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문제 정의
- 그러나 화장품 개발에 있어 계면활성제, 방부제, 향, 식물추출물 등자극 유발이 예측되는 다양한 원료들이 필수 불가결하게 사용되고 있다. 따라서 본 연구에서는 제품에 의해 유발되는 피부 자극을 최소화 할 수 있는 물질을 개발하고자 하였고, 사전 실험에서 스크리닝된 종대황추출물의 다양한 자극완화 효과 연구를 수행하였다.
- 따라서 본 연구에서도 종대황추출물의 자극완화 효과를 최종적으로 평가하기 위하여 종대황추출물을 함유하는 0/W 에멀젼 #4 및 placebo를 20명의 피험자를 대상으로 4주간의 사용성 시험을 실시하였다.
- 이와 같은 이유로 화장품 제조사들은 저자극 화장품 개발을 위해 낮은 자극의 원료사용 및 배합 농도 결정, 다양한 자극 완화제 첨가 등의 방법을 이용하고 있다. 따라서 본 연구자들은 저자극성 화장품 개발에 이용 가치가 높은 자극완화제를 개발하고자 하였다.
- 본 연구에서는 종대황추출물의 자극완화 효과를 시험하여 자극완화제로서의 이용 가능성을 검토하였으며, 다양한 시험에서 종대황추출물의 자극완화 효과가 검증되었다.
제안 방법
- 수행하였다. 21~35세의 30명의 여성 피험자를 대상으로 실시하였으며, 피험자들은 종대황추출물 함유 조성물 및 placebo를 하루에 최소 두 번,아침과 저녁에 평상시 사용 조건으로 사용하게끔 한 다음, 자극 여부 및 강도를 1일 1회씩 설문지에 작성하도록 하였다.
- 우선, 첩포 부위인 전박을 70% 에틸알코올로 닦아내고 건조시킨 후, 시험물질이 적용된 Hayes chambers (Hayes Service, Netherlands)를 시험 부위에 첩포하였다. 24 h 후에 첩포를 제거하고 30 min, 24 h, 그리고 48 h 후에 자극 발생 유무를 평가하였다. 평가 기준은 International Contact Dermatitis Research Group (ICDRG) 의 판정 기준에 따랐으며, 피부 자극 유발 가능성의 평가는 다음 계산 Figure 2.
- 3). Methyl nicotinate가 처리된 여러 부위에 각각의 O/W 에멀젼을 도포하고 하였다. 20 min 후, 홍반지수를 측정한 결과 종대황추출물이 25, 50, 100μg/mL 함유된 O/W 에 Figure 4.
- 각질형성세포를 96-well plate에 2x104 cells/well의 밀도로 분주하고, 종대황추출물이 포함된 DMEM 배지로 교체하여 1 h 전처리 후, 자극원인 H2O2를 0.5 mM로 처리하여 24 h 배양한 후, 배양배지로 분비된 IL-8 또는 TNF-a 의 양을 Chemicon International사의 IL-8 EIA kit 또는 TNF-α sandwich ELISA kit을 사용하여 측정하였다.
- 국내산 종대황을 정제수로 세척한 후 건조하고, 작은 조각으로 파쇄한 뒤, 여기에 그 건조 중량의 5배의 70% 에틸알코올을 첨가하였다.'실온에서 5일간 추출한 후 300 메쉬 여과포로 여과하고, 다시 와트만 5번 여과지로 여과한 후, 회전 감압 증발기로 건조하였다.
- 우선, 첩포 부위인 전박을 70% 에틸알코올로 닦아내고 건조시킨 후, 시험물질이 적용된 Hayes chambers (Hayes Service, Netherlands)를 시험 부위에 첩포하였다. 24 h 후에 첩포를 제거하고 30 min, 24 h, 그리고 48 h 후에 자극 발생 유무를 평가하였다.
- 억제 효과를 측정하였다. 전박을 70% 에틸알코올로 닦아내고 건조시킨 후, 종대황추출물을 함유한 O/W 에멀젼을 시험 부위에 적용하였다. 20 min 후에 3 mM methyl nicotinate를 filter paper disc를 사용하여 10 μL 씩 시험부위에 적용하고 1 min 후 disc를 제거하였다.
- 종대황추출물의 methyl nicotinate에 의해 유발되는 홍반의 억제 효과를 측정하였다. 전박을 70% 에틸알코올로 닦아내고 건조시킨 후, 종대황추출물을 함유한 O/W 에멀젼을 시험 부위에 적용하였다.
- 종대황추출물의 항염증 기작을 연구하고자, 각질 형성 세포를 과산화수소로 염증반응을 자극하여 염증 유발 사이토카인인 IL-8과 TNF-α 가 발현되도록 하고, 종대 황 추출물 첨가 배양에 의한 상기 사이토카인의 분비량 변화를 측정하였다. 시험결과, 종대황추출물이 25, 50, 100μg/mL로 첨가되었을 때 각질형성세포에서 생산된 Ⅱ.
