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문제 정의
- acnes 에 의해 유발된 염증이 생겼을 경우에 이차감염을 일으켜 증상을 악화시키는 것으로 알려져 있다. 관중 crude 추출물 및 헥산 분획물은 호기성 균주들에도 역시 강한 항균활성을 나타내는 것으로 보고되고 있기 때문에[17], 이들 추출물 및 분획물을 여드름 억제 및 치료를 위한 목적으로 사용하게 되면 p. acnes에 의한 염증 억제 효과 및 Staphylococci에 의한 이차 감염 억제 효과까지도 기대할 수 있을 것으로 사료된다.
- 관중 추출물이 온도 및 pH의 변화에 안정성이 있는지를 확인하여 보았다. 다양한 범위로 온도(25, 70, 80, 90, 100, 121℃)나 pH (2 〜 11)를 변화시켜서 시료를 반응시킨 후, paper disk diffusion 법에 의해 항균활성을 측정한 결과, 이들 추출물은 온도(Table 5) 및 pH (Table 6)의변화에 높은 안정성을 보여주는 것으로 나타났으며 이 결과는 관중 추출물이 화장품 원료로 개발할 수 있을 것으로 여겨진다.
- 본 연구에서는 여드름 생성에 중요한 역할을 하는 P. acnes에 대한 항균 활성물질을 탐색하기 위하여 예로부터 민간 의학 및 한방 약재로서 사용되어 온 관중을 이용하여 P.acnes에 대한 항균 활성을 평가하여 보았다.
- 본 연구에서는 일부 세균에 대해 우수한 항균 효능을 갖고 있는 것으로 밝혀진 관중 crude 추출물이 여드름 억제 효능을 갖는 화장품 원료로 사용할 수 있는지의 가능성을 조사하고자 하였다. 여드름 생성의 중요인자인 P.
제안 방법
- 변형하여 수행하였다. P. acnes 균주를 RC 액체배지에서 3일간 배양하여 활성화 시킨 후, McFarland standard 0.5의 값으로 조절하여 약 1.5 × 108 bacterial cells/mL이 되도록 배양 배지를 이용하여 희석하였다. 희석한 균액을 배양 배지 160 ㎍가 들어 있는 96-well plate의 각 well에 20 μL, 씩 접종해 주었다.
- kr)에서 분양받아 사용하였다. P. acnes reinforced clostridial (RC)배지(Merck. Gmnany)에서 배양하였으며, P. ames는 master plate를 만들어 4℃에 보관하면서 실험 3일전에 활성화시켰다, 균을 RC 배지에 접종한 후, anaerobic jar에서 Gaspack system (Merck. Anaerocult® Gaspack system, Germany)을 이용하여 밀봉하고 37℃ incubator에서 3일 동안 혐기성 배양하였다.
- P. acnes에 대해 강한 항균 활성을 나타내는 관중 crude 추출물 및 헥산분획물에 대해 2배수 희석법에 의한 최소억제농도(MIC)를 평가하였으며, 양성대조군은 triclosan을 사용하였다. Table 4에서 보는 것처럼 각 시료들이 P.
- Paper disk diffusion 방법으로 관중 crude 추출물 및 헥산 분획물을 염증성 여드름 생성에 있어서 가장 중요한 역할을 하는 P. acnes에 적용시켜 항균 활성을 평가하였으며, 양성대조군으로는 triclosan을 사용하였다. P.
- acnes에 대한 triclosan, 관중 crude 추출물 및 헥산 분획물의 증식 억제 효과를 killing curve assay를 이용하여 수행하였다. Triclosan 및 관중 crude 추출물 및 헥산 분획물을 일정한 농도별(1.9 〜 15.6 ㎍/mL)로 RC 배지에 첨가하고, P. acnes 균을 접종하여 3일간 배양하면서 12 h 간격으로 균주의 생장 정도를 측정하여 triclosan, 관중 crude 추출물 및 헥산 분획물의 P. acnes에 대한 억제 효과를 평가하였다. 음성대조군으로는 P.
