린한 후 정상대조군에 유전형 빈도가 5% 이상으로 흔한 다형 성인 경우에 후보 유전형으로 선택하여 분석하였다.
- gDNA 추출 과정 중 충분한 양의 gDNA 침전물을 얻지 못한 경우는 glycogen을 사용하여 핵산의 양을 최대화하였다. 정상 대조군은 EDTA 전혈을 채취하여 같은 방법으로 gDNA를 추출하였다.
- 5 units(Applied Biosystems, Inc, Foster City, CA, USA)를 혼합하여 PCR을 시행하였다. 증폭된 각 PCR 생산물은 1.5%의 agarose gel에서 전기영동하여 확인하였다. 증폭한 PCR 생산물 중 8 µL를 취하여 Exonuclease I과 Shrimp alkaline phosphatase를 이용하여 정제(37℃ 1시간, 72℃ 15분 반응)한 후 4℃에 보관하였다가 염기서열 분석에 사용하였다.
- 5%의 agarose gel에서 전기영동하여 확인하였다. 증폭한 PCR 생산물 중 8 µL를 취하여 Exonuclease I과 Shrimp alkaline phosphatase를 이용하여 정제(37℃ 1시간, 72℃ 15분 반응)한 후 4℃에 보관하였다가 염기서열 분석에 사용하였다.
대상 데이터
- 1993년부터 2000년까지 7년 동안 서울대학교 어린이병원 소아과에 발열, 기침, 및 천명 등의 호흡기 증상으로 내원하여 세기관지염 및 폐렴 등의 하기도 감염증으로 입원하였던 소아 중 미숙아, 기관 지폐 이형성, 선천성 심기형 등의 위험인자를 동반하지 않은 RSV 감염증 환아 99명을 대상으로 하였다. 하기도 감염증의 진단은 2명 이상의 의사가 진찰하여 천명이나 나음을 확실하게 청진하였거나, 하기도 증상을 가진 소아의 흉부 방사선 소견에서 침윤이나 과팽창의 소견이 확인된 경우로 하였다.
- 하기도 감염증의 진단은 2명 이상의 의사가 진찰하여 천명이나 나음을 확실하게 청진하였거나, 하기도 증상을 가진 소아의 흉부 방사선 소견에서 침윤이나 과팽창의 소견이 확인된 경우로 하였다. 대조군은 서울대학교병원 건강검진센터에서 진찰받은 성인 중 만성 또는 특이 기저 질환이 없는 건강한 성인 224명으로 하였다.
- 한국인에서 MBL2 유전자의 다형성 빈도를 스크린하기 위하여 정상 대조군 48명(96 염색체)을 무작위로 선정하여 분석하였다. MBL2 유전자의 exon 1은 codon 구조 변이 중 대립유전자 C와 D는 스크린군에서 발견되지 않아 정상 한국인에서의 대립유전자 C와 D의 빈도는 1% 이하일 것으로 추측되었다.
- 환자군은 총 99명으로 중앙 연령은 9.5개월로 생후 6일부터 49개월까지 분포하였다. 이 중 6개월 미만이 48명(49%), 6∼24개월 사이 39명(39%), 그리고 24개월 이상이 12명(12%)이었다.
데이터처리
- 환자군과 대조군간의 각 유전형과 일배체형의 빈도는 3×2 표를 이용한 Chi square test를 이용하여 비교하였으며, P값이 0.05 미만인 경우 두 군간의 빈도에 차이가 있는 것으로 해석하였다(GraphPad InStat V3.06(GraphPad Software, Inc. San Diego, CA, USA).
이론/모형
- 3(Applied Biosystems, Inc, Foster City, CA, USA)으로 분석하였다. 염기 서열의 변이 분석에는 Sequencher 4.1.1 (Gene Codes Co, Ann Arbor, MI, USA)를 사용하였다. 정상 대조군 48명의 gDNA(96 염색체)를 무작 위로 선정하여 한국인에도 이러한 유전적 변이가 존재하는지 염기 서열 분석법으로 스크린한 후 정상대조군에 유전형 빈도가 5% 이상으로 흔한 다형 성인 경우에 후보 유전형으로 선택하여 분석하였다.
