본 연구에서는 채진목의 항염증 효과를 알아보기 위하여 LPS로 염증을 유도한 RAW 264.7 세포에 대한 채진목 70% 에탄올 추출물의 효과를 살펴보았다. 채진목 70% 에탄올 추출물의 대식세포에서의 세포 독성 측정을 MTT assay를 수행하였다. 세포 독성을 측정한 결과, $1,000{\mu}g/mL$의 농도에서 96%의 세포 생존율을 나타내었다. 항염증 활성을 효과적으로 검증하기 위해, LPS로 유도된 대식세포 내 NO 생산을 억제하는 효과를 Griess의 방법으로 조사하였다. 그 결과, 채진목 70% 에탄올 추출물에서 NO의 생성이 농도 의존적으로 저해되었음을 확인하였다. 채진목 70% 에탄올 추출물을 western blot을 이용하여 단백질 발현을 측정한 결과 처리한 세포군에서 농도가 증가함에 따라 iNOS와 COX-2의 단백질 발현양이 감소하여 최고 농도인 $500{\mu}g/mL$에서 각각 84.3%, 56.2%의 발현 억제를 보여주었다. Reverse transcription-polymerase chain reaction (RT-PCR)을 통하여 mRNA 발현양을 측정한 결과 iNOS와 COX-2의 mRNA 발현양이 감소하여 $500{\mu}g/mL$ 농도에서 89.8%, 84.9%로 나타내었다. 이러한 결과로 보아 채진목 70% 에탄올 추출물의 항염증에 관한 그 효능을 확인할 수 있었고, 따라서 채진목 70% 에탄올 추출물이 천연 항염증 소재로써 가능성이 있다고 판단된다.
본 연구에서는 채진목의 항염증 효과를 알아보기 위하여 LPS로 염증을 유도한 RAW 264.7 세포에 대한 채진목 70% 에탄올 추출물의 효과를 살펴보았다. 채진목 70% 에탄올 추출물의 대식세포에서의 세포 독성 측정을 MTT assay를 수행하였다. 세포 독성을 측정한 결과, $1,000{\mu}g/mL$의 농도에서 96%의 세포 생존율을 나타내었다. 항염증 활성을 효과적으로 검증하기 위해, LPS로 유도된 대식세포 내 NO 생산을 억제하는 효과를 Griess의 방법으로 조사하였다. 그 결과, 채진목 70% 에탄올 추출물에서 NO의 생성이 농도 의존적으로 저해되었음을 확인하였다. 채진목 70% 에탄올 추출물을 western blot을 이용하여 단백질 발현을 측정한 결과 처리한 세포군에서 농도가 증가함에 따라 iNOS와 COX-2의 단백질 발현양이 감소하여 최고 농도인 $500{\mu}g/mL$에서 각각 84.3%, 56.2%의 발현 억제를 보여주었다. Reverse transcription-polymerase chain reaction (RT-PCR)을 통하여 mRNA 발현양을 측정한 결과 iNOS와 COX-2의 mRNA 발현양이 감소하여 $500{\mu}g/mL$ 농도에서 89.8%, 84.9%로 나타내었다. 이러한 결과로 보아 채진목 70% 에탄올 추출물의 항염증에 관한 그 효능을 확인할 수 있었고, 따라서 채진목 70% 에탄올 추출물이 천연 항염증 소재로써 가능성이 있다고 판단된다.
This study investigated the anti-inflammatory activities and cell viability of Amelanchier asiatica (A. asiatica) 70% ethanol extracts against RAW 264.7 cells induced by lipopolysaccharide (LPS). Cell toxicity test on macrophage cells (RAW 264.7) was performed by 3-[4,5-dimethyl-thiazol-2-yl]-2, 5-d...