- 인체 첩포시험을 실시하였다. 피부 일차 자극 정도는 크게 5 grade로 나누어 평가하였다. 0~0.
- 피부 일차 자극을 평가하기 위한 인체 첩포시험을 the cosmetic, toiletry, and fragrance association (CTFA) 가이드라인에서 제시한 방법에 약간의 변형을 가하여 실시하였다[5]. 우선, 첩포 부위인 전박을 70% 에틸알코올로 닦아내고 건조시킨 후, 시험물질이 적용된 Hayes chambers (Hayes Service, Netherlands)를 시험 부위에 첩포하였다.
- 20 min 후에 3 mM methyl nicotinate를 filter paper disc를 사용하여 10 μL 씩 시험부위에 적용하고 1 min 후 disc를 제거하였다. 피부 자극 완화 효과는 색차계를 이용하여 홍반 정도를 의미하는 a*값을 측정하였다. 피부 평가는 실내온도 23℃, 상대습도 55%의 항온항습 조건에서 측정하였다.
- 화장품에 빈번히 사용되는 자극원인 락틱산에 대한 종대 황 추출물의 피부 일차자극 완화 효과를 평가하기 위하여 인체 첩포시험을 실시하였다. 피부 일차 자극 정도는 크게 5 grade로 나누어 평가하였다.
대상 데이터
- 검사 전 최소 일주일 동안 경구 부신피질 호르몬제나 항히스타민제, 항염제를 복용하지 않았으며, 검사부위에 국소 부신피질 호르몬제를 바르지 않았다. 20명의 피험자(남자 10명, 여자 10명)를 대상으로 실시되었으며, 연령분포는 21 ~ 35세, 평균 연령은 28세였다.
- 1). 5.0% 락틱산이 본 실험에서 자극원으로 사용되었으며 , 1.0, 2.0, 5.0% 종대 황추출물이 자극 완화제로서 화장료 조성물에 적용되었다. #1은 negative control, #8은 자극원만을 포함하는 positive control이며, #2, #3, #4는 자극완화제만 포함하고, #5, #6, #7은 자극완화제와 자극원을 포함한다.
- 구입하였다. trypsin/EDTA, penicillin/streptomicin, Dulbeccos mcxlified Eagles medium (DMEM) 등은 Gibco (USA)사 제품 human interleukin-8 EIA kit 과 human TNF a sandwich ELISA kite Chemicon (USA)사 제품을 사용하였다. 실험에 사용된 기기로서 ELISA reader는 Molecular devices (USA)사 제품, 색차계는 Minolta (Japan)사의 제품을 사용하였다.
- 각질형성세포(HaCaT, keratinocyte)는 American Type Culture Collection으로부터 구입하였고, 10% fetal bovine serum (FBS)이 첨가된 DMEM, 37℃, 5% CO2 배양기에서 배양하였다.
- '실온에서 5일간 추출한 후 300 메쉬 여과포로 여과하고, 다시 와트만 5번 여과지로 여과한 후, 회전 감압 증발기로 건조하였다. 건조된 녹두추출파우더를 50% 1, 3-부틸렌 글리콜에 용해하여 본 실험에 사용하였다.
- 과거 알레르기성 질환이나 아토피 피부염 등 진황의 병력이 없는 건강한 성인 남녀를 대상으로 하였다. 검사 전 최소 일주일 동안 경구 부신피질 호르몬제나 항히스타민제, 항염제를 복용하지 않았으며, 검사부위에 국소 부신피질 호르몬제를 바르지 않았다.
- trypsin/EDTA, penicillin/streptomicin, Dulbeccos mcxlified Eagles medium (DMEM) 등은 Gibco (USA)사 제품 human interleukin-8 EIA kit 과 human TNF a sandwich ELISA kite Chemicon (USA)사 제품을 사용하였다. 실험에 사용된 기기로서 ELISA reader는 Molecular devices (USA)사 제품, 색차계는 Minolta (Japan)사의 제품을 사용하였다. 실험에 사용된 나머지 시약들은 Sigma (USA)사 제품을 사용하였다.
- 실험에 사용된 기기로서 ELISA reader는 Molecular devices (USA)사 제품, 색차계는 Minolta (Japan)사의 제품을 사용하였다. 실험에 사용된 나머지 시약들은 Sigma (USA)사 제품을 사용하였다.
- 종대황은 서울경동시장 약재 구입상가에서 구입하였다. trypsin/EDTA, penicillin/streptomicin, Dulbeccos mcxlified Eagles medium (DMEM) 등은 Gibco (USA)사 제품 human interleukin-8 EIA kit 과 human TNF a sandwich ELISA kite Chemicon (USA)사 제품을 사용하였다.
