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문제 정의
- 본 연구는 향유 추출물의 화장품 원료로서의 특성을 알아보기 위하여 세포 독성, 항산화(DPPH, Mn-SOD 생성 억제), 미백(멜라닌 생성 억제) 및 항염OL-lα, IL-6, COX-2, total NO 생성 억제)효과를 연구하였다.
- 본 연구에서는 천연물을 대상으로 실시한 스크리닝에서 주목할만한 결과를 나타낸 시료들을 선별하여 얻은 향유의 화장품 원료로서의 특성을 알아보기 위하여 항산화(DPPH 라디칼 소거, Mn-SOD 생성 억제), 미백(멜라닌 생성 억제) 및 항염(IL-Iα, IL-6, COX-2, total NO 생성 억제)과 관련된 실험을 실시하여, 화장품 원료로서의 이용 가능성을 알아보고자 하였다.
제안 방법
- FBS를 10% 농도로 하여 배양하였다. 3-(4,5-Di- methylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide (MTT) 측정은 Mosmann 방법[16]을 변형하여 실시하였다. Human fibroblast를 12 well plate에 분주하여 24 h 배양 후, 시료를 처리하고 48 h 배양하였다.
- 70% 메탄올 추출물 4 g을 메탄올 20 mL에 용해시킨후 syringe filter (Sartorius)를 사용하여 여과한 후 silicagel (230~400 mesh, Merck) 과 MPLC를 사용하여 크로마토그래피를 실행하였다. 실험은 hexane, hexane 과 ethylacetate 혼합용액 (9:1, 4:1, 2: 1 그리고 1:1), ethyl- acetate, ethylacetate와 methyl alcohol 혼합용액(1 : 1), methyl alcohol의 조건으로 전개시켜 4개의 분획으로 분리하였다.
- DMEM과 HAM'S/F-12 media를 3:1의 비율로 조성하고 FBS를 10% 농도의 배양액에서 human normal fibro blast (MTT사)를 배양하였다. Fibroblast를 12 well plate 에 분주 한 후 24 h 배양하였다.
- DMEM과 HAM'S/F-12 media를 3:1의 비율로 조성하고 FBS를 10% 농도의 배양액에서 human normal fibro blast (MTT사)를 배양하였다. Fibroblast를 12 well plate 에 분주 한 후 24 h 배양하였다.
- DMEM과 HAMS/FT2 media를 3: 1의 비율로 조성하고 FBS를 10% 농도의 배양액에서 human normal fibroblast (MTT사)를 배양하였다. Fibroblast를 12 well plate에 분주 한 후 24 h 배양하였다.
- DMEM과 HAMSZFT2 media를 3 :1의 비율로 조성하고 FBS를 10% 농도의 배양액에서 human normal fibroblast (MTT사)를 배양하였다. Fibroblast를 12 well plate에 분주 한 후 24 h 배양하였다.
- DMEM과 HA]VrSZF-12 media를 3 :1의 비율로 조성하고 FBS를 10% 농도의 배양액에서 human normal fibro blast (MTT사)를 배양하였다. Fibroblast를 12 well plate에 분주 한 후 24 h 배양하였다.
- 각각의 용매별 추출액은 여과지 (Whatman)와 aspirator (EYELA) 를 사용하여 여과한 후 evaporator (EYELA, BUCHI)를이용하여 농축하였다. 농축된 추출물은 freeze dryer (EYELA)를 사용하여 분말로 만들어 보관하였다.
- 배양 후 배지를 저}거하고 10% FBS, 0.2 mM theophylline이 함유된 DMEM으로 교체한 농도별 희석한시료를 각각 첨가하고 나서, 5% CO2, 37 ℃ 조건하에서 세포가 약 80% 이상 될 때까지 배양하였다. 배양 후 배지를 제거한 다음 PBS로 세척하고 trypsin으로 처리하여 세포 pellet을 회수하였다.
- 실행하였다. 실험은 hexane, hexane 과 ethylacetate 혼합용액 (9:1, 4:1, 2: 1 그리고 1:1), ethyl- acetate, ethylacetate와 methyl alcohol 혼합용액(1 : 1), methyl alcohol의 조건으로 전개시켜 4개의 분획으로 분리하였다.
