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문제 정의
- 본 연구에서는 콜라겐 합성을 촉진하는 노니추출물의 주름 개선 기능성 화장품으로 의제품 개발 연구를 수행하기 위해 유효성분을 분리하여 구조를 규명하였으며, 이 물질이 농도 의존적으로 효과가 있는 것을 확인하였다. 또한 추출물 및 제형상에서의 유효성분의 안정성을 확인하였으며, 피부 안전성 및 전문임상기관에서의 유효성 평가를 실시하여 주름 개선 기능성 소재로의 가능성을 연구 수행하였다.
- 인도네시아에서는 멘크드, 파체, 디바 등으로 불리며, 만병에 효과가 있는 약으로서 지금도 "쟈무"라는 전통치료약으로 이용되고 있다. 본 연구에서는 콜라겐 합성을 촉진하는 노니추출물의 주름 개선 기능성 화장품으로 의제품 개발 연구를 수행하기 위해 유효성분을 분리하여 구조를 규명하였으며, 이 물질이 농도 의존적으로 효과가 있는 것을 확인하였다. 또한 추출물 및 제형상에서의 유효성분의 안정성을 확인하였으며, 피부 안전성 및 전문임상기관에서의 유효성 평가를 실시하여 주름 개선 기능성 소재로의 가능성을 연구 수행하였다.
- 이미 음료로서는 판매되고 있으며, 효능효과도 많이 알려져 있다. 이번 연구는 노니추출물의 주름 개선 기능성 화장품 원료로서의 이용 가능성에 대한 것이다. 본 연구자들은 먼저 노니추출물이 사람의 섬유아세포에서 콜라겐 합성효과가 있는 것을 확인하였으며, 노니추출물의 유효성분을 분리하여 천연에 존재하면서 항균 및 항바이러스로 효과를 갖고 있는 쿠마린 계열인 스코폴레틴임을 확인하였다.
제안 방법
- 우선, 첩포 부위인 전박을 70% 에탄올로 닦아내고 건조시킨 후, 시험물질이 적용된 firm chambers (Epitest Ltd Oy, Finland)를 시험부위에 첩포하였다. 24 h 후에 첩포를 제거하고 30 min, 24 h, 48 h에 자극 발생 유무를 평가하였다. 평가기준은 international contact dermatitis research group (ICDRG)의 판정 기준에 따랐으며, 피부 자극 유발 가능성의 평가는 다음 계산식으로부터 계산된 평균값으로 하였다[6,7].
- 위하여 자극감 시험을 수행하였다. Stinger는 steam generator (Vaporzone 707, Taiwan)를 사용하여 15 min동안 충분히 sweating시키고 나서 충분량의 시료를 손에 묻혀 시험물질을 각각 왼쪽과 오른쪽의 코 주위 및 뺨을 중심으로 강하게 비빈다, 20명의 피험자(남자 10명, 여자 10명)를 대상으로 실시하였으며 연령 분포는 23세~33 세, 평균 연령은 29세였다, 피험자들은 주관적인 자극 (stinging, itching burning, etc)의 자극 정도를 평가하게 된다. 즉 0 = 자극 없음, 1 = 자극 약간 있음, 2 = 자극이 강함, 3 = 자극이 매우 강함으로 표시한다.
- 노니추출물과 스코폴레틴의 콜라겐 합성 작용을 확인하기 위해, 이미 효과가 있는 것으로 알려진 TGF-B (10 ng/mL)를 양성대조군으로 하여 사람 섬유아세포에서 실험을 실시하였다. Table 1에서 알 수 있듯이 아무것도 처리하지 않은 대조군에 비해 노니추출물이 1.
- 여성 24명을 대상으로 하였다. 노니추출물을 3% 함유한 크림을 시험제품으로 하며, 함유하지 않은 크림을 대조군으로 하였다. 시험은 총 12주간 실시하였으며 아침과 저녁 피부 손질시 사용하게 하였다.
