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문제 정의
- 하지만, direct PCR에 의해 Actinobacillus actionmycetemcomitans 균주 10마리까지 검줄할 수 있는 PCR 프라이머가 보고⑼된 점을 고려하면, nested PCR에 의해서는 균 주 1마리까지 검출할 수 있을 것으로 생각된다. 그러므로, 본 연구는 Sato 등(16-18)의 것보다 민감도가 뛰어난 프라이머 쌍을 개발하고자 한다. 본 연구에서 개발된 프라이머 쌍은 치아우식증 과 S.
- 본 연구에서 설계된 ChDC-SmF2와 ChDC-SmR2 프라이머 쌍의 결합 온도 한계를 알아보기 위해 gradient PCR을 시행하였다. 그 결과 7CTC에서도 원하는 크기의 PCR 산물이 증폭되었다
제안 방법
- ChDC-SmF2와 ChDC-SmR2 프라이머 쌍만을 이용한 direct PCR과 대부분의 세균 종의 16S rDNA를 증폭할 수 있는 27F와 1492R을 이용하여 S. mutans ATCC 25175T의 16S rDNA를 증폭하고, 이 증폭물을 10배 희석한 후 ChDC-SmF2와 ChDC- SmR2 프라이머 쌍을 이용한 nested PCR로 각각의 민감도 (sensitivity)를 측정하였다. 이때 S.
- 5% Bacto agar (Difco * Diagnostics) 첨가하여 만든 TH agar에 접종하여 37℃ 세균배양기(Moel 311, ThermoForma, Marietta, USA)에서 24시간 배양하여 사용하였다. F. nucleatum 균주는 Schaedler broth (Difco Diagnostics)에, A. actinomycetemcomitans 균주들은 Trypticase Soy Broth (TSB, Difco Diagnostics)에 0.6% yeast extract (Difco Diagnostics), 5% horse serum (Difco Diagnostics), 75 ㎍/ml bacitracin (Sigma Chemical Co., St. Louis, USA) 및 5 |ig/ml vancomycin (Sigma Chemical Co.)이 첨가된 배지에, 그리고 Prevotella intermedia 및 Prevotella nigrescens 균주들은 TSB에 0.5% yeast extract, 0.05% cysteine HCl-H2O, 0.5 mg/ml hemin 및 2 ㎍/ml vitamin K1이 첨가된 배지에 접종하여 85% N2, 10% CO2 , 5% H2가 공급되는 37℃ 혐기성 세균배양기에서 1-2일간 배양하여 다음 실험에 사용하였다.
- Lim 등(11)의 연구에서 세균배양법에 의한 S. mutans 검출에 사용되었던 치면세균막 샘플을 이용하여, 본 연구에서 개발된 프라이머 쌍의 효용성을 알아보았다. Lim 등(11)의 연구에서 S.
- 이때 결합 온도는 55℃-70℃ 사이를 12 단계로 나누어 시행하였다. PCRe AccuPower6 PCR PreMix (Bioneer Corp.)와 Peltier thennal cycler (Model PTC-200 DNA engine™, MJ Research Inc., Watertown, USA)를 이용하여 시행하였다. AccuPoweie PCR PreMix에는 5 nmole씩의 4가지 deoxynucleotide triphosphate, 0.
- mutans ATCC 25175T 유전체 DNA는 2 ng에서 2 fg까지 10배씩 순차적으로 희석하여 사용하였다. PCRe 전술한 바와 같이 AccuPower® PCR PreMix (Bioneer Corp)와 PTC-200 DNA engine™ (MJ Research Inc.)을 이용하여 시행하였다.
- 먼저 결합 온도의 최대 한계를 알아보기 위하여 gradient PCR을 시행하였다. 이때 결합 온도는 55℃-70℃ 사이를 12 단계로 나누어 시행하였다.
- 앞에서 설계된 S. mutans 검출 및 동정을 위한 프라이머 쌍의 종-특이성을 알아보기 위하여, Table 1과 같이 S. mutans 표준균 주(ATCC 25175t) 및 한국인에서 분리 동정된 10균주를 포함하여 이와 유전학적으로 가장 가까운 4종의 뮤탄스 연쇄상구균의 표준균주들과 3종의 구강 내 다른 연쇄상구균의 표준균주 및 4 종의 혐기성 세균의 표준균주 유전체 DNA를 주형으로 하여 PCR을 시행하였다.
- 03 mole의 MgCl2 그리고, 1 unit의 Taq DNA polymerase가 들 어있다. 여기에 2 ng의 세균 유전체 DNA와 20 pmoles씩의 ChDC-SmF2와 ChDC-SmR2 각각의 프라이머를 넣고 PCR을 시행하였다. 이때 PCR 조건은 다음과 같았다.