- 용매별(30%, 70% 그리고 100% 메탄올)로 추출한 각각의 향유 추출물을 대상으로 세포 독성, 항산화(DPPH 라디칼 소거) 및 미백(tyrosinase 저해, 멜라닌 생성 억제) 효과 실험을 하였다. 세포 독성 실험 결과 용매별(30%, 70% 그리고 100%) 추출물 모두에서 세포 독성이 나타내지 않았고, 세포들을 증식시키고 대사를 촉진시키는 결과를 나타내었다.
- 상등액이 제거된 pellet을 60 ℃ 항온기에서 24 h 건조시킨 후 1 N NaOH를 첨가하여 세포내의 melanin을 용해시켰다. 용해된 melanin을 PBS로 적당량 희석, ELISA reader를 이용하여 490 nm에서 흡광도를 측정한 후 melanin 생성 저해율(%)을 계산하였다.
- 2% 농도에서는 80% 정도의 강한 멜라닌 생성 억제 호과를 나타내었다. 이 실험 결과를 토대로 70% 메탄올 추출물에 대하여 MPLC를 사용한 성분 분리 실험을 실시하였고, 실험 결과로 얻은 4개의 분획들을 대상으로 세포독성, 항산화(DPPH 라디칼 소거, MN-SOD 생성 억제), 멜라닌 생성 억제 및 항염(IL-lα, IL-6, COX-2, total NO 생성 억제)효과를 연구하였다.
- 항산화 활성은 DPPH를 이용하여 시료의 라디칼 소거 효과를 측정하는 Blois법[1 기을 변형하여 실시하였다. 96 well plate에 0.
- 향유 200 g을 각각 2 L의 100%, 70% 그리고 30% 메탄올의 조건으로 실온에서 일주일동안 추출하였다. 각각의 용매별 추출액은 여과지 (Whatman)와 aspirator (EYELA) 를 사용하여 여과한 후 evaporator (EYELA, BUCHI)를이용하여 농축하였다.
대상 데이터
- 실험에 사용한 시약으로는 1, 1 -di phenyl-2-picryl-hydrazyl (DPPH), L-tyrosine, tyrosinase (from mushroom), potassium phosphate(mono-basic, di basic), 3-(4, 5-dimethyl-2-thiazolyl)-2, 5-diphenyl-2H-tetra- zoliumbromide (MTT), Dulbecco's modified Eagles me dium (DMEM), fetal bovine serum (FBS), trypsin- EDTA solution, dimethyl sulfoxide (DMSO), H2O2 (hydrogen peroxide), nutrient mixture FT-12 Ham (HAM'S/ F-12), phosphate buffered saline (PBS) solution은 Sigma사의 제품을, human IL-1α ELISA kit, human IL-6 ELISA kit는 Endogen사의 제품을, COX-2 ELISA kit, total NO(nitric oxide) ELISA kit, Mn-SOD ELISA kit는 Assay Designs사의 제품을, MPLC를 이용한 크로마토그래피에 사용한 Silica gel 60(230~400 mesh)은 Merck사의 제품을, 용매는 덕산화학과 Fisher사의 제품을 사용하였다. Human normal fibroblast는 국내 MTT사에서, B16-F10 melanoma 세포는 ATCC에서 분양받아 사용하였다. 실험에 사용한 기기로는 aspirator (EYELA), evaporator (EYELA, BUCHI), MPLC (BUCHI), ELISA reader (Molecular Devices)를 사용하였다.
- Human normal fibroblast를 국내 MTT사에서 구입하여 DMEM과 HAM'S/F-12 media를 3:1의 비율로 조성하고 FBS를 10% 농도로 하여 배양하였다. 3-(4,5-Di- methylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide (MTT) 측정은 Mosmann 방법[16]을 변형하여 실시하였다.
- 본 실험에 사용한 향유는 2005년 3월 경동시장에서 구입하여 사용하였다. 실험에 사용한 시약으로는 1, 1 -di phenyl-2-picryl-hydrazyl (DPPH), L-tyrosine, tyrosinase (from mushroom), potassium phosphate(mono-basic, di basic), 3-(4, 5-dimethyl-2-thiazolyl)-2, 5-diphenyl-2H-tetra- zoliumbromide (MTT), Dulbecco's modified Eagles me dium (DMEM), fetal bovine serum (FBS), trypsin- EDTA solution, dimethyl sulfoxide (DMSO), H2O2 (hydrogen peroxide), nutrient mixture FT-12 Ham (HAM'S/ F-12), phosphate buffered saline (PBS) solution은 Sigma사의 제품을, human IL-1α ELISA kit, human IL-6 ELISA kit는 Endogen사의 제품을, COX-2 ELISA kit, total NO(nitric oxide) ELISA kit, Mn-SOD ELISA kit는 Assay Designs사의 제품을, MPLC를 이용한 크로마토그래피에 사용한 Silica gel 60(230~400 mesh)은 Merck사의 제품을, 용매는 덕산화학과 Fisher사의 제품을 사용하였다.