- 노니추출물을 함유하는 크림의 주관적 자극을 평가하기 위하여 자극감 시험을 수행하였다. Stinger는 steam generator (Vaporzone 707, Taiwan)를 사용하여 15 min동안 충분히 sweating시키고 나서 충분량의 시료를 손에 묻혀 시험물질을 각각 왼쪽과 오른쪽의 코 주위 및 뺨을 중심으로 강하게 비빈다, 20명의 피험자(남자 10명, 여자 10명)를 대상으로 실시하였으며 연령 분포는 23세~33 세, 평균 연령은 29세였다, 피험자들은 주관적인 자극 (stinging, itching burning, etc)의 자극 정도를 평가하게 된다.
- 실시하였다. 또한 유효성분의 함량 분석 및 안정성시험은 HPLC를 이용하였으며, 컬럼은 KromasU C18, 검출기는 2487UV 검출기를 이용하였다. 측정파장은 305 nm, 유속은 1.
- 즉 0 = 자극 없음, 1 = 자극 약간 있음, 2 = 자극이 강함, 3 = 자극이 매우 강함으로 표시한다. 또한, 적용 후자극 반응이 나타나는 시간에 따라 30 sec, 2.5 min, 5 min, 8 min 등의 4구분으로 나눴으며, 30 sec 이내에 나타나는 경우를 intense stinging (4점), 2.5 min mild stinging (3점), 5 min moderate stinging (2점), 그리고 8 min 이내에 나타나는 경우를 delayed stinging (1점)으로 구분하여 평가하였다. 자극의 정도는 하기의 공식으로부터 계산된 자극양성율로 판정하였다.
- 평가하였다. 매 평가시점 마다 주름상태의 둥급을 기록하고, 평균값을 취하여 분석하였다.
- incubator에서 배양하였다. 배양액을 가지고 pro-collagen Type Ⅰ C-peptide EIA kit (MK101, Takara Bio Inc., Japan)를 이용하여 콜라겐 양을 측정하였다. 콜라겐 측정키트에 포함된 표준용액을 희석한 후 450 nm에서 흡광도를 측정하여 표준 농도 곡선을 작성하였으며, 각 배지에 포함된 총 단백질의 양으로 보정하여 콜라겐 발현량을 산정하였다.
- 노니 열매 1 kg을 70% 에탄올 용액으로 추출하여 Figure 1의 방법대로 각각을 분획하였다. 분획물중 CHCl3과 benzene 층에서 콜라겐 합성효과를 확인하고 이 분획물을 컬럼 크로마토 그래피 방법을 이용하여 분리 후 MeOH에서 재결정 후, 기기분석을 실시하였다. 1H NMR (300 MHz, MeOH-d6) δ: 7.
- 순수하게 정제된 활성성분의 구조분석을 위해 TLC, FT-IR, UV, 1H, 13C NMR, GC-Mass 등의 분석 기기를 통해 실시하였다. 또한 유효성분의 함량 분석 및 안정성시험은 HPLC를 이용하였으며, 컬럼은 KromasU C18, 검출기는 2487UV 검출기를 이용하였다.
- 스코폴레틴의 안정도를 측정하기 위하여 노니 추출물 및 노니 추출물 함유제품에서의 스코폴레틴 함량 변화를 측정하였다. HPLC를 이용하여 8주간의 실험을 실시한 결과, 0℃, 25℃, 50℃에서 모두 안정함을 확인 할 수 있었다(Table 3).
- 노니추출물을 3% 함유한 크림을 시험제품으로 하며, 함유하지 않은 크림을 대조군으로 하였다. 시험은 총 12주간 실시하였으며 아침과 저녁 피부 손질시 사용하게 하였다.
- 양측 눈가의 주름상태에 대해서 danelle's criteria를 수정 보완한 주름평가 기준에 의거 2인의 연구자가 독립적으로 평가하였다. 매 평가시점 마다 주름상태의 둥급을 기록하고, 평균값을 취하여 분석하였다.