This study investigated the anti-inflammatory activities and cell viability of Amelanchier asiatica (A. asiatica) 70% ethanol extracts against RAW 264.7 cells induced by lipopolysaccharide (LPS). Cell toxicity test on macrophage cells (RAW 264.7) was performed by 3-[4,5-dimethyl-thiazol-2-yl]-2, 5-diphenyl-tetrazoliumbromide (MTT) assay and results showed 96% cell viability at $1,000{\mu}g/mL$ concentration. Anti-inflammatory activity was examined via the inhibitory tests on the production of LPS induced NO in RAW 264.7 cells by Griess assay. The result showed that the extract inhibited NO production in concentration dependent manner. The iNOS and COX-2 protein expression inhibitory effects were confirmed by western blot and by reverse transcription-polymerase chain reaction (RT-PCR). From the former they were decreased by 84.3%, 56.2% at $500{\mu}g/mL$ concentration, respectively, and from the latter decreased by 89.8%, 84.9% at $500{\mu}g/mL$, respectively. In conclusion, this study showed the anti-inflammatory effects of A. asiatica extracts. Thus, this could be applied to an anti-inflammatory agent.
This study investigated the anti-inflammatory activities and cell viability of Amelanchier asiatica (A. asiatica) 70% ethanol extracts against RAW 264.7 cells induced by lipopolysaccharide (LPS). Cell toxicity test on macrophage cells (RAW 264.7) was performed by 3-[4,5-dimethyl-thiazol-2-yl]-2, 5-diphenyl-tetrazoliumbromide (MTT) assay and results showed 96% cell viability at $1,000{\mu}g/mL$ concentration. Anti-inflammatory activity was examined via the inhibitory tests on the production of LPS induced NO in RAW 264.7 cells by Griess assay. The result showed that the extract inhibited NO production in concentration dependent manner. The iNOS and COX-2 protein expression inhibitory effects were confirmed by western blot and by reverse transcription-polymerase chain reaction (RT-PCR). From the former they were decreased by 84.3%, 56.2% at $500{\mu}g/mL$ concentration, respectively, and from the latter decreased by 89.8%, 84.9% at $500{\mu}g/mL$, respectively. In conclusion, this study showed the anti-inflammatory effects of A. asiatica extracts. Thus, this could be applied to an anti-inflammatory agent.
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문제 정의
따라서 본 연구에서는 채진목에 대한 항염증 효과를 검증함으로써 천연 기능성 화장품 소재로서의 사용 가능성을 검토하고자 하였다.
본 연구에서는 활성산소 중 하나이며 염증 유발에 중요한 역할을 하는 것으로 알려진 NO 생성에 대한 채진목 추출물의 효과를 알아보았다. LPS 처리군은 LPS 무처리군에 비해 높은 NO 발현량을 나타내었으며 채진목 추출물을 처리한 군은 NO 발현을 감소시키는 것을 확인할 수 있었다(Figure 2).
채진목 추출물에 의한 대식세포(RAW 264.7)의 세포 생존율을 MTT assay에 의해 확인해 보았다. 채진목 추출물이 LPS로 유도된 macrophage cell의 세포 독성을 측정한 결과 1,000µg/mL의 농도에서 80% 이상의 높은 세포 생존율을 나타내었으며, 대조군인 vit.
제안 방법
Diethylpyrocarbonate (DEPC)를 50µL씩 분주하여 녹인 후 96-well plate에 RNA 5µL와 멸균수 195µL를 첨가하여 260nm, 280nm에서 각각 흡광도를 측정하여 total RNA양을 측정하였다.
iNOS, COX-2의 mRNA 발현을 알아보기 위하여 PCR을 실시하였다. PCR tube에 5X green GoTaq flexi buffer, MgCl2, PCR nucleotide mix (10 mM), primer, GoTaq DNA polymerase, nuclease free water, 합성한 cDNA를 첨가하여 잘 섞은 후 PCR을 실행하였다. GAPDH, iNOS는 96 ℃에서 2min, 96℃에서 10s, 64℃에서 30s, 72℃에서 1 min, 72℃에서 10 min (40 cycles), COX-2는 96 ℃에서 2min, 94℃에서 10s, 51℃에서 30s, 72℃에서 1min, 72 ℃에서 10min (40 cycles)을 하였다.