- 화장품에 빈번히 사용되고 있는 자극물질인 락틱산(lactic acid)과 종대황추출물을 함유하는 조성물을 제조하였다(Table 1). 5.
이론/모형
- 평가 기준은 International Contact Dermatitis Research Group (ICDRG) 의 판정 기준에 따랐으며, 피부 자극 유발 가능성의 평가는 다음 계산 Figure 2. Inhibitory effects of Rheum undulatum L. extract on TNF-α release from human keratinocyte cells induced by H2O2.식으로부터 계산된 평균값으로 하였다[6, 7].
- 종대황추출물을 함유하는 조성물의 자극완화 효과를 최종적으로 평가하기 위하여 double-blind clinical usage test를 수행하였다. 21~35세의 30명의 여성 피험자를 대상으로 실시하였으며, 피험자들은 종대황추출물 함유 조성물 및 placebo를 하루에 최소 두 번,아침과 저녁에 평상시 사용 조건으로 사용하게끔 한 다음, 자극 여부 및 강도를 1일 1회씩 설문지에 작성하도록 하였다.
- 24 h 후에 첩포를 제거하고 30 min, 24 h, 그리고 48 h 후에 자극 발생 유무를 평가하였다. 평가 기준은 International Contact Dermatitis Research Group (ICDRG) 의 판정 기준에 따랐으며, 피부 자극 유발 가능성의 평가는 다음 계산 Figure 2. Inhibitory effects of Rheum undulatum L.
성능/효과
- 각 시험부위에 종대황추출물 또는/그리고 락틱산을 함유하는 O/W 에멀젼을 도포하고 3 mM methyl nicotinate를 피부에 1 min 적용하고 색차계 색차계를 이용하여 홍반 정도를 측정한 결과, O/W 에멀젼이 도포되지 않은 대조군에서는 홍반지수가 크게 상승하였다 (Figure 3). Methyl nicotinate가 처리된 여러 부위에 각각의 O/W 에멀젼을 도포하고 하였다.
- 7% 감소하였다(Figure 2). 따라서 종대 황 추출물은 각질형성세포의 과산화수소에 의해 유도되는 염증 발현사이토카인의 분비를 억제하는 효과가 우수함을 알 수 있었다.
- 또한 인체 시험에서의 피부자극 완화 효과를 시험하기 위해 methyl nicotinate 또는 락틱산으로 홍반을 유도하고, 종대황추출물 함유 O/W 에멀젼을 적용한 결과 농도 의존적으로 종대황추출물에 의해 피부 자극이 감소하였다.
- 또한 종대황추출물이 25, 50, 100 μg/mL로 첨가되었을 때 각질 형성 세포에서 생산된 TNF-α 의 수준은 각각 7.6%, 10.1%, 21.7% 감소하였다(Figure 2). 따라서 종대 황 추출물은 각질형성세포의 과산화수소에 의해 유도되는 염증 발현사이토카인의 분비를 억제하는 효과가 우수함을 알 수 있었다.
- Types of reaction examined in in-use test. 멀젼이 적용된 부위에서 홍반지수가 각각 17.2, 25.8, 31.3% 감소하여 종대황추출이 홍반에 대한 항염증 효과가 우수함을 알 수 있었다.
- 사용성시험에서도 9가지 자극에 평가 결과, 대분의 자극 항목에서 종대황추출물 함유 O/W 에멀젼에 의한 자극 완화효과가 나타났고, 전체 score 비교에 있어서도 현저한 자극 완화효과를 보였다.
- 염증 반응에서 발현 수준이 높아지는 사이토카인의 영향을 평가하기 위해 각질형성세포를 과산화수소로 자극하여 IL-8 또는 TNF-α 의 발현을 유도하고, 종대 황 추출물의 첨가 배양에 따른 영향을 시험한 결과, 종대 황 추출물에 의해 IL-8과 TNF-α의 각질형성세포로부터의 분비가 현저히 감소하였다.
- 0%까지의 종대황추출물 첨가는 추가적인 자극을 유발하지 않음을 알 수 있었다. 자극원과 자극 완화제가 함께 첨가된 #5, #6, #7의 결과에서 나타난 바와 같이 락틱산에 의한 피부 자극이 종대 황 추출물의 농도 의존적인 첨가에 비례하여 감소됨을 알 수 있었다.
후속연구
- 결론적으로, 본 연구를 통하여 자극완화효과가 있는 종대 황 추출물의 우수한 효능을 검증하였으며, 저자극 화장품 개발에 있어 종대황추출물의 활용 가치가 높을 것으로 생각된다.
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