- 평소 피부 질환 및 알러지가 없는 20명의 피험자(남자 10명, 여자 10명)를 대상으로 실시되었으며, 연령 분포는 24 -34, 평균 28세였다. 우선, 첩포 부위인 전박을 70% 에탄올로 닦아내고 건조시킨 후, 시험물질이 적용된 firm chambers (Epitest Ltd Oy, Finland)를 시험부위에 첩포하였다. 24 h 후에 첩포를 제거하고 30 min, 24 h, 48 h에 자극 발생 유무를 평가하였다.
- 70% EtOH추출액을 필터 후 45℃에서 감압 농축하였다. 이 농축액을 극성 차이를 이용하여 n-hex, CHCl3, EtOAc, n BuOH 및 물 분획으로 나누었다. 이 분획 중활성에 효과가 있는 분획을 silical gel column, HP-20, Sephadex LH20 컬럼크로마토그래피, 재결정 등을 실시하여 활성물질을 얻었다.
- 이 농축액을 극성 차이를 이용하여 n-hex, CHCl3, EtOAc, n BuOH 및 물 분획으로 나누었다. 이 분획 중활성에 효과가 있는 분획을 silical gel column, HP-20, Sephadex LH20 컬럼크로마토그래피, 재결정 등을 실시하여 활성물질을 얻었다.
- 5 min mild stinging (3점), 5 min moderate stinging (2점), 그리고 8 min 이내에 나타나는 경우를 delayed stinging (1점)으로 구분하여 평가하였다. 자극의 정도는 하기의 공식으로부터 계산된 자극양성율로 판정하였다.
- , Japan)를 이용하여 콜라겐 양을 측정하였다. 콜라겐 측정키트에 포함된 표준용액을 희석한 후 450 nm에서 흡광도를 측정하여 표준 농도 곡선을 작성하였으며, 각 배지에 포함된 총 단백질의 양으로 보정하여 콜라겐 발현량을 산정하였다.
- 피부 일차 자극을 평가하기 위한 인체 첩포시험을 CTFA guideline에서 제시한 방법에 약간의 변형을 가하여 실시하였다. 평소 피부 질환 및 알러지가 없는 20명의 피험자(남자 10명, 여자 10명)를 대상으로 실시되었으며, 연령 분포는 24 -34, 평균 28세였다.
- 피부주름의 상태는 제작한 피부모사판(skin replica, 온도 20~22℃, 습도 45~55%)을 Visiometer SV600 (Courage + Khazaka, Germany)을 이용하여 주름의 파라메터인 R1 (skin roughness), R2 (maximum roughness), R3 (average roughness), R4 (smoothness depth) 및 R5 (arithmetic average roughness)를 측정하였다.
대상 데이터
- 실험에 사용된 시약으로는 phosphate buffered saline (PBS), Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM) 및 용매 등은 Sigma사의 제품을 사용하였다. HPLC는 Waters 2695_2487을 이용하였고 1H NMR (300 MHz), 13C NMR (150 MHz)과 GC-Mass 는 Varian사의 기기를 이용하였다. 피부 세포는 인체 섬유아세포(normal human fibroblast)를 이용하였으며 임상진행은 엘리드 피부 과학연구소에서 수행하였다.
- 노니추출물을 함유하는 크림의 주름개선효과를 확인하기 위하여 평소 병력이 없는 피부를 가진 30 ~50대 한국인 여성 24명을 대상으로 하였다. 노니추출물을 3% 함유한 크림을 시험제품으로 하며, 함유하지 않은 크림을 대조군으로 하였다.
- 본 실험에 사용된 노니는 인도네시아산 노니 열매를 구입하여 사용하였다. 실험에 사용된 시약으로는 phosphate buffered saline (PBS), Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM) 및 용매 등은 Sigma사의 제품을 사용하였다.
- 사용하였다. 실험에 사용된 시약으로는 phosphate buffered saline (PBS), Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM) 및 용매 등은 Sigma사의 제품을 사용하였다. HPLC는 Waters 2695_2487을 이용하였고 1H NMR (300 MHz), 13C NMR (150 MHz)과 GC-Mass 는 Varian사의 기기를 이용하였다.