GAPDH, iNOS는 96 ℃에서 2min, 96℃에서 10s, 64℃에서 30s, 72℃에서 1 min, 72℃에서 10 min (40 cycles), COX-2는 96 ℃에서 2min, 94℃에서 10s, 51℃에서 30s, 72℃에서 1min, 72 ℃에서 10min (40 cycles)을 하였다. PCR로 합성시킨 후 0.002% ethidium bromide를 첨가한 1.5% agarose gel을 100Ｖ에서 40min간 전기영동한 후 LAS 4,000을 이용하여 밴드를 확인하여 분석 정량하였다.
RT-PCR에 이용한 GoScriptTM reverse tran-scription system은 Promega (USA)에서 구입하여 사용하였다. Rotary vacuum evaporator (Eyela, Japan), mi-crocentrifuge (Gyrozen, Korea), microscope (Olympus, Japan), CO2 incubator (Vision Scientific, Korea), micro-plate reader (Tecan, Austria), PCR (Astec, Japan), Davinch-ChemiTM imager CAS-400SM system (Davinch-k, Korea), UV transilluminator (Biotop, Switzerland)을 사용하였다. Mini-ProteanⓇ Tetra cell과 Mini Trans-BlotⓇ cell은 BioRad (USA)에서 구입하여 사용하였다.
iNOS, COX-2의 mRNA 발현을 알아보기 위하여 PCR을 실시하였다. PCR tube에 5X green GoTaq flexi buffer, MgCl2, PCR nucleotide mix (10 mM), primer, GoTaq DNA polymerase, nuclease free water, 합성한 cDNA를 첨가하여 잘 섞은 후 PCR을 실행하였다.
iNOS, COX-2의 활성을 확인하기 위하여 cell line RAW 264.7을 100 mm tissue culture dish에 1 × 106 cells/well로 cell seeding 후 24 h 동안 배양하여 세포를 안정화시켰다.
따라서 이하의 western blot 및 RT-PCR을 이용한 단백질 및 mRNA 발현 억제 실험은 80% 이상의 세포 생존율을 보인 50, 100, 500µg/mL의 농도에서 실험을 진행하였다(Figure 1).
염증유발 인자인 iNOS, COX-2 mRNA 발현 억제 효과를 측정하기 위하여 RT-PCR을 이용하여 실험하였다. 이때 세포의 여러 조건에서도 그 발현 정도의 차이가 거의 없는 house keeping gene인 GAPDH을 positive control로 사용하였다.
이때 세포의 여러 조건에서도 그 발현 정도의 차이가 거의 없는 house keeping gene인 β-actin을 pos-itive control로 사용하였다.
대상 데이터
Rotary vacuum evaporator (Eyela, Japan), mi-crocentrifuge (Gyrozen, Korea), microscope (Olympus, Japan), CO2 incubator (Vision Scientific, Korea), micro-plate reader (Tecan, Austria), PCR (Astec, Japan), Davinch-ChemiTM imager CAS-400SM system (Davinch-k, Korea), UV transilluminator (Biotop, Switzerland)을 사용하였다. Mini-ProteanⓇ Tetra cell과 Mini Trans-BlotⓇ cell은 BioRad (USA)에서 구입하여 사용하였다.
Western blot에 β-actin, iNOS, COX-2의 primary antibody와 goat anti-rab-bit 등의 secondary antibody는 Santa Crus (USA)에서 구입하였다. RT-PCR에 이용한 GoScriptTM reverse tran-scription system은 Promega (USA)에서 구입하여 사용하였다. Rotary vacuum evaporator (Eyela, Japan), mi-crocentrifuge (Gyrozen, Korea), microscope (Olympus, Japan), CO2 incubator (Vision Scientific, Korea), micro-plate reader (Tecan, Austria), PCR (Astec, Japan), Davinch-ChemiTM imager CAS-400SM system (Davinch-k, Korea), UV transilluminator (Biotop, Switzerland)을 사용하였다.
Western blot에 β-actin, iNOS, COX-2의 primary antibody와 goat anti-rab-bit 등의 secondary antibody는 Santa Crus (USA)에서 구입하였다.