- Human normal fibroblast는 국내 MTT사에서, B16-F10 melanoma 세포는 ATCC에서 분양받아 사용하였다. 실험에 사용한 기기로는 aspirator (EYELA), evaporator (EYELA, BUCHI), MPLC (BUCHI), ELISA reader (Molecular Devices)를 사용하였다.
- 사용하였다. 실험에 사용한 시약으로는 1, 1 -di phenyl-2-picryl-hydrazyl (DPPH), L-tyrosine, tyrosinase (from mushroom), potassium phosphate(mono-basic, di basic), 3-(4, 5-dimethyl-2-thiazolyl)-2, 5-diphenyl-2H-tetra- zoliumbromide (MTT), Dulbecco's modified Eagles me dium (DMEM), fetal bovine serum (FBS), trypsin- EDTA solution, dimethyl sulfoxide (DMSO), H2O2 (hydrogen peroxide), nutrient mixture FT-12 Ham (HAM'S/ F-12), phosphate buffered saline (PBS) solution은 Sigma사의 제품을, human IL-1α ELISA kit, human IL-6 ELISA kit는 Endogen사의 제품을, COX-2 ELISA kit, total NO(nitric oxide) ELISA kit, Mn-SOD ELISA kit는 Assay Designs사의 제품을, MPLC를 이용한 크로마토그래피에 사용한 Silica gel 60(230~400 mesh)은 Merck사의 제품을, 용매는 덕산화학과 Fisher사의 제품을 사용하였다. Human normal fibroblast는 국내 MTT사에서, B16-F10 melanoma 세포는 ATCC에서 분양받아 사용하였다.
성능/효과
- IL-6 생성 억제 효과는 1번, 2번 그리고 3번 분획들이 모든 농도에서 유사한 효과를 나타내었다. 0.001% 농도에서 3번 분획은 42%, 1번 분획은 33%, 2번 분획은 32%의 효과를 확인 할 수 있었고, 4번 분획은 10% 이하의 효과를 나타내었다. COX-2 생성 억제 효과는 4개 분획들 모두에서 약한 효과를 나타내었다.
- 1 번, 2번 그리고 3번 분획에서 실험한 모든 농도에 관계없이 IL-6 생성 억제 효과를 나타내었다. 1번 분획은 23 ~ 32%, 2번 분획은 21 ~ 32% 그리고 3번 분획은 31 ~ 42%의 효과를 확인할 수 있었다.
- 025% 이상의 농도에서 80% 이상의 강한 라디칼 소거 효과를 나타내었다. 100% 메탄올 추출물은 이보다 약한 효과를 나타내었는데, 0.1% 이상의 농도에서 80% 이상의 효과를 나타내었다(Figure 2).
- 025% 이상의 농도에서 80%의 효과를 나타내었다. 100% 추출물은 이보다 약한 0.1% 농도에서 80%의 효과를 나타내었다. B16-F10 melanocyte를 사용한 세포내 멜라닌 생성 억제 시험에서 각각의 용매별추출물들은 0.
- 1번 ~ 4번 분획 모두 실험한 모든 농도에서 유사한 COX-2 생성 억제 효과를 약하게 나타내었다. 1번 분획은 10 ~ 18%, 2번 분획은 10 ~ 15%, 3번 분획은 5 ~ 25% 그리고 4번 분획은 2 ~ 12%의 약한 효과를 확인할 수 있었다(Figure 10).
- IL-6 생성 억제 효과를 나타내었다. 1번 분획은 23 ~ 32%, 2번 분획은 21 ~ 32% 그리고 3번 분획은 31 ~ 42%의 효과를 확인할 수 있었다. 4번 분획은 10% 이하의 효과를 나타내었다(Figure 9).