- 625 〜 500 ㎛/disk씩 흡수시켰다. 각 시료가 처리된 RC agar plate를 anaerobic jar에서 Gaspack system을 이용하여 3일간 배양한 후, disk 주위의 생육 억제환의 크기로 항균활성을 측정하였다. 양성 대조군으로는 현재 여드름 균에 대한 항생제로 사용하고 있는 triclosan에 대해 같은 방법으로 효능을 비교하였다.
- 관중 crude 추출물을 10 mg/mL의 농도로 DMSO에 녹인 후 1.5 mL microfuge tube 에 넣어 주고, 25, 70, 80, 90, 100℃의 항온수조에서 70 min간, autoclave (121℃)에서 15 min간 정치한 후 이들 시료를 이용하여 paper disk diffusion method를 수행하였다.
- 관중 crude 추출물을 10 mg/mL의 농도로 DMSO에 녹인 후, 15 mL conical tube에 넣어주고 pH를 2 〜 11의 범위로 조절하여 30 min간 정치한 후 다시 원래의 시료의 pH인 5.4로 되돌린 것을 시료로 하여, paper disk dif-fusion method를 수행하였다.
- 관중 에탄올 주줄물을 냉각콘덴서가 달린 증류장치를 이용하여 47℃에서 증발되어 나오는 용매를 회수하면서 rotary vacuum evaporator에서 농축하여 분말 형태로 시료를 얻었다. 이를 둥근 바닥 플라스크에 넣고 증류수로 채워 잘 섞어서 완전히 용해시켜 수용액을 만든 다음, 이 용액을 분별깔때기에 넣고 동량의 헥산(n-hexane)을 첨가하였다.
- 혐기성배양을 위하여 Anaerocult® Gaspack system을 이용하여 37℃ incubator에서 배양하면서 12 h 간격으로 흡광 값을 측정하여 배양 시간의 경과에 따른 농도별. 균 생장 억제 정도를 측정하였다.
- 5 mL 접종하고 4 mL의 RC 액체배지를 넣어주었다. 균액이 접종된 각 tube에 음성대조군으로는 시료가 첨가되지 않은 DMSO를 넣어주고 시험군에는 DMSO에 희석된 관중 crude 추출물 및 헥산 분획물의 최종 농도가 1.9 〜 15.6 ㎍/mL 되도록 첨가해 주었으며, 양성대조군으로는 triclosan을 사용하였다. 혐기성배양을 위하여 Anaerocult® Gaspack system을 이용하여 37℃ incubator에서 배양하면서 12 h 간격으로 흡광 값을 측정하여 배양 시간의 경과에 따른 농도별.
- 5 mL을 참가하여 RC agar plate에 접종해 주었다. 균액이 포함된 RC 배지가 plate 표면에서 굳은 후, paper disk (∅ 8 mm, Adeventec, USA)를 균주를 접종한 plate 표면 위에 올려놓고, 각 시료를 DMSO를 이용하여 농도별로 희석하여 disk 당 최종 농도를 15.625 〜 500 ㎛/disk씩 흡수시켰다. 각 시료가 처리된 RC agar plate를 anaerobic jar에서 Gaspack system을 이용하여 3일간 배양한 후, disk 주위의 생육 억제환의 크기로 항균활성을 측정하였다.
- 미생물 생육 억제 정도는 killing curve assay를 일부 변형하여 수행하였다. p.
- 각 시료가 처리된 RC agar plate를 anaerobic jar에서 Gaspack system을 이용하여 3일간 배양한 후, disk 주위의 생육 억제환의 크기로 항균활성을 측정하였다. 양성 대조군으로는 현재 여드름 균에 대한 항생제로 사용하고 있는 triclosan에 대해 같은 방법으로 효능을 비교하였다.
