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문제 정의
- 본 연구는 식물로부터 항균물질을 찾아내기 위한 연구의 일환 으로 우리나라에서 오래 동안 사용되어 인체에 큰 해가 없는 것으로 알려진 한약 재료 중의 하나인 백작약을 여러가지 용매로 추출하여 항균활성이 있는 추출물을 감염성 질환의 치료에 사용할 수 있게 함을 목표로 시행되었다.
제안 방법
- 3 mm)로 dichloromethane 추출물보다 낮았고 물 추출물은 항균활성이 없었다. S. aureus 표 준 균주에 대하여 dichloromethane 주줄물과 methanol 주줄물의 저지대는 각각 18 mm와 16 mm로 MRSA에 대한 항균활성과 비 슷하였다 (Table 1).
- 각 추출물들의 항균활성 보유여부를 검사하고 활성이 가장 높은 주출물을 silica gel column chromatography (직경 10 cm의 column에 Merck silica gel 60을 시료 100 ml 당 1 g 중진)와 thin layer chromatography (Merck glass TLC plate)를 이용하여 얻은 각 분획들의 항균활성을 검사한 다음 활성이 가장 높은 분 획의 MIC를 결정하였다. 분획을 용매로 희석한 희석액을 항균활 성 검사와 동일하게 디스크 확산법을 사용하여 MIC를 측정하였다.
- 26) 디스크에 가하고 음압에서 건조시켜 용매 를 제거한 디스크들을 사용하였다. 균들은 Mueller Hinton broth 에 부유하고 37℃ 배양기에 24시간 배양한 후 Mueller Hinton agar에 다시 배양한 다음 각 균의 집락을 하나씩 broth에 넣어 배양하고 농도를 McFarland nephelometer standard # 0.5에 맞준 균부유액 0.1 ml를 agar표면에 도말한 다음 디스크들을 올려놓고 37℃에서 18시간 방치한 후 형성된 성장억지대의 직경을 측정하였다.
- 백작약 분말 650 g을 teflon stopper가 부착된 separatory funnel 에 넣고 dichloromethane, methanol (DukSan, Korea), 물의 순서로 각각 2 리터의 용매를 넣어 추출하되, dichloromethane과 methanol을 넣은 것은 실온에서 24시간 방치하였고, 물 추출은 8(TC에서 2시간 동안 가온하여 추출하였다. 동일하게 2차 추출한 것을 합하여 각각 여과지로 여과한 다음 rotary evaporator를 사용하여 40℃에서 가온 감압 농축하였다.
- 최종 추출물들을 각각의 용매로 용해한 용액(20mg/ml)을 각각의 용매로 2배 계단 희석한 희석액 20ul를 직경 6mm의 여과 지(Advantec NO. 26) 디스크에 가하고 음압에서 건조시켜 용매 를 제거한 디스크들을 사용하였다. 균들은 Mueller Hinton broth 에 부유하고 37℃ 배양기에 24시간 배양한 후 Mueller Hinton agar에 다시 배양한 다음 각 균의 집락을 하나씩 broth에 넣어 배양하고 농도를 McFarland nephelometer standard # 0.
- 항균활성이 가장 높은 분획을 ethyl acetate:methanol (4:1)을 전개용매로 하여 극성이 낮은 쪽에서 높은 쪽으로 이행하면서 재분획한 결과 Rf치가 0.98(fraction-l), 0.5(fraction-2) 및 0.2 Action-3)인 분획을 얻었으며 각 분획과 3가지 분획을 합한 것 의 항균활성을 조사하였다.
