참깨(Sesamum indicum L.)는 1년생 초본식물로서 볶은 참깨나 참기름은 우리나라 식단에서 아주 중요한 조미용 양념 및 식용유지로서 이용되고 있다. 약효로는 동맥경화, 고혈압 및 노화 예방 등으로 알려져 왔으나, 참깨에 함유되어 있는 어떤 성분이, 이들 약효에 관여하고 있는지의 과학적인 규명이 미흡한 실정이다. 본 연구에서는 천연물 유래의 새로운 노화방지제를 개발하기 위해 참깨의 리그난 화합물(sesamin, sesamol, sesaminol, sesaminol diglucosides (SDG), sesaminol triglucosides (STG))의 항염증 활성을 검색하고, 그 중에서 항염증 효과가 가장 높게 나타난 sesamin을 전처치 방법과 동시처치 방법으로 NO 생성억제효과, 세포독성, inducible nitric oxide synthase (iNOS) 및 cyclooxygenases-2 (COX-2) 발현에 미치는 영향을 탐색하고 작용기작을 규명하고자 하였다. 리그난 화합물의 NO 생성억제효과를 탐색한 결과, sesamol, sesaminol, sesamin에서 NO 생성에 미치는 억제율이 높았으나, sesamol, sesaminol은 세포독성이 나타났다. 하지만 sesamin ($IC_{50}: 64{\mu}M$)은 세포독성은 없으면서 농도의존적으로 NO 생성을 억제시켰으며, iNOS 발현에서도 억제 효과를 보여주었다. 결론적으로 sesamin은 피부노화에 원인 중 하나이며 체내 염증반응의 중요 매개인자인 NO의 생성을 억제하는 항염증 물질로서 이와 같은 연구 결과는 향후 임상에서 항염증과 관련된 새로운 항노화 전략으로 개발하기 위해 기초자료로 응응될 수 있음을 시사한다.
참깨(Sesamum indicum L.)는 1년생 초본식물로서 볶은 참깨나 참기름은 우리나라 식단에서 아주 중요한 조미용 양념 및 식용유지로서 이용되고 있다. 약효로는 동맥경화, 고혈압 및 노화 예방 등으로 알려져 왔으나, 참깨에 함유되어 있는 어떤 성분이, 이들 약효에 관여하고 있는지의 과학적인 규명이 미흡한 실정이다. 본 연구에서는 천연물 유래의 새로운 노화방지제를 개발하기 위해 참깨의 리그난 화합물(sesamin, sesamol, sesaminol, sesaminol diglucosides (SDG), sesaminol triglucosides (STG))의 항염증 활성을 검색하고, 그 중에서 항염증 효과가 가장 높게 나타난 sesamin을 전처치 방법과 동시처치 방법으로 NO 생성억제효과, 세포독성, inducible nitric oxide synthase (iNOS) 및 cyclooxygenases-2 (COX-2) 발현에 미치는 영향을 탐색하고 작용기작을 규명하고자 하였다. 리그난 화합물의 NO 생성억제효과를 탐색한 결과, sesamol, sesaminol, sesamin에서 NO 생성에 미치는 억제율이 높았으나, sesamol, sesaminol은 세포독성이 나타났다. 하지만 sesamin ($IC_{50}: 64{\mu}M$)은 세포독성은 없으면서 농도의존적으로 NO 생성을 억제시켰으며, iNOS 발현에서도 억제 효과를 보여주었다. 결론적으로 sesamin은 피부노화에 원인 중 하나이며 체내 염증반응의 중요 매개인자인 NO의 생성을 억제하는 항염증 물질로서 이와 같은 연구 결과는 향후 임상에서 항염증과 관련된 새로운 항노화 전략으로 개발하기 위해 기초자료로 응응될 수 있음을 시사한다.
Sesame (Sesamum indicum L.), one of the oldest oilseed crops, has been known to posses antioxidative and inflammatory effects. This seed contains lignan compounds such as sesamin, sesamol, sesaminol, sesaminol diglucosides (SDG), and sesaminol triglucosides (STG). Sesamin, a major lignan in sesame, ...