- mutans 특이적 PCR 프라이머 쌍을 설계하여 ChDC-SmF2와 ChDC-SmR2로 명명하였다 (Table 2). 이때 설계된 프라이머 쌍은 Probe Match 프로그램 (http://rdp8.cme.msu.edu/html/analyses.html)을 이용하여 종-특이성을 분석하였고, Bioneer사(Daejeon, Korea)에 의뢰하여 프라이머 쌍을 제작하였다. 예상되는 PCR 증폭물의 크기는 356 bp이다 (Fig.
- rattus에서 비 특이적 PCR 산물이 증폭되었다. 이러한 결과를 바탕으로, 본 연구에서 ChDC-SmF2와 ChDC- SmR2 프라이머 쌍을 이용한 PCR에서는 7이에서 시행하였다.
- cricetus의 16S rRNA 핵산염기서열을 얻었다. 이를 MegAlign 컴퓨터 프로그램(Lasergse, DNASTAR Inc., Madison, USA)을 이용하여 상동성을 분석하였고, S. mutans 16S rDNA 염기서열을 바탕으로 하고, PrimerSelect 프로그램 (DNASTAR Inc.)을 이용하여 S. mutans 특이적 PCR 프라이머 쌍을 설계하여 ChDC-SmF2와 ChDC-SmR2로 명명하였다 (Table 2). 이때 설계된 프라이머 쌍은 Probe Match 프로그램 (http://rdp8.
- mutans7\ 분리 동정된 치면세균막 샘플을 direct DNA 추출법(10)에 의해 세균 유전체 DNA를 추출하였다. 전술한 nested PCR 법에 의해 치면세균막 샘플 내의 S. mwans의 존재 유무를 확인하였다.
- , Tokyo, Japan)하였다. 증폭물은 ethidium bromide (Sigma Chemical Co, )로 염색하여 UV transilluminator (TFX-20.M, Vilber Lourmat, Marine la Wllee, France)로 발색시켜 크기를 확인하였다.
- 이때 PCR 조건은 다음과 같았다. 초기 변성은 94℃ 에서 5분간 시행하였고, 변성 (94℃, 30분), 결합 (55℃-70℃, 30 초) 및 신장 (72℃, 30초)의 세 과정을 32회 반복하고, 추가적인 중합(72 ℃, 30초)을 10분간 시행하였다.
대상 데이터
- 본 연구에 이용한 세균 균주들은 Table 1과 같다. 이들 균주들은 American Type Culture Collection (ATCC, University Boulevand, Manassas, USA) 또는 Korean Collection for Type Cultures (KCTC, Daejeon, Korea)에서 구입하거나 한국인의 치면세균막에서 분리 및 동정하였다. 이들 세균들 중 연쇄상구균들과 포도상구균은 Todd Hewitt broth (TH broth, Difco Diagnostics, Detroit, USA) 또는 TH broth에 1.
- 이들 균주들은 American Type Culture Collection (ATCC, University Boulevand, Manassas, USA) 또는 Korean Collection for Type Cultures (KCTC, Daejeon, Korea)에서 구입하거나 한국인의 치면세균막에서 분리 및 동정하였다. 이들 세균들 중 연쇄상구균들과 포도상구균은 Todd Hewitt broth (TH broth, Difco Diagnostics, Detroit, USA) 또는 TH broth에 1.5% Bacto agar (Difco * Diagnostics) 첨가하여 만든 TH agar에 접종하여 37℃ 세균배양기(Moel 311, ThermoForma, Marietta, USA)에서 24시간 배양하여 사용하였다. F.
성능/효과
- ChDC-SmF2와 ChDC-SmR2 프라이머 쌍의 효능성을 검증하기 위하여 S. mutans 배양에 성공한 치면세균막 샘플에서 nested PCR을 시행한 결과, 모든 샘플에서 S. mutans 종-특이 PCR 산물이 증폭되었다(Fig. 6과 Table 3).
- GenBank의 데이터베이스에서 S. mutans, S. sobrinus, S. downei, S. rattus 및 S. cricetus의 16S rRNA 핵산염기서열을 얻었다. 이를 MegAlign 컴퓨터 프로그램(Lasergse, DNASTAR Inc.
- 와 유전학적으로 가장 가까운 5. rattuse 포함한 다른 뮤탄스 연쇄상구균들의 유전체 DNA와 구별할 수 있는 뛰어난 특이도를 가지고 있었다. 이는 최근 Sato 등(17, 18)에 의해 개발된 nested PCR보다 민감도가 50배 높은 것이다.