- DMSO에 녹인 관중 crude 추출물 및 헥산 분획물(20 mg/mL)을 RC 액체 배지를 이용하여 2배수씩 희석(two-fold serial dilu-tion)하여 농도별로 균주와 배지가 들어있는 96-well plate에 20 μL씩 넣어 주고 잘 섞어 주었다. 음성대조군으로 시료가 들어 있지 않은 DMSO를 사용하여 시료를 용해하는데 사용한 DMSO의 영향을 함께 평가해 주었으며, 양성대조군으로는 triclosan을 사용하였다. 희석한 균액 및 시료를 접종한 96-well plate# Anaerocult® Gaspack system을 이용하여 3일간, 37℃ incubator에서 배양한 후 균의 생육이 나타나지 않는 최소 농도를 MIC로 결정하였다.
- 6 ㎍/mL 되도록 첨가해 주었으며, 양성대조군으로는 triclosan을 사용하였다. 혐기성배양을 위하여 Anaerocult® Gaspack system을 이용하여 37℃ incubator에서 배양하면서 12 h 간격으로 흡광 값을 측정하여 배양 시간의 경과에 따른 농도별. 균 생장 억제 정도를 측정하였다.
- 음성대조군으로 시료가 들어 있지 않은 DMSO를 사용하여 시료를 용해하는데 사용한 DMSO의 영향을 함께 평가해 주었으며, 양성대조군으로는 triclosan을 사용하였다. 희석한 균액 및 시료를 접종한 96-well plate# Anaerocult® Gaspack system을 이용하여 3일간, 37℃ incubator에서 배양한 후 균의 생육이 나타나지 않는 최소 농도를 MIC로 결정하였다.
대상 데이터
- Propionibacterium acnes KCTC3314를 한국생명공학연구원의 유전자 은행(Korean collection for type cultures, http://kctc.kribb.re.kr)에서 분양받아 사용하였다. P.
- 한국생 명 공학연구원의 한국식 물추출물은행 (http://extract.pdrc.re.kr)에서 95% ethanol을 사용하여 추출한 관중 crude extract를 구입하여 실험에 사용하였다.
- 한국세포주은행 (Korean cell line bank, http://cellbank.snu.ac.kr)에서 분양받은 human keratinocyte-like cell line인 HaCaT 세포를 10% fetal bovine serum (FBS, Hyclone, USA)이 함유된 DMEM (Dulbecco's modified Eagle's medium, GibcoBRL, USA)을 이용하여 37℃, 5% CO2 조건에서 배양하였다.
이론/모형
- P. acnes에 대한 triclosan, 관중 crude 추출물 및 헥산 분획물의 증식 억제 효과를 killing curve assay를 이용하여 수행하였다. Triclosan 및 관중 crude 추출물 및 헥산 분획물을 일정한 농도별(1.
- 관중 crude 추출물 및 헥산 분획물에 대한 항균 활성 평가는 paper disk diffusion 법을 적용하였다. P.
- 관중 crude 추출물에 대한 독성평가는 human kera-tinocyte-like cell line인 HaCaT 세포주를 사용하여 MTT assay를 수행하였다. Figure 4에서 보는 바와 같이 시료 농도가 저농도인 10 ㎍/mL 이하의 농도에서는 거의 독성을 보이지 않았으나 20 ㎍/mL의 농도에서는 약 5 〜 10% 정도의 세포치사율을 보이기 시작하였으며, 30 ㎍/mL에서 30%, 40 ㎍/mL에서 50%의 치사율을 보였으며 50 ㎍/mL의 농도에서는 거의 대부분의 세포들이 사멸하는 것을 알 수 있었다.
성능/효과
- acnes에 적용시켜 항균 활성을 평가하였으며, 양성대조군으로는 triclosan을 사용하였다. P. acnes에 대한 관중 crude 추출물(Table 1) 및 헥산 분획물(Table 2)의 항균 활성은 강하게 나타났으며 특히 헥산 분획물은 양성대조군으로 사용한 triclosan (Table 3)과거의 비슷한 활성이 있음을 확인할 수 있었다.