Sesame (Sesamum indicum L.), one of the oldest oilseed crops, has been known to posses antioxidative and inflammatory effects. This seed contains lignan compounds such as sesamin, sesamol, sesaminol, sesaminol diglucosides (SDG), and sesaminol triglucosides (STG). Sesamin, a major lignan in sesame, displayed several biological activities including a protective effects against oxidative damage in the skin. In the present study, we investigated the effect of sesamin, sesamol, sesaminol, SDG, and STG, on nitric oxide (NO) induction and inducible nitric oxide synthane (iNOS) and cyclooxygenases-2 (COX-2) expression in lipopolysaccharides (LPS)-treated RAW 264.7 cells. The results showed that sesamol and sesaminol significantly inhibited NO generation but they were also cytotoxicity however, sesamin effectively inhibited NO production ($IC_{50}: 64{\mu}M$) without my cytotoxic effect in LPS-stimulated macrophage RAW 264.7 cells. In further study, it was founded that sesamin inhibited the expression of inducible nitric oxide synthase but not COX-2 expression. These results suggest that sesamin may be useful for improvements of the inflammatory diseases.
Sesame (Sesamum indicum L.), one of the oldest oilseed crops, has been known to posses antioxidative and inflammatory effects. This seed contains lignan compounds such as sesamin, sesamol, sesaminol, sesaminol diglucosides (SDG), and sesaminol triglucosides (STG). Sesamin, a major lignan in sesame, displayed several biological activities including a protective effects against oxidative damage in the skin. In the present study, we investigated the effect of sesamin, sesamol, sesaminol, SDG, and STG, on nitric oxide (NO) induction and inducible nitric oxide synthane (iNOS) and cyclooxygenases-2 (COX-2) expression in lipopolysaccharides (LPS)-treated RAW 264.7 cells. The results showed that sesamol and sesaminol significantly inhibited NO generation but they were also cytotoxicity however, sesamin effectively inhibited NO production ($IC_{50}: 64{\mu}M$) without my cytotoxic effect in LPS-stimulated macrophage RAW 264.7 cells. In further study, it was founded that sesamin inhibited the expression of inducible nitric oxide synthase but not COX-2 expression. These results suggest that sesamin may be useful for improvements of the inflammatory diseases.
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문제 정의
NO 생성에 대한 sesamin의 억제효과가 iNOS와 COX- 2 단백질 발현 억제에 의한 것인지를 확인하기 위하여 iNOS와 COX-2에 미치는 영향을 평가하였다. Sesamin을전처치 한 후 RAW 264.
7 cells을 사용하여 LPS 로 세포를 자극하면 염증성 화학 전달 물질을 생성하는 효소인 iNOS와 COX-2와 같은 염증매개 효소와 NO와같은 염증성인자가 증강된다. 따라서, 참깨(sesame)의 리그난 화합물이 피부노화에 원인 중 하나이며 염증반응에 중요 매개인자의 일종인 NO 생성에 미치는 영향을 비교하였고, 그 작용기전으로 iNOS, COX-2 발현에 미치는 영향을 검토하여 작용기작을 규명하고자 하였다.
본 연구에서는 참깨 리그난 화합물의 항염증 효과를 탐색하기 위하여 염증 반응에서 화학전달물질을 생성하고 면역반응을 촉진하는 RAW 264.7 cells을 사용하여 LPS 로 세포를 자극하면 염증성 화학 전달 물질을 생성하는 효소인 iNOS와 COX-2와 같은 염증매개 효소와 NO와같은 염증성인자가 증강된다. 따라서, 참깨(sesame)의 리그난 화합물이 피부노화에 원인 중 하나이며 염증반응에 중요 매개인자의 일종인 NO 생성에 미치는 영향을 비교하였고, 그 작용기전으로 iNOS, COX-2 발현에 미치는 영향을 검토하여 작용기작을 규명하고자 하였다.
이에 본 연구에서는 피부노화 원인 중에 하나인 염증반응에 대한 5가지 리그난 화합물이 항염증 효과를 보이는지를 관찰하였고 그 중 가장 효과적으로 나타난 화합물인 sesamin을 선택하여 전처치 방법과 동시 처치 방법으로 NO 생성억제와 iNOS, COX-2 발현에 어떤 차이를 보이는지를 관찰하였다. 그 결과 RAW 264.
제안 방법
RAW 264.7 세포주로부터 생성된 nitric oxide (NO)의양은 세포 배양액 중에 존재하는 NQf의 형태로서 Griess 시약을 이용하여 측정하였다. 즉, 세포배양 상등액 100 μL와 Griess 시약 [0.
참깨(sesame)의 iNOS, COX-2 단백질 발현에 미치는영향을 검색하기 위하여 Western blot 분석을 실시하였다. RAW 264.