성능/효과
- 한국인에서 MBL2 유전자의 다형성 빈도를 스크린하기 위하여 정상 대조군 48명(96 염색체)을 무작위로 선정하여 분석하였다. MBL2 유전자의 exon 1은 codon 구조 변이 중 대립유전자 C와 D는 스크린군에서 발견되지 않아 정상 한국인에서의 대립유전자 C와 D의 빈도는 1% 이하일 것으로 추측되었다. 반면, codon 54 다형성(대립유전자 B)의 빈도는 31%로 본 환자 대조군의 연구에 포함하였다.
- MBL2의 promoter와 exon 1의 다형성 부위를 대상으로 하여 일배체형 분석을 한 결과, AX, AY, BY 등 3가지 유형의 일배체가 존재하였다(신뢰도 ≥95%). 일배체형의 분포는 대조군 448개 염색체중 AX 54(12%), AY 297(66.
- 결론적으로, 본 연구는 MBL2 유전자의 다형성과 일배체형이 한국인 소아의 심한 RSV 감염증에 기여하는 예후 인자임을 증명하지 못하였지만, 본 연구에 포함된 환자의 수, 대조군의 적절성 등을 고려할 때, 이러한 결과가 MBL2와 RSV 감염증의 연관성이 전혀 없다고 결론 내리기는 아직 미흡하다. 따라서, 향후 전향적으로 수집한 더 많은 수의 환자군과 적절한 대조군을 통한 연구의 뒷받침이 있어야 할 것으로 생각된다.
- 심한 RSV 감염증 환자군 99명과 대조군 224명에서 MBL2 codon 54의 대립유전자 B의 빈도는 Table 3에 제시하였다. 대조군에서 유전형 AA 141 (63%), 이형접합 AB 69(31%), 그리고 유전형 BB 14(6%)로 나타났다. 환자군에서는 유전형 AA 60 (61%), 이형접합 AB 34(34%), 그리고 유전형 BB 5 (5%)로 나타났다.
- 본 연구는 1993년부터 2000년까지 심한 RSV 하기도 감염증으로 입원하였던 한국인 소아 99명을 대상으로 선천성 면역에 중요한 인자인 MBL2 유전자가 RSV 감염증에 기여하는지를 환자 대조군 연구를 시행한 결과, 한국인 소아에서는 MBL2 유전자의 다양성이 심한 RSV 감염증의 발병과 연관이 없는 것을 확인하였다.
- 심한 RSV 감염증으로 진단된 환아에서 동반된 증상은 경구섭취 저하 61명(62%), 빈호흡 68명(69%), 무호흡 5명(5%), 산소 보충 요법 52명(53%), 중환자실 입원 16명(16%), 인공환기요법 시행 12명 (12%) 등이었다. 산소 포화도는 총 52명에서 측정하였는데, 그 중 산소 포화도가 90% 이하로 감소한 경우가 18명(35%)이었다.
- MBL2 유전 형에 따른 기능적 변화에 따라 대립 유전자 O와 X를 MBL-불충분(insufficient) 군, 대립 유전자 A와 Y는 MBL-충분(sufficient) 군으로 구별한다21). 이들의 다형성은 각 인종별로 차이가 나는 것으로 알려져 있는데, 본 연구의 대상에서는 구조 변이 중 대립유전자 C와 D가 발견되지 않아서 한국인 중에는 이 두 가지 유전형이 없거나 아주 미미한 빈도로 존재함을 알 수 있었다.