- Table 2에서 보는 것처럼 실험에 사용한 관중의 헥산 분획물이 15.6 ㎍/disk 농도에서도 양성대조군인 triclosan의 비슷한 항균 활성을 보였으며, 농도의존적으로 활성이 증가하는 것을 확인할 수 있었다. 헥산 분획물의 항균 효과가 우수한 것은 항균 작용을 하는 유효 성분들이 1차 분획 용매인 헥산층에서 모두 용출되었기 때문인 것으로 여겨지며, 클로로포름 등 2차 분획 용매에서는 이미 헥산층에서 대부분이 용출되었기 때문에 항균 효능이 약한 것으로 추정할 수 있다.
- acnes에 대해 강한 항균 활성을 나타내는 관중 crude 추출물 및 헥산분획물에 대해 2배수 희석법에 의한 최소억제농도(MIC)를 평가하였으며, 양성대조군은 triclosan을 사용하였다. Table 4에서 보는 것처럼 각 시료들이 P. acnes의 생장을 억제하는 최소농도는 양성대조군인 triclo-san은 4 ㎍/mL, 관중 crude 추출물은 8 ㎍/mL, 그리고 헥산 분획믈은 0.9 ㎍/mL으로 측정되었으며, 따라서 이들 농도들이 각 시료들의 MIC (IC50)임을 확인하였다.
- Figure 4에서 보는 바와 같이 시료 농도가 저농도인 10 ㎍/mL 이하의 농도에서는 거의 독성을 보이지 않았으나 20 ㎍/mL의 농도에서는 약 5 〜 10% 정도의 세포치사율을 보이기 시작하였으며, 30 ㎍/mL에서 30%, 40 ㎍/mL에서 50%의 치사율을 보였으며 50 ㎍/mL의 농도에서는 거의 대부분의 세포들이 사멸하는 것을 알 수 있었다. Triclosan의 경우에는 약 5 ㎍/mL에서 50%의 치사율을 보였으며, 10 ㎍/mL의 농도에서는 모든 세포들이 사멸하는 것을 확인하였다(data not shown).
- 관중 crude 추출물 및 헥산 분획물의 P. acnes 균에 대한 최소억제농도 평가에서 우수한 효능이 있음을 알 수 있는데, 양성대조군으로 사용한 triclosan과 거의 비슷한 억제 효과가 있음을 확인하였다. 앞서 언급한 바와 같이 다양한 세균들이 피부에 상재하고 있는데 그중 호기성 피부 상재 균주의 주된 종류인 Staphylococci들은 여드름의 염증 반응을 일으키는데 있어서 중요한 역할을 하지 못하는 것으로 알려져 있다[18].
- ames의 생장을 강하게 억제하는 것을 확인하였으며, HaCaT 세포를 이용한 세포독성 실험에서도 20 ㎍/mL 이하의 농도에서는 독성이 거의 나타나지 않았다. 관중 crude 추출물 및 헥산 분획물의 온도, pH 안정성을 평가한 결과 25, 70, 80, 90, 100, 121℃ 등 다양한 온도 조건과 pH 2 〜 pH 11의 변화에 있어서도 그 효능이 변하지 않고 안정된 상태로 유지되는 것으로 관찰되었다.
- 관중 crude 추출물 및 헥산 분획을 이용한 paper disk diffusion법에서 P. acnes에 대해 높은 항균활성을 보였으며, P. acnes에 대한 MIC 값은 0.008 mg/mL 및 0.001 mg/mL로 측정되었으며, 시료가 관중에 대한 crude 추출물 및 헥산 분획임을 고려하면 매우 항균활성이 높은 것으로 평가되었다. 저농도 범위(2 〜 15 ㎍/mL)에서도 P.
- 양성대조군인 triclosan을 처리하여 보면 4 ㎍/mL 이하의 저농도에서는 약 60 h 배양 후에도 균이 증식하였지만 7 ㎍/mL 이상의 농도에서는 균의 증식이 완전히 억제되는 것을 확인하였다(Figure 1). 관중 crude 추출물은 시료를 농도별로 처리하여 보면 약 15 ㎍/mL의 농도에서는 균의 증식이 억제되었으며(Figure 2), 헥산분획에서는 2 ㎍/mL의 저농도에서도 균의 생육이 억제되는 것을 확인 할 수 있었다(Figure 3).