실험에 사용된 sesamin의 농도가 증가함에 따라 NO 생성도 억제되었는데 최고농도인 100 μM에서도 세포독성은 없었으며, NO 생성을 억제하는 IC50는 69 μM로 확인되었다(Figure 4A). 참깨의 리그난 화합물 중 NO 생성을 억제하면서 세포생존도의 감소도 나타내지 않았던 sesamin을 LPS와 동시처치 하여 NO 생성이 억제되는지를 실험하였다(Figure 4B). 실험결과, sesamin과 LPS를 동시에 처리하여 24 h 후에 NO를 농도의존적으로 감소하는지를 확인하였다.
참깨의 리그난 화합물 중 NO를 농도의존적으로 억제하면서 세포생존도의 감소는 나타내지 않았던 sesamin을전처치한 후 LPS를 처리하여 NO 생성이 억제되는지 실험하였다(Figure 4). 실험결과, sesamin을 처리한 24 h 후 LPS를 처리하여 24 h 후에 NO를 농도의존적으로 감소하는지를 확인하였다.
참깨의 리그난 화합물이 NO 생성을 억제시킨 것이, 리그난 화합물의 세포독성으로 인한 cell populatioii의 저하에서 기인 하였는지를 관찰하기 위하여 sesamin, sesamoi, sesaminoi, SDG, STG를 50, 75, 100 μM로 처리한 후 WST-8 assay를 실시하여 cell viability를 측정하였다 (Figure 3). Sesamin은 최저농도 50 μM에서 99%, 75 에서 94%, 그리고 100 μM에서는 98%의 세포 생존력을나타내었다(Figure 3A).
)로 2 h 동안 상온에서 반응한 후 Tris buffered saline 으로 3 번 washing하였다. 최종적으로 Western blot detection system (WEST-ZOL plus, iNtRON Biotechnology Co, Inc.)을 이용하여 단백질의 발현정도를 관찰하였다.
7 cells은 LPS 자극에 의하여 염증 신호가 전달되면 다량의 NO를 생성하며, 생성된 NO는 배지로 방출된다. 활성화된 RAW 264.7 cell을 배양하여 sesamin, sesamol, sesaminol, SDG, STG의 NO 생성억제 정도를 규명하기 위해 50, 75, 100 μM의 농도로 24 h 처리하여 배양 상층액 내의 NO 생성양을 측정하였다(Figure 2).
대상 데이터
Mouse macrophage-like cell line 인 RAW 264.7 cells 은한국세 포주연구재단에서 구입하였으며 , Dlbecco's modi fied Eagle medium (DMEM) 에 10% fetal bovine serum (FBS), 100 U/mL penicillin 및 100 μg/mL streptomycin 을 혼합한 배지를 사용하여 37℃, 5% CO2 incubator에서 배양하였다. 실험과정의 모든 cells은 80〜90%의 confluency에서 실험하였고, 20 passages를 넘기지 않은 cell만 사용하였다.
본 실험에서 사용된 참깨(Sesamm indicum L.)의 리그난 화합물은 호서대학교 식품영양학과에서 정확한 식물학적 검정을 거친 후 사용하였다. 각각의 구조식을 Figure 1에 나타내었다.
7 cells 은한국세 포주연구재단에서 구입하였으며 , Dlbecco's modi fied Eagle medium (DMEM) 에 10% fetal bovine serum (FBS), 100 U/mL penicillin 및 100 μg/mL streptomycin 을 혼합한 배지를 사용하여 37℃, 5% CO2 incubator에서 배양하였다. 실험과정의 모든 cells은 80〜90%의 confluency에서 실험하였고, 20 passages를 넘기지 않은 cell만 사용하였다.
데이터처리
모든 실험 결과는 평균 표준편차로 표기하였고 통계적 유의성은 student's t-test로 하였으며 p값이 0.05 미만일 때 통계적으로 유의하다고 판단하였다.
이론/모형
Cells were treated with 50, 75, and 100 (μM plus 1 μg/mL LPS for 24 h. Cell viability was determined by WST-8 assay system. Values are mean 土 S.
, Seongnam, Korea)으로 단백질을 추출한 후 4℃에서 12,000 rpm으로 10 min간 원심 분리하여 상등액을 취하였다. 단백질은, bovine serum albumin을 표준물질로 Bio-Rad protein assay kit (Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA)을 사용하여 Bradford 법에 따라 정량하였다. 50 g 의 단백질을 5 X SDS sample buffer에 넣고 100℃에서 5 min간 가열한 후 시료로 사용하였다.