대상 데이터
- MRSA의 배양에 Mueller Hinton agar (beef infusion 300 g, casamino acids 17.5 g, starch 1.5 g, agar 17 g, 증류수 1,000 ml) 와 broth를 사용하였고 균주는 2001년 고려대학교 안암병원에 입원한 환자와 외래 환자들에서 분리된 MRSA 중 10주와 황색 포도구균 표준균주(ATCC 65389)를 사용하였다. 항균활성검사는 디스크 확산법을 사용하였는데 그 이유는 추출물의 희석에 사용한 용매인 dichloromethane 과 methanol 이 그 자체 항균성이 있어 이반적인 방법인 tube dilution 방법이나 agar dilution 방법으로 할 수 없기 때문이었다
- 백작약은 서울시 제기동에 있는 약령시 내 한약재상(동명약재) 에서 구입하여 분쇄기로 분쇄하였다.
이론/모형
- 각 추출물들의 항균활성 보유여부를 검사하고 활성이 가장 높은 주출물을 silica gel column chromatography (직경 10 cm의 column에 Merck silica gel 60을 시료 100 ml 당 1 g 중진)와 thin layer chromatography (Merck glass TLC plate)를 이용하여 얻은 각 분획들의 항균활성을 검사한 다음 활성이 가장 높은 분 획의 MIC를 결정하였다. 분획을 용매로 희석한 희석액을 항균활 성 검사와 동일하게 디스크 확산법을 사용하여 MIC를 측정하였다.
성능/효과
- Dichloromethane 주줄물을 silica gel chromatography로 분획하여 얻은 3분획 중 항균활성이 있는 DCM-3 분획을 ethyl acetate : methanol (4:1)을 전개용매로 하여 극성이 낮은 쪽에서 높은 쪽 으로 이행하면서 재분획한 결과 Rf치가 O.98(fraction-1), 0.5 (fraction-2) 및 0.2(fraction-3)인 분획을 얻었는데 3분획 모두 단 독으로는 항균활성이 없었으나 3분획을 모두 혼합하면 항균활성을 나타내었는데 이러한 패턴은 식물추출물들의 특징으로 보인다. Fraction-1, 2, 3이 각각 단독으로는 항균활성이 없으나 혼합 하면 MRSA에 대하여 높은 항균활성을 내므로 우선적으로 외용 항균제로 사용할 수 있을 것이며 앞으로의 연구를 통하여 독성 여부와 전신 투여 가능성 여부가 규명된다면 새로운 항균제로서 사용될 가능성이 있다고 판단된다.
- 각 추출물의 MRSA에 대한 항균활성을 조사한 결과는 다음과 같았다. Dichloromethane 추출물은 MRSA 10주에 대하여 17-20 mm(평균 18.2 mm)의 성장 저지대를 보였고 methanol 주출물은 15-18 mm(평균 16.3 mm)로 dichloromethane 추출물보다 낮았고 물 추출물은 항균활성이 없었다. S.
- 백작약을 각각의 용매로 추출한 결과 dichloromethane 추출에 서는 2.3 g, methanol 추출에서는 3.1 g, 물추출에서는 4.1 g의 추 출물을 얻을 수 있었다. 각 추출물의 MRSA에 대한 항균활성을 조사한 결과는 다음과 같았다.
- 추출물 가운데 가장 높은 활성을 보인 dichloromethane 추출물 을 silica gel column chromatography로 분획하여 얻은 분획들 중에서 선택한 3개의 분획(DCM-1, 2, 3)의 활성을 검사한 결과 DCM-3 분획만이 항균활성이 있었다.(Table 2) 다시 이 DCM-3 분획의 MIC를 측정한 결과 MRSA에 대한 M1C는 50mg/ml 이 었다 (Table 3).
후속연구
- 2(fraction-3)인 분획을 얻었는데 3분획 모두 단 독으로는 항균활성이 없었으나 3분획을 모두 혼합하면 항균활성을 나타내었는데 이러한 패턴은 식물추출물들의 특징으로 보인다. Fraction-1, 2, 3이 각각 단독으로는 항균활성이 없으나 혼합 하면 MRSA에 대하여 높은 항균활성을 내므로 우선적으로 외용 항균제로 사용할 수 있을 것이며 앞으로의 연구를 통하여 독성 여부와 전신 투여 가능성 여부가 규명된다면 새로운 항균제로서 사용될 가능성이 있다고 판단된다.
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