- 이를 둥근 바닥 플라스크에 넣고 증류수로 채워 잘 섞어서 완전히 용해시켜 수용액을 만든 다음, 이 용액을 분별깔때기에 넣고 동량의 헥산(n-hexane)을 첨가하였다. 두 용매 사이에 emulsion이 생기는 것을 줄이기 위하여 포화 식염수를 넣어주고, 헥산층에 물질이 충분히 추출될 수 있도록 잘 흔들어 주었다. 이를 수회 반복하여 헥산층을 분리, 회수한 다음 회전 감압 농축기를 이용하여 용매를 완전히 제거하여 분말형태로 회수하고 DMSO에 녹인 후 필요한 실험에 사용하였다.
- acnes에 대한 강한 항균 활성을 갖고 있기 때문에 여드름 치료를 위한 therapeutic agent에 적용할 수 있는 가능성을 갖고 있음을 언급하였지만, 이들을 therapeutic agent로서 인체 피부에 적용했을 때 피부 세포에 독성을 나타내지 말아야 할 것이다. 따라서 관중 crude 추출물이나 헥산 분획물들이 인간유래 피부 세포에 독성이 있는가를 확인하여본 결과 일정 농도에서는 전혀 독성을 나타내는 것을 알 수 있었다. 즉 약 20 ㎍/mL 이하의 농도에서는 전혀 독성을 나타내지 않았는데, 그 농도에서의 P.
- 본 연구 결과에서 보는 것처럼 관중 crude 추출물이나 헥산 분획물은 적은 농도 범위(2 〜 152 ㎍/mL) 내에서도 장시간 P. acnes 균의 생장을 억제하는 것을 확인할 수 있었다. 따라서 이들을 사용하여 여드름 생성 억제 및 예방의 목적으로 사용하기 위한 화장품 등 다양한 제품의 원료로 사용한다면, 일반적인 항생제의 처리에 의해 얻게 되는 항균효과보다 더 좋은 효과를 얻을 수 있을 것으로 기대된다.
- acnes균을 섞어서 측정하였는데, 이들 대조군 모두 배양 10 h 후부터 균이 기하급수적으로 증식하기 시작하였으며, 약 40 h 배양하면 대수기(log phase)에 도달하는 것을 관찰할 수 있었다. 양성대조군인 triclosan을 처리하여 보면 4 ㎍/mL 이하의 저농도에서는 약 60 h 배양 후에도 균이 증식하였지만 7 ㎍/mL 이상의 농도에서는 균의 증식이 완전히 억제되는 것을 확인하였다(Figure 1). 관중 crude 추출물은 시료를 농도별로 처리하여 보면 약 15 ㎍/mL의 농도에서는 균의 증식이 억제되었으며(Figure 2), 헥산분획에서는 2 ㎍/mL의 저농도에서도 균의 생육이 억제되는 것을 확인 할 수 있었다(Figure 3).
- 조사하고자 하였다. 여드름 생성의 중요인자인 P. acnes에 대한 항균 활성 효능을 검토하였으며, 이들 추출물이 P. acnes에 의해 생성된 여드름 억제제로서 우수한 효능이 있음을 확인하였다.
- acnes에 대한 억제 효과를 평가하였다. 음성대조군으로는 P. ames균과, 시료를 희석할 때 사용한 DMSO와 P. acnes균을 섞어서 측정하였는데, 이들 대조군 모두 배양 10 h 후부터 균이 기하급수적으로 증식하기 시작하였으며, 약 40 h 배양하면 대수기(log phase)에 도달하는 것을 관찰할 수 있었다. 양성대조군인 triclosan을 처리하여 보면 4 ㎍/mL 이하의 저농도에서는 약 60 h 배양 후에도 균이 증식하였지만 7 ㎍/mL 이상의 농도에서는 균의 증식이 완전히 억제되는 것을 확인하였다(Figure 1).