성능/효과
7 cell은 단백질의 발현을 하지 않았다. LPS 1 μg/mL과 sesamin의 세포생존도에 영향을 미치지 않은 50, 75, 100 μM 농도에서 iNOS 단백질의 발현을 농도 의존적으로 저해하였으며 특히, 100 μM에서는 매우 효과적으로 발현을 현저하게 억제하였다. 그러나 COX-2 단백질 발현에 대해서는 감소하는 경향을 나타내지 않았다 (Figure 4C).
Sesamin은 최저농도 50 μM에서 99%, 75 에서 94%, 그리고 100 μM에서는 98%의 세포 생존력을나타내었다(Figure 3A). NO 생성억제가 세포독성으로 인한 cell population의 저하에서 기인하지 않은 것이 관찰되었다. 그러나, Sesam이은 최저농도 50 에서 58%, 75 MM에서 44%, 그리고 100 μM에서는 42%의 세포 생존력을 나타내어 NO 생성억제가 세포독성으로 인한 cell population의 저하에서 기인하였다는 .
실험결과, sesamin과 LPS를 동시에 처리하여 24 h 후에 NO를 농도의존적으로 감소하는지를 확인하였다. Sesamin 50 µM에서 37%, 75 에서 46%, 그리고 100 μM 농도에서는 58%로 모두 유의성 있게 농도의존적으로감소하는 것을 확인할 수 있었다. 실험에 사용된 sesamin 의 농도가 증가함에 따라 NO 생성도 억제되었는데 최고농도인 100 “M에서도 세포독성은 없었으며, NO 생성을억제하는 IC50는 59 μM로 확인되었다(Figure 4B).
실험결과, sesamin을 처리한 24 h 후 LPS를 처리하여 24 h 후에 NO를 농도의존적으로 감소하는지를 확인하였다. Sesamin 50 에서 13%, 75 μM에서 56%, 그리고 100 μM 농도에서는 61%로 모두 농도의존적으로 감소하는 것을 확인할 수 있었다. 실험에 사용된 sesamin의 농도가 증가함에 따라 NO 생성도 억제되었는데 최고농도인 100 μM에서도 세포독성은 없었으며, NO 생성을 억제하는 IC50는 69 μM로 확인되었다(Figure 4A).
7 cell은 단백질의 발현을 하지 않았다. Sesamin 50, 75, 100 농도에서 iNOS 단백질의 발현을 농도 의존적으로 저해하였으며 전처치, 동시처치 모두에서 동일하게 감소함을 발견하였다. 그러나 sesamin 전처치 방법에서와 같이 COX- 2 단백질 발현에 대해서는 감소하는 경향을 나타내지 않았다 (Figure 4D).
Sesamin에서 효과적으로 NO 생성을 억제시키는 것이 관찰되었는데, 자극을 하지 않은 안정 상태의 RAW 264.7cells에서는 3.4 μM의 NO가 생성되었으며, LPS로 자극된 RAW 264.7 cells은 16배 이상 증가한 19.4 의 NO가 생성되었다. Sesamin 최저 농도 50 μM에서 26%, 75 μM 에서 58%, 그리고 100 에서는 62%의 억제효과를 나타내었다(Figure 2A).
이에 본 연구에서는 피부노화 원인 중에 하나인 염증반응에 대한 5가지 리그난 화합물이 항염증 효과를 보이는지를 관찰하였고 그 중 가장 효과적으로 나타난 화합물인 sesamin을 선택하여 전처치 방법과 동시 처치 방법으로 NO 생성억제와 iNOS, COX-2 발현에 어떤 차이를 보이는지를 관찰하였다. 그 결과 RAW 264.7 cells 에서는 sesamin 전처치, 동시처치 여부에 상관없이 LPS 유도 NO 생성능은 현저히 억제되었고, 세포 생존 도에도 변화가 없음을 확인할 수 있었다. Western blot으로 분석한 결과에서는 전처치와 동시처치 sesamin에 의한 iNOS 와 COX-2 발현 억제는 NO 생성 억제와 매우 유사한 경향을 나타냄으로써 NO 생성 억제는 iNOS의 발현저해를 경유한 것임을 알 수 있었다.