- 본 연구에서 설계된 ChDC-SmF2와 ChDC-SmR2 프라이머 쌍의 결합 온도 한계를 알아보기 위해 gradient PCR을 시행하였다. 그 결과 7CTC에서도 원하는 크기의 PCR 산물이 증폭되었다
- 4). 대부분의 균종 16S rDNA를 증폭할 수 있는 27F와 1492R 프라이머 쌍으로 PCR (direct PCR)을 시행한 후, 그 PCR 산물을 주형으로 이용하여 ChDC-SmF2와 ChDC-SmR2 프라이머 쌍으로 PCR(nested PCR)을 시행한 결과 S. mutans ATCC 25175T 유전체 DNA 2 fg까지 검출 할 수 있었다(Fig.5).
- 본 연구에서 설계된 ChDC-SmF2와 ChDC-SmR2의 S. mutans에 대한 종-특이성을 S mutanse 표준균주 및 임상분리균주들과 더불어 구강 내 존재하는 연쇄상구균(S downei, S. rattus, S. mitis, S. cricetus, S. anginosus, S. thermophilus), 포도상구균 (Staphylococcus aureus) 및 혐기성 그람 음성 세균 종들(E nucleatum, P. nigrescens, R intermedia, A. actinomycetemcomitans)의 표준균주 유전체 DNA를 대상으로 PCR을 시행한 결과 S. mutans 균주들에서만 예상한 것과 같은 356 bp의 증폭물이 증폭 되었다(Fig. 3). 이때 최적의 결합 온도는 7OC였으며, 이보다 낮은 온도에서는 S.
- 본 연구에서 확립한 nested PCR법은 첫 번째 PCR에서 모든 세균 종으로부터 16S rDNA를 증폭할 수 있는 프라이머 쌍으로 증폭한 다음, S. mutans 종특이 프라이머 쌍으로 두 번째 PCR 을 시행하였고, 이 증폭물을 10배 희석해서 사용하였기 때문에 S. mutans 이외의 구강 내 많은 세균종의 검출에 다시 이용할 수 있어, 한번의 샘플링으로 치아우식증 뿐만 아니라 치주질환을 포함한 여러 구강 내 감염성질환의 원인균도 검출할 수 있는 장점이 있다.
- 3). 이때 최적의 결합 온도는 7OC였으며, 이보다 낮은 온도에서는 S. rattus에서 비 특이적 PCR 산물이 증폭되었다. 이러한 결과를 바탕으로, 본 연구에서 ChDC-SmF2와 ChDC- SmR2 프라이머 쌍을 이용한 PCR에서는 7이에서 시행하였다.
- constellatMS를 구별하기 위한 프라이머 쌍이다 (19). 즉, S. intermedins와 S. constellatus 두 세균 종은 연쇄상구균 속 중 anginosus 그룹에 속하고, 그들의 16S rDNA 염기서열이 99% 동일하여, 이로는 두 균종을 구별할 수가 없다. 하지만, S.
후속연구
- Sato 등(17, 18)의 연구에서는 16S rDNA 를 증폭한 첫 번째 PCR의 증폭반응물을 희석하지 않고 1 μl를 nested PCR에 주형으로 시용하였고, 35 cycles로 PCR을 시행한 점을 감안한다면, 본 연구에서 개발된 ChDC-SmF2와 ChDCSmR2 프라이머 쌍은 5. mutans의 검출에 있어서 특이도가 뛰어나고 민감도가 높게 이용될 수 있을 것으로 생각된다. 또한 치면 세균막 샘플을 이용한 S.
- mutans의 검출에 있어서 특이도가 뛰어나고 민감도가 높게 이용될 수 있을 것으로 생각된다. 또한 치면 세균막 샘플을 이용한 S. mutans 동정 결과도 세포 배양법에 의한 방법에서와도 동일한 결과(Table 3)를 보였기 때문에, 역학연구에 있어서 본 연구에서 개발된 프라이머 쌍이 유용하게 이용되리라 생각된다
- 그러므로, 본 연구는 Sato 등(16-18)의 것보다 민감도가 뛰어난 프라이머 쌍을 개발하고자 한다. 본 연구에서 개발된 프라이머 쌍은 치아우식증 과 S. mutans 간의 상관관계를 밝히는 역학 연구 및 병인론 연 구에 유용하게 사용할 수 있을 것으로 사료된다.
- 이상의 결과를 종합하면, 본 연구에서 개발된 ChDC-SmF2와 ChDC-SmR2 프라이머 쌍들은 S. mutans 균주를 종-특이적으로 동정 및 검출할 수 있고, 높은 민감도를 가지고 치면세균막에서 도 S. mutans 균주를 검출할 수 있어 치아우식증의 역학연구 및 병인론 연구에 유용하게 이용될 수 있을 것으로 생각된다.
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