- 001 mg/mL로 측정되었으며, 시료가 관중에 대한 crude 추출물 및 헥산 분획임을 고려하면 매우 항균활성이 높은 것으로 평가되었다. 저농도 범위(2 〜 15 ㎍/mL)에서도 P. ames의 생장을 강하게 억제하는 것을 확인하였으며, HaCaT 세포를 이용한 세포독성 실험에서도 20 ㎍/mL 이하의 농도에서는 독성이 거의 나타나지 않았다. 관중 crude 추출물 및 헥산 분획물의 온도, pH 안정성을 평가한 결과 25, 70, 80, 90, 100, 121℃ 등 다양한 온도 조건과 pH 2 〜 pH 11의 변화에 있어서도 그 효능이 변하지 않고 안정된 상태로 유지되는 것으로 관찰되었다.
후속연구
- 관중 crude 추출물 및 헥산 분획물은 호기성 균주들에도 역시 강한 항균활성을 나타내는 것으로 보고되고 있기 때문에[17], 이들 추출물 및 분획물을 여드름 억제 및 치료를 위한 목적으로 사용하게 되면 p. acnes에 의한 염증 억제 효과 및 Staphylococci에 의한 이차 감염 억제 효과까지도 기대할 수 있을 것으로 사료된다.
- 확인하여 보았다. 다양한 범위로 온도(25, 70, 80, 90, 100, 121℃)나 pH (2 〜 11)를 변화시켜서 시료를 반응시킨 후, paper disk diffusion 법에 의해 항균활성을 측정한 결과, 이들 추출물은 온도(Table 5) 및 pH (Table 6)의변화에 높은 안정성을 보여주는 것으로 나타났으며 이 결과는 관중 추출물이 화장품 원료로 개발할 수 있을 것으로 여겨진다.
- acnes에 대한 항균 활성 역시 강한 것으로 확인되었기 때문에 관중 crude 추출물이나 헥산 분획물을 인체에 적용하는 데는 전혀 문제가 없을 것으로 사료된다. 따라서 관중 crude 추출물이나 헥산 분획물은 triclosan처럼 항균 효과를 포함하는 화장품 등에 우수한 active ingradient로써 사용할 수 있으며, 또한 여드름 치료 및 억제를 위한 topical therapeutic agents로서 적용할 수 있을 것으로 기대된다. 뿐만 아니라 이들에 대한 안전성 등 여러 조건들을 보다 더 충족시켜 주기 위해서는 앞으로 동물실험, patch test 등 다양한 실험이 계속 되어져야 할 것으로 여겨진다.
- acnes 균의 생장을 억제하는 것을 확인할 수 있었다. 따라서 이들을 사용하여 여드름 생성 억제 및 예방의 목적으로 사용하기 위한 화장품 등 다양한 제품의 원료로 사용한다면, 일반적인 항생제의 처리에 의해 얻게 되는 항균효과보다 더 좋은 효과를 얻을 수 있을 것으로 기대된다.
- 따라서 관중 crude 추출물이나 헥산 분획물은 triclosan처럼 항균 효과를 포함하는 화장품 등에 우수한 active ingradient로써 사용할 수 있으며, 또한 여드름 치료 및 억제를 위한 topical therapeutic agents로서 적용할 수 있을 것으로 기대된다. 뿐만 아니라 이들에 대한 안전성 등 여러 조건들을 보다 더 충족시켜 주기 위해서는 앞으로 동물실험, patch test 등 다양한 실험이 계속 되어져야 할 것으로 여겨진다.
- 이상의 결과에서 알 수 있듯이 관중 추출물은 여드름생성 관련 병인 중의 하나인 P. czmes에 대한 억제 및 치료제에 관련된 기능성 화장품 원료 및 topical therapeutic agents로서의 개발 가능성이 높은 것으로 기대된다.
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