참깨의 리그난 화합물 중 NO 생성을 억제하면서 세포생존도의 감소도 나타내지 않았던 sesamin을 LPS와 동시처치 하여 NO 생성이 억제되는지를 실험하였다(Figure 4B). 실험결과, sesamin과 LPS를 동시에 처리하여 24 h 후에 NO를 농도의존적으로 감소하는지를 확인하였다. Sesamin 50 µM에서 37%, 75 에서 46%, 그리고 100 μM 농도에서는 58%로 모두 유의성 있게 농도의존적으로감소하는 것을 확인할 수 있었다.
4). 실험결과, sesamin을 처리한 24 h 후 LPS를 처리하여 24 h 후에 NO를 농도의존적으로 감소하는지를 확인하였다. Sesamin 50 에서 13%, 75 μM에서 56%, 그리고 100 μM 농도에서는 61%로 모두 농도의존적으로 감소하는 것을 확인할 수 있었다.
Sesamin 50 µM에서 37%, 75 에서 46%, 그리고 100 μM 농도에서는 58%로 모두 유의성 있게 농도의존적으로감소하는 것을 확인할 수 있었다. 실험에 사용된 sesamin 의 농도가 증가함에 따라 NO 생성도 억제되었는데 최고농도인 100 “M에서도 세포독성은 없었으며, NO 생성을억제하는 IC50는 59 μM로 확인되었다(Figure 4B).
Sesamin 50 에서 13%, 75 μM에서 56%, 그리고 100 μM 농도에서는 61%로 모두 농도의존적으로 감소하는 것을 확인할 수 있었다. 실험에 사용된 sesamin의 농도가 증가함에 따라 NO 생성도 억제되었는데 최고농도인 100 μM에서도 세포독성은 없었으며, NO 생성을 억제하는 IC50는 69 μM로 확인되었다(Figure 4A). 참깨의 리그난 화합물 중 NO 생성을 억제하면서 세포생존도의 감소도 나타내지 않았던 sesamin을 LPS와 동시처치 하여 NO 생성이 억제되는지를 실험하였다(Figure 4B).
STG은 최저농도 50μM에서 81%, 75 μM에서 87%, 그리고 100 μM에서는 83%의 세포 생존력을 나타내었다(Figure 3E). 이상의 결과를 바탕으로 LPS에 의하여 생성이 증가한 NO를 농도 의존적으로 억제하면서 세포생존도의 감소는 나타내지 않은 것은 sesamin으로 확인되었다.
그러나 sesamin 전처치 방법에서와 같이 COX- 2 단백질 발현에 대해서는 감소하는 경향을 나타내지 않았다 (Figure 4D). 이상의 실험 결과를 바탕으로 sesamin에 의한 NO 생성 억제는 iNOS 단백질 발현의 조절에 의한 것임을 알 수 있었으며 sesamin에 의한 COX-2 단백질의발현 억제는 유의성이 없는 것으로 확인되었다.
그러나 LPS에 의해 형성되는 COX-2 발현 억제는 감소시키지는 못하였다. 이와 같은 연구의 결과는 RAW 264.7 cells이 LPS에 상당 시간 노출에도 sesamin에 의해 세포 생존도에는 영향을 미치지 않으면서 LPS 유도 NO 생성능을 효과적으로 억제시킬 수 있음을 시사한다.
후속연구
결론적으로 본 연구를 통하여 RAW 264.7 cells에서 sesamin 전처치와 동시처치 모두 세포 생존도에는 영향을 주지 않으면서 NO 생성억제효과와 iNOS 발현이 억제되었으며, 이와 같은 현상이 나타나는 기전에는 NF-kB 가 promoter로 작용하여 발현을 조절하는 것으로 알려져있어 앞으로 이러한 유전자의 발현 조절물질 등의 활성도 연구되어야 한다. 이와 같은 연구 결과는 향후 임상에서 항염증과 관련된 새로운 항노화 전략으로 개발하기위해 기초자료로 응용될 수 있음을 시사한다.
7 cells에서 sesamin 전처치와 동시처치 모두 세포 생존도에는 영향을 주지 않으면서 NO 생성억제효과와 iNOS 발현이 억제되었으며, 이와 같은 현상이 나타나는 기전에는 NF-kB 가 promoter로 작용하여 발현을 조절하는 것으로 알려져있어 앞으로 이러한 유전자의 발현 조절물질 등의 활성도 연구되어야 한다. 이와 같은 연구 결과는 향후 임상에서 항염증과 관련된 새로운 항노화 전략으로 개발하기위해 기초자료로 응용될 수 있음을 시사한다.
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