- 또한 유효성분의 함량 분석 및 안정성시험은 HPLC를 이용하였으며, 컬럼은 KromasU C18, 검출기는 2487UV 검출기를 이용하였다. 측정파장은 305 nm, 유속은 1.0 mL/min, 이동상은 18% ACN으로 분석하였다.
- 실시하였다. 평소 피부 질환 및 알러지가 없는 20명의 피험자(남자 10명, 여자 10명)를 대상으로 실시되었으며, 연령 분포는 24 -34, 평균 28세였다. 우선, 첩포 부위인 전박을 70% 에탄올로 닦아내고 건조시킨 후, 시험물질이 적용된 firm chambers (Epitest Ltd Oy, Finland)를 시험부위에 첩포하였다.
- HPLC는 Waters 2695_2487을 이용하였고 1H NMR (300 MHz), 13C NMR (150 MHz)과 GC-Mass 는 Varian사의 기기를 이용하였다. 피부 세포는 인체 섬유아세포(normal human fibroblast)를 이용하였으며 임상진행은 엘리드 피부 과학연구소에서 수행하였다.
데이터처리
- 대조군과 시험군 각각에서 육안평가 점수와 기기를 이용한 측정치인 Rl, R2, R3, R4 및 R5 값에 대해 4주, 8주 및 12주 후 시점에서 사용 전과 비교시 통계적으로 유의한 변화 여부를 알아보기 위해서 SPSS package program의 paired t-test 방법을 이용하였고, 통계적으로 유의차여부에 대해서는 independent t-test를 이용하여 검증하였다. 연구에 참여한 피험자 특징, 안전성과 효능에 관한 자가평가, 제품의 사용성 종합평가 분석은 기술적 통계를 이용하였다.
- 연구에 참여한 피험자 특징, 안전성과 효능에 관한 자가평가, 제품의 사용성 종합평가 분석은 기술적 통계를 이용하였다. 모든 통계결과는 p < 0.
이론/모형
- 24 h 후에 첩포를 제거하고 30 min, 24 h, 48 h에 자극 발생 유무를 평가하였다. 평가기준은 international contact dermatitis research group (ICDRG)의 판정 기준에 따랐으며, 피부 자극 유발 가능성의 평가는 다음 계산식으로부터 계산된 평균값으로 하였다[6,7].
성능/효과
- 분획물중 CHCl3과 benzene 층에서 콜라겐 합성효과를 확인하고 이 분획물을 컬럼 크로마토 그래피 방법을 이용하여 분리 후 MeOH에서 재결정 후, 기기분석을 실시하였다. 1H NMR (300 MHz, MeOH-d6) δ: 7.59(1H, d), 6.92(1H, s), 6.85 (1H, s), 6.27(1H, d), 3.96(3H, s): 13C NMR (150 MHz, MeOH-d6) :162.45, 150.72, 150.05, 145.11, 144, 09, 112.38, 111.18, 107.95, 103.23, 49.88, 49.46, 48.60 : MS (m/z): (M + 1) 193.0 data를 확인 한 결과 6,7-dimethoxy-2H-l-benzo- pyran-2-one; scopoletin으로 동정되었다. 이를 Figure 1에 나타내었다.
- HPLC를 이용하여 8주간의 실험을 실시한 결과, 0℃, 25℃, 50℃에서 모두 안정함을 확인 할 수 있었다(Table 3).
- 실시하였다. Table 1에서 알 수 있듯이 아무것도 처리하지 않은 대조군에 비해 노니추출물이 1.0%에서 25%의 콜라겐 생성을 촉진함을 확인하였다. 노니 추출물에서 분리한 유효성분인 스코폴레틴의 콜라겐합성효과를 확인한 결과 0.
- 0%에서 25%의 콜라겐 생성을 촉진함을 확인하였다. 노니 추출물에서 분리한 유효성분인 스코폴레틴의 콜라겐합성효과를 확인한 결과 0.1 ~ 0.2 μg/mL 등의 낮은 농도에서도 65 - 89%를 촉진함을 확인하였다. 이를 Table 2에 나타내었다.