- IL-lα 생성 억제 효과를 나타내었다. 1번 분획은 38 ~ 46%, 2번 분획은 29 ~ 48% 그리고 3번 분획은 46 ~ 55%의 강한 효과를 확인할 수 있었다. 4번 분획은 모든 농도에서 12% 이하의 효과를 나타내었다(Figure 8).
- IL-lα 생성 억제 효과는 1번, 2번 그리고 3번 분획들은 모든 농도에서 효과를 나타내었다. 1번 분획은 39 ~ 46%, 2번 분획은 29 ~ 49%, 3번 분획은 47 ~ 55%의 강한 효과를 확인 할 수 있었고, 4번 분획은 13% 이하의 효과를 나타내었다. IL-6 생성 억제 효과는 1번, 2번 그리고 3번 분획들이 모든 농도에서 유사한 효과를 나타내었다.
- 멜라닌 생성 억제 효과는 모든 분획들이 강한 효과를 나타내었다. 1번, 2번 그리고 4번 분획들은 저농도인 0.0003%에서 각각 46%, 57% 그리고 60%의 효과를 나타내었고, 3 번 분획은 고농도인 0.005%에서 52%의 강한 효과를 확인 할 수 있었다. IL-lα 생성 억제 효과는 1번, 2번 그리고 3번 분획들은 모든 농도에서 효과를 나타내었다.
- 라디칼 소거 효과를 나타내었다. 30%와 70% 메탄올 추출물은 유사한 라디칼 소거 효과를 나타내었는데, 농도 의존적으로 효과가 증가하는 것을 확인할 수 있었고, 0.025% 이상의 농도에서 80% 이상의 강한 라디칼 소거 효과를 나타내었다. 100% 메탄올 추출물은 이보다 약한 효과를 나타내었는데, 0.
- Total NO 생성 억제 효과는 4개 분획들 모두에서 효과를 나타내었다. 3번 분획은 0.0025% 농도에서 48%의 강한 효과를 나타내었고, 2번 분획은 0.005% 농도에서 32%, 3번 분획은 0.005% 농도에서 26% 그리고 4번 분획은 0.0025% 농도에서 17%의 효과를 확인하였다.
- 3번, 2번, 1번 그리고 4번 분획 순으로 효과를 나타내었다. 3번 분획은 49%의 강한 효과를, 2번 분획은 약 34%, 1번 분획은 약 29%의 효과를 나타내었고, 4번 분획은 11% 이하의 약한 효과를 나타내었다(Figure 7).
- 3번 분획은 농도 의존적으로 효과를 나타내는 것을 알 수 있었고, 47%의 강한 Total NO 생성 억제 효과를 나타내었다. 2번 분획은 31%, 1번 분획은 26% 그리고 4번 분획은 17%의 효과를 나타내었다(Figure 11).
- 4 번, 2번, 1번 분획은 0.0003%의 저농도에서 각각 59%, 56%, 45%의 멜라닌 억제 효과를 나타내었고, 3번 분획은 0.005%의 고농도에서 52%의 효과를 나타내었다(Figure 6).
- 4개 분획 모두 Mn-SOD 생성 억제 효과를 나타내는것을 알 수 있었다. 1번, 2번 그리고 3번 분획들은 농도 의존적으로 효과를 나타내었다.
- 4개 분획 모두 세포 독성을 나타내지 않았고, 1번과 3번 분획에서 세포들을 증식시키고 대사를 촉진시키는 결과를 나타내었고, 2번과 4번 분획들도 이보다 약한 결과를 나타내었다(Figure 4).
- 1% 농도에서 80%의 효과를 나타내었다. B16-F10 melanocyte를 사용한 세포내 멜라닌 생성 억제 시험에서 각각의 용매별추출물들은 0.00025 - 0.01% 농도에서 20% 정도, 0.1 ~ 0.2% 농도에서는 80% 정도의 강한 멜라닌 생성 억제 호과를 나타내었다. 이 실험 결과를 토대로 70% 메탄올 추출물에 대하여 MPLC를 사용한 성분 분리 실험을 실시하였고, 실험 결과로 얻은 4개의 분획들을 대상으로 세포독성, 항산화(DPPH 라디칼 소거, MN-SOD 생성 억제), 멜라닌 생성 억제 및 항염(IL-lα, IL-6, COX-2, total NO 생성 억제)효과를 연구하였다.