- MBL2의 promoter와 exon 1의 다형성 부위를 대상으로 하여 일배체형 분석을 한 결과, AX, AY, BY 등 3가지 유형의 일배체가 존재하였다(신뢰도 ≥95%). 일배체형의 분포는 대조군 448개 염색체중 AX 54(12%), AY 297(66.3%), 그리고 BY 97 (21.7%)로 나타났다. 환자군 198개 염색체 중 AX 15(7.
- 7%)로 나타났다. 환자군 198개 염색체 중 AX 15(7.6%), AY 139(70.2%), 그리고 BY 44(22.2%)로 나타나, 두 군간에 통계적인 차이가 없었다(P=0.23) (Table 4).
- 대조군에서 유전형 AA 141 (63%), 이형접합 AB 69(31%), 그리고 유전형 BB 14(6%)로 나타났다. 환자군에서는 유전형 AA 60 (61%), 이형접합 AB 34(34%), 그리고 유전형 BB 5 (5%)로 나타났다. 두 군간의 exon 1의 대립유전자 B의 빈도에는 유의한 차이가 없었다(P=0.
후속연구
- 결론적으로, 본 연구는 MBL2 유전자의 다형성과 일배체형이 한국인 소아의 심한 RSV 감염증에 기여하는 예후 인자임을 증명하지 못하였지만, 본 연구에 포함된 환자의 수, 대조군의 적절성 등을 고려할 때, 이러한 결과가 MBL2와 RSV 감염증의 연관성이 전혀 없다고 결론 내리기는 아직 미흡하다. 따라서, 향후 전향적으로 수집한 더 많은 수의 환자군과 적절한 대조군을 통한 연구의 뒷받침이 있어야 할 것으로 생각된다.
- 이 연구에서 분석된 대부분의 바이러스가 본 연구의 대상 환자에서 분리되었으므로 바이러스 아형이나 유전형의 차이가 RSV 감염증의 예후와 연관되지 않다고 간접적으로 해석할 수 있을 것으로 생각된다. 반면에, 본 연구는 환자의 환경적인 요인과 바이러스 농도 정량을 분석하지 못한 제한점을 지니고 있다.
- 이 연구가 비교하고자 하는 유전자형 이외에 환경, 연령, 및 성별 등이 모두 일치한 정상 대조군을 사용하지 못하였으며 특히, 성인과 소아로 연령에 차이를 보이는 두 군을 비교하였다는 점이 가장 두드러진 제한점이라고 볼 수 있다. 그러나, 유전적 연구가 인간의 수명을 결정하거나 생명에 큰 위협을 주는 유전자로 확인된 특정 유전자의 빈도를 비교하지 않는다면, 대부분의 유전자가 나이나 성별에 따라서 변화할 가능성이 매우 적기 때문에 환자 대조군 연구에서 나이나 성별을 일치시켜야 할 필요성은 환경과 인종을 일치시켜야 할 필요성에 비하여 그 중요성이 상대적으로 덜 강조된다27).
- 그러나, 과거의 연구에서 9년의 유행기 동안(1990∼1999년) 분리된 바이러스 아형 및 유전형이 RSV 감염증의 예후와 직접적으로 연관되지 않았다26). 이 연구에서 분석된 대부분의 바이러스가 본 연구의 대상 환자에서 분리되었으므로 바이러스 아형이나 유전형의 차이가 RSV 감염증의 예후와 연관되지 않다고 간접적으로 해석할 수 있을 것으로 생각된다. 반면에, 본 연구는 환자의 환경적인 요인과 바이러스 농도 정량을 분석하지 못한 제한점을 지니고 있다.
- 환자 대조군 연구로서의 연구 방법 및 결과 해석에 있어서 제한점 또한 크게 두 가지로 요약할 수 있다. 첫째, 환자 대조군 연구는 원칙적으로 검증하고자 하는 인자 이외에는 모두 동일한 요소를 가지는 집단을 선정하는 것이 바람직하다. 하지만, 본 연구의 대조군은 모두 성인으로 환자군이 어린 소아인 점을 고려하였을 때 연령의 분포에 큰 차이를 보이고 있다.
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