세포 독성 측정에 사용된 MTT는 Sigma (USA)에서 구입하였으며, dimethyl sulfoxide (DMSO)는 BioShop (Canada)에서 구입하여 사용하였다.
실험에 사용된 채진목 열매는 물향기 수목원에서 채취하였으며, 으깬 시료에 시료 중량의 10배 양의 70% 에탄올을 가하여 실온에서 24 h 침지한 후 상등액과 침전물을 분리하여 동일한 방법으로 3회 반복 추출하였다. 각 시료 추출물은 여과지(Whatman No.
실험에 사용한 세포주인 RAW 264.7 cell은 한국 세포주 은행(Korea cell line bank)으로부터 구입하였으며, 세포 배양은 10% fetal bovine serum (FBS)과 1% pen-icillin/streptomycin (100 U/mL)을 첨가한 Dulbeco’s modified Eagle’s medium (DMEM) 배지를 사용하였으며, penicillin/streptomycin, trypsin은 Thermo Scientific (USA) 및 Gibco (USA)에서 구입하여 사용하였다.
데이터처리
모든 실험은 3회 반복으로 행하여 평균치와 표준편차로 나타내었고, 결과 통계처리는 SPSS10.0 (USA) software를 사용하였으며, 유의차 검증은 분산분석(analysis of variance ANOVA)을 한 후 α = 0.05 수준에서 Turkey’s HSD test에 의해 유의성을 분석하였다.
이론/모형
RAW 264.7 세포로부터 생성된 NO의 양은 Green 등의 방법[12]에 따라 Griess 시약을 이용하여 세포배양액 중에 존재하는 NO2의 형태로 측정하였다. 6-well plate에 RAW 264.
세포 생존율 측정은 Carmichael의 방법[11]에 따라 측정하였다. RAW 264.
염증유발 인자인 iNOS, COX-2 단백질 발현 억제 효과를 측정하기 위하여 western blot을 이용하여 실험하였다. 이때 세포의 여러 조건에서도 그 발현 정도의 차이가 거의 없는 house keeping gene인 β-actin을 pos-itive control로 사용하였다.
성능/효과
C와 비교하였을 때 대조군 Vit. C보다 채진목 추출물에서 iNOS와 COX-2 단백질 발현이 감소하여 우수한 억제 효과를 확인할 수 있었다(Figure 3, 4).
본 연구에서는 활성산소 중 하나이며 염증 유발에 중요한 역할을 하는 것으로 알려진 NO 생성에 대한 채진목 추출물의 효과를 알아보았다. LPS 처리군은 LPS 무처리군에 비해 높은 NO 발현량을 나타내었으며 채진목 추출물을 처리한 군은 NO 발현을 감소시키는 것을 확인할 수 있었다(Figure 2). 특히 1,000 µg/mL의 농도에서 31.
LPS에 의해 증가된 RAW 264.7세포에 채진목 추출물을 50, 100, 500µg/mL의 농도로 처리하여 mRNA 발현을 측정한 결과, iNOS와 COX-2 mRNA 발현양이 감소된 것을 확인할 수 있었으며, 500µg/mL에서 각각 89.8%, 84.9%의 발현이 억제되었음을 확인할 수 있었다(Figure 5, 6).
LPS에 의해 증가된 RAW264.7 세포에 채진목 추출물을 50, 100, 500 µg/mL의 농도로 처리하여 단백질 발현을 측정한 결과, iNOS와 COX-2 단백질 발현양이 감소된 것을 확인할 수 있었으며, 500µg/mL에서 각각 84.3%, 56.2%의 발현이 억제되었음을 확인할 수 있었다.
특히 1,000 µg/mL의 농도에서 31.4%의 저해율을 나타낸 것을 확인하였으며, 대식 세포주에서의 염증발현을 억제시키는 것에 채진목 추출물이 효과가 있음을 확인할 수 있었다.