- 노니추출물의 누적첩포자극 및 주관적 자극에 대한 평가를 실시한 결과, 노니추출물을 함유한 제형은 무자극으로 판정되었다. 자극감 시험에서는 노니 추출물을 함유하지 않는 대조 크림과 비교하였을 때 오히려 자극을 감소시켜주는 결과를 얻었다(Table 4).
- 2 μg/mL에서도 165 ~ 189%의 콜라겐 생합성을 촉진하여주는 것을 보였으며 기준물질로의 가능성을 알아보기 위하여 0℃, 25℃, 50℃ 8주간 스코폴레틴의 안정성을 확인 한 결과, 안정함을 확인할 수 있었다. 또한, 사람을 대상으로 실시한 임상시험에서도 노니 함유 크림은 매우 우수한 주름 개선 효과를 보였으며, 피부 자극도 없는 것으로 나타났다. 상기의 결과를 종합해 보면, 노니 추출물은 천연추출물로서 안전성, 유효성, 안정성이 매우 뛰어난 원료이며, 주름 개선 기능성 원료로서의 이용가능성이 매우 높을 것으로 생각된다.
- 이번 연구는 노니추출물의 주름 개선 기능성 화장품 원료로서의 이용 가능성에 대한 것이다. 본 연구자들은 먼저 노니추출물이 사람의 섬유아세포에서 콜라겐 합성효과가 있는 것을 확인하였으며, 노니추출물의 유효성분을 분리하여 천연에 존재하면서 항균 및 항바이러스로 효과를 갖고 있는 쿠마린 계열인 스코폴레틴임을 확인하였다. 스코폴레 틴은 0.
- 본 연구자들은 먼저 노니추출물이 사람의 섬유아세포에서 콜라겐 합성효과가 있는 것을 확인하였으며, 노니추출물의 유효성분을 분리하여 천연에 존재하면서 항균 및 항바이러스로 효과를 갖고 있는 쿠마린 계열인 스코폴레틴임을 확인하였다. 스코폴레 틴은 0.1 ~ 0.2 μg/mL에서도 165 ~ 189%의 콜라겐 생합성을 촉진하여주는 것을 보였으며 기준물질로의 가능성을 알아보기 위하여 0℃, 25℃, 50℃ 8주간 스코폴레틴의 안정성을 확인 한 결과, 안정함을 확인할 수 있었다. 또한, 사람을 대상으로 실시한 임상시험에서도 노니 함유 크림은 매우 우수한 주름 개선 효과를 보였으며, 피부 자극도 없는 것으로 나타났다.
- 평가하여 나타낸 것이다. 이 결과는 노니 크림을 사용한 피검자의 주름이 대조군을 사용한 피검자보다 현저히 개선되는 것을 보여주며, 통계적으로 유의한 수준(p < 0.05)의 감소이다.
- 효과를 보여 준다. 이 결과에서도 노니 추출물은 피부 주름을 대조군에 비해 현저하게 감소시켜주는 것을 보여주며 이 결과들은 모두 통계적으로 유의한 수준의 차이 (p < 0.05)를 가지는 것으로 나타났다(ΔR1, ΔR2, ΔR3).
- 판정되었다. 자극감 시험에서는 노니 추출물을 함유하지 않는 대조 크림과 비교하였을 때 오히려 자극을 감소시켜주는 결과를 얻었다(Table 4).
후속연구
- 또한, 사람을 대상으로 실시한 임상시험에서도 노니 함유 크림은 매우 우수한 주름 개선 효과를 보였으며, 피부 자극도 없는 것으로 나타났다. 상기의 결과를 종합해 보면, 노니 추출물은 천연추출물로서 안전성, 유효성, 안정성이 매우 뛰어난 원료이며, 주름 개선 기능성 원료로서의 이용가능성이 매우 높을 것으로 생각된다.
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