- 001% 농도에서 3번 분획은 42%, 1번 분획은 33%, 2번 분획은 32%의 효과를 확인 할 수 있었고, 4번 분획은 10% 이하의 효과를 나타내었다. COX-2 생성 억제 효과는 4개 분획들 모두에서 약한 효과를 나타내었다. 3번 분획은 0.
- 세포 독성 실험 결과 용매별(30%, 70% 그리고 100%) 추출물 모두에서 세포 독성이 나타내지 않았고, 세포들을 증식시키고 대사를 촉진시키는 결과를 나타내었다. DPPH법으로 실시한 라디칼 소거 효과실험에서 70%와 30% 추출물들은 유사한 라디칼 소거 효과를 나타내었는데, 0.025% 이상의 농도에서 80%의 효과를 나타내었다. 100% 추출물은 이보다 약한 0.
- 25% 농도에서 50%의 라디칼 소거 효과를 나타내었다. Mn-SOD 생성 억제 효과는 3번 분획은 0.0025% 농도에서 49%, 2 번 분획은 0.0025% 농도에서 34%, 1번 분획은 0.005% 농도에서 29%의 효과를 확인할 수 있었고, 4번 분획은 0.0025% 농도에서 12%의 약한 효과를 나타내었다. 멜라닌 생성 억제 효과는 모든 분획들이 강한 효과를 나타내었다.
- 0025% 농도에서 12%의 약한 효과를 나타내었다. 멜라닌 생성 억제 효과는 모든 분획들이 강한 효과를 나타내었다. 1번, 2번 그리고 4번 분획들은 저농도인 0.
- 01%의 농도에서 20%의 멜라닌 생성 억제 효과를 유사하게 나타내었다. 세 가지 용매별 추출물 모두 0.1 ~ 0.2%의 농도에서는 80%의 강한 멜라닌 생성 억제 효과를 나타내었다(Figure 3).
- 실험을 하였다. 세포 독성 실험 결과 용매별(30%, 70% 그리고 100%) 추출물 모두에서 세포 독성이 나타내지 않았고, 세포들을 증식시키고 대사를 촉진시키는 결과를 나타내었다. DPPH법으로 실시한 라디칼 소거 효과실험에서 70%와 30% 추출물들은 유사한 라디칼 소거 효과를 나타내었는데, 0.
- 용매별 추출물(30%, 70% 그리고 100%) 모두 실험한모든 농도에서 세포 독성을 나타내지 않았고, 세포 증식및 대사를 촉진시키는 결과를 나타내었다(Figure 1).
- 효과를 나타내었다. 용매별 추출물의 결과와 비교해보면 분획들의 라디칼 소거 효과가 약하게 나타나는 것을 알 수 있었다. 3번 분획은 0.
- 이러한 결과들로부터 향유 추출물 및 그 분리 분획물들이 항산화, 미백 그리고 항염 효과를 가진 화장품 원료로써 개발 및 연구 가치가 있음을 확인 할 수 있었다. 또한, 1번, 2번 그리고 3번 분획들이 항산화(DPPH 라디칼 소거, Mn-SOD 생성 억제), 미백(멜라닌 생성 억제) 그리고 항염 (IL-lα, IL-6, COX-2, total NO 생성 억제) 효과모두에서 우수한 효과를 갖고 있는 것을 확인하였고, 각각의 분획들로부터 활성 성분 분리 및 성분 물질 구조확인 등에 대한 보다 다양한 추가 실험 및 연구가 필요하다고 사료된다.
- 향유 추출물로부터 분리한 4개 분획들에 대한 효능 실험 결과를 정리해 보면, 세포 독성 실험 결과 4개 분획들 모두 세포 독성을 나타내지 않았고, 세포들을 증식시키고 대사를 촉진시키는 결과를 나타내었다. DPPH 라디칼 소거 효과는 3, 4, 2 그리고 1번 분획 순으로 라디칼 소거효과를 나타내었다.
후속연구
- 또한, 1번, 2번 그리고 3번 분획들이 항산화(DPPH 라디칼 소거, Mn-SOD 생성 억제), 미백(멜라닌 생성 억제) 그리고 항염 (IL-lα, IL-6, COX-2, total NO 생성 억제) 효과모두에서 우수한 효과를 갖고 있는 것을 확인하였고, 각각의 분획들로부터 활성 성분 분리 및 성분 물질 구조확인 등에 대한 보다 다양한 추가 실험 및 연구가 필요하다고 사료된다.
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