후속연구
채진목의 경우 널리 이용되고 있지는 않지만, 동물들이 그 열매를 먹이로 이용하고 있고, 북미에서 미국 채진목은 식용, 가공품의 재료로 널리 사용되어지고 있다. Chae 등의 연구결과와 같이 채진목의 항산화 활성 및 통풍과 고혈압, 주름개선에 도움을 줄 수 있는 기능성 식품 및 기능성 화장품의 개발 가능성이 확인되었던 것으로 보아 충분히 생약또는 천연 소재로 이용 가능성이 있을 것으로 판단된다[9].
특히 각종 식물의 뿌리, 열매, 꽃, 나무껍질, 뿌리껍질, 줄기, 잎, 종자 등의 모든 부위로부터 유래된 각종 한약재의 경우 오랜 처방으로 증명된 안전성과 효능을 인정받고 있으며, 건장식품, 건강보조식품, 바이오 식품, 한방화장품 등의 월료로 다양한 제품에 사용되고 있다. 각 소재로부터 유효성분을 분리하여 생리활성을 과학적으로 검증하는 연구가 진행되어지면 보다 안전하게 피부 트러블을 완화시켜 줄 수 있는 다양한 천연 소재 개발이 활발하게 진행될 것이다[7,8].
질의응답
핵심어
질문
논문에서 추출한 답변
채진목은 무엇인가?
생리활성을 과학적으로 검증하는 연구가 진행되어지면 보다 안전하게 피부 트러블을 완화시켜 줄 수 있는 다양한 천연 소재 개발이 활발하게 진행될 것이다[7,8]. 독요나무라 불리는 장미(Rosaceae)과 식물인 채진목(A. asiatica)은 낙엽활엽관목으로 주로 북반구 온대 지역인 한국, 중국, 일본에 널리 분포하고 있으며 미국에서도 생육되고 있는 나무이다[9]. 수피는 얇고 회백색이며, 잎은 호생하고 도난(倒卵)형으로 가는 거치가 있고 처음에는 양면에 선모가 있으나 점차 없어진다.
체내에서 NO의 역할과 과잉 형성 시의 문제점은 무엇인가?
염증반응이 일어날 때 자극에 의해 과잉 생성된 염증 매개인자로 tu-mor necrosis factor-α, interleukin-1β 등과 같은 염증유도 사이토카인(proinflammatory cyrokines)의 발현을 유도하고[4], inducible nitric synthase (iNOS)와 cyclo-oxygenase-2 (COX-2)를 암호화하는 유전자의 발현을 자극시켜 nitric oxide (NO) 및 prostaglandin E2 (PEG2) 등의 염증 인자가 생성된다[5]. 일반적인 NO는 박테리아를 사멸시키거나 종양을 제거하는 중요한 역할을 하지만 NO의 과잉형성은 염증을 유발시켜 유전자를 변형시키거나 조직 및 신경의 손상을 일으킨다[6]. 현재 개발되어진 일부 합성 염증 억제제는 그 효능과 부작용이 아직 확실히 검증되지 않아 안전성 면에서 문제점이 있으며, 가격이 고가라는 한계점이 있다.
과한 염증반응은 어떤 문제를 일으키는가?
염증반응은 체내에서 여러 가지 형태의 이물질이 외부로부터 침입하였거나 조직이 감염되어 생긴 물리적, 화학적 자극의 피부 손상을 방어하기 위하여 반응하는 현상을 말한다. 하지만 이러한 생체 방어 반응이 과잉으로 일어나면 염증 조직 주위에 있는 정상 조직을 손상시켜 염증질환을 일으킨다[3]. 염증반응이 일어날 때 자극에 의해 과잉 생성된 염증 매개인자로 tu-mor necrosis factor-α, interleukin-1β 등과 같은 염증유도 사이토카인(proinflammatory cyrokines)의 발현을 유도하고[4], inducible nitric synthase (iNOS)와 cyclo-oxygenase-2 (COX-2)를 암호화하는 유전자의 발현을 자극시켜 nitric oxide (NO) 및 prostaglandin E2 (PEG2) 등의 염증 인자가 생